Abstract
Human noroviruses zijn een belangrijke oorzaak van de epidemie en sporadische gastro-enteritis wereldwijd. Omdat de meeste infecties, hetzij rechtstreeks worden verspreid via de route van persoon tot persoon of indirect via het milieu oppervlakken of voedsel, besmet fomites en levenloze oppervlakken zijn belangrijke voertuigen voor de verspreiding van het virus tijdens het norovirus uitbraken.
We ontwikkeld en geëvalueerd een protocol met behulp van macroschuim swabs voor de detectie en typering van de menselijke norovirussen van harde oppervlakken. Vergeleken met vezel getipte swabs of antistatische doekjes, macroschuim swabs toestaan virus herstel (range 1,2-33,6%) van de wc-bril oppervlakken van maximaal 700 cm 2. Het protocol omvat stappen voor de extractie van het virus van de swabs en verdere concentratie van het virale RNA met behulp spinkolommen. In totaal zijn 127 (58,5%) van de 217 wattenstaafje monsters die waren verzameld van oppervlakken in cruiseschepen en langdurige zorg voorzieningen waar norovirus gastro-enteritis was geweestgerapporteerd testte positief voor GII norovirus door RT-qPCR. Van deze 29 (22,8%) met succes kon worden gegenotypeerd. Tot slot, detectie van norovirus op het milieu oppervlakken met behulp van het protocol ontwikkelden we kunnen helpen bij het bepalen van het niveau van milieuverontreiniging tijdens uitbraken alsmede opsporing van het virus wanneer klinische monsters niet beschikbaar zijn; het kan ook het toezicht op de effectiviteit van de sanering strategieën te vergemakkelijken.
Introduction
Human noroviruses zijn een belangrijke oorzaak van de epidemie en sporadische acute gastro-enteritis wereldwijd 1, 2, 3. Het virus is zeer besmettelijk en de transmissie gebeurt via direct van persoon tot persoon interactie of indirect door contact met besmet voedsel, water en milieu oppervlakken. Noroviruses kan worden afgestoten langdurig en verlengde overleving van het virus omgevingsoppervlakken is gedocumenteerd 1, 2, 3. Tijdens drukke verlies, miljarden virusdeeltjes vrijkomt per gram ontlasting en braaksel bevat ook een voldoende aantal virale deeltjes infectie 4, 5, 6, 7, 8 veroorzaken,ef "> 9, 10. Bovendien kan de overdracht van het virus tussen levenloze oppervlakken en menselijke huid gemakkelijk voordoen 2, 11, 12. Derhalve kunnen de controle van milieuverontreiniging helpen uitbraak onderzoeken en evalueren van de doelmatigheid van sanering en desinfectie procedures.
Milieubemonstering verschillende protocollen zijn beschreven voor de detectie van rotavirus, colifaag MS2, feline calicivirus (FCV), en bacteriofaag P22 13, 14, 15, 16. De in deze studies, waaronder snelle uitdroging (<1 uur) en de kleine oppervlakte beschreven valideringsomstandigheden (25 x 100 cm 2), mogelijk onvoldoende lokale instellingen vertegenwoordigen. Bovendien, de verwachte geringe besmetting met envinmental oppervlakken moeten protocollen die in staat zijn om heel weinig virusdeeltjes te detecteren zijn.
We ontwikkelden een-macroschuim gebaseerde oppervlak sampling methode voor de detectie en typering van norovirus. Deze methode is gevalideerd in meerdere norovirus uitbraken. Het protocol bevat 1) hoe staafje monsters van het milieu oppervlakken te verzamelen (2) hoe u het beste te onderhouden integriteit van de monsters tijdens het verzamelen en verzending naar het laboratorium, en 3) laboratorium testen en typering van norovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Swab Sampling in het veld
- Draag een schone paar handschoenen.
- Meten van de grootte van bemonsteringsplaats zonder het oppervlak met een meetlint of liniaal. Probeer om het gebied zo goed mogelijk te schatten en invullen van een meldingsformulier (aanvullende tabel 1).
- Controleer de swab-kit voor eventuele lekkages en het label monster transport tassen en swab kits.
- Verplaats het staafje over de bemonstering gebied als volgt: een slag in horizontale richting, een slag in verticale richting en een slag in een diagonale richting. Niet een oppervlakte die groter zijn dan 700 cm 2 zwabberen.
- Plaats elke zwabber in een buis en draai de dop goed.
2. Opslag en Transport van Swabs aan het Laboratorium
- Houd uitstrijkjes bij 4 ° C gedurende maximaal 48 uur. Als de opslag langer vereist is, slaan de doekjes bij -20 ° C (of -70 ° C).
- Houd de buizen bij 0-4 ° C (dwz. Gebruik koude kompressen) in een geïsoleerde container tijdens het transport naar het laboratorium en het schip binnen 24-48 uur van de collectie.
3. Virus Concentratie, virale RNA-extractie en zuivering
Opmerking: Alle centrifugatiestappen gebruiken een tafelblad centrifuge bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Wees extra voorzichtig bij het werken met de universele nucleïnezuur extractie (UNEX) buffer. Draag een veiligheidsbril of gezichtsbescherming.
- Label een 15 ml buis en één RNA Midi kolom voor elk monster. Neem een negatieve extractie controle in elk experiment.
- De Lysis oplossing bereiden 10 swabs, meng 25 ml UNEX buffer met 25 ml PBST (PBS pH 7,2 bevattende 0,02% Tween-80).
- Voeg 50 ul van colifaag MS2 suspensie (10 6 PFU / ul) aan 50 ml Lysis oplossing.
- Plaats een wattenstaafje in een 15 ml buis en voeg 5 ml Lysis oplossing. Meng en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5 ml 100% ethanol aan elke buis en vortex gedurende 10 s.
- Verwijder voorzichtig het staafje uit de 15 ml buis (het bevat UNEX buffer) zacht aan te drukken tegen de zijkant van de buis om overtollige vloeistof te verwijderen en dan gooi het staafje. Het resterende volume moet tussen 9-10 ml.
4. Midi Column viraal nucleïnezuur Extraction
- Breng zorgvuldig 4,5 ml UNEX / ethanol mengsel van stap 3.6 op een midi-kolom, centrifuge en gooi het filtraat.
- Plaats een andere 4,5 ml van dezelfde mengsel op dezelfde kolom, centrifuge, en gooi het filtraat.
- Voor de eerste wasbeurt, voeg 3,5 ml van 70% ethanol op de Midi kolom, centrifuge en gooi het filtraat.
- Voor de tweede wasbeurt, voeg nog eens 3,5 ml van 70% ethanol op de kolom Midi. Centrifuge en gooi het filtraat.
- Voor de droge-spin, centrifuge de Midi kolommen om alle sporen van ethanol (wat een negatieve invloed kan hebben op uw viraal RNA herstel) te verwijderen.
- Plaats de kolom Midi in een nieuwe 15 ml centrifugebuis. Voeg 250 ul elutiebuffer op de kolom Midi; wacht 1 min voor centrifugeren om de hoogste virale RNA terugwinning te verkrijgen.
- De uitgepakte nucleïnezuur bij -70 ° C of onmiddellijk overgaan naar stap 5.
5. Concentratie van viraal nucleïnezuur met behulp van RNA Schoon en Concentrator Kits
- Voeg 500 ul van RNA Binding Buffer 250 pl RNA geëlueerd in stap 4.7 hierboven en vortex gedurende 10 s.
- Voeg 750 ul 100% ethanol en vortex gedurende 10 s.
- Label een spin kolom voor elk monster. Laad de 750 pi monster op een spin-kolom.
- Centrifugeer de spinkolommen bij 12.000 xg gedurende 1 min. Gooi het doorstroomkanaal.
- Laad de resterende 750 pl op een spinkolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 min.
- Voor de voorwas, voeg 400 ul RNA Prep buffer elke spin kolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 min. Gooi het doorstroomkanaal.
- Voor de eerste wasbeurt, voeg 800 ul RNA Wash Buffer om elke spin kolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 minuut. Gooi het doorstroomkanaal.
- Voor de tweede wasbeurt, voeg 400 ul RNA Wash Buffer naar kolom en centrifuge draaien op 12.000 xg gedurende 1 minuut. Gooi het doorstroomkanaal.
- Voor de droge-spin centrifuge de spin kolom om alle sporen van wasbuffer verwijderen bij 12.000 xg gedurende 2 minuten.
- overdracht spinkolom goed naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 25 ul elutiebuffer naar de spinkolom en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Dit zal het herstel van de virale RNA te verhogen van de kolom.
- Verzamel RNA door centrifugeren van de spinkolom bij 10.000 xg gedurende 1 min.
- Hetzij direct doorgaan naar RT-qPCR (stap 6) of opslag RNA bij -70 ° C.
6. Mutiplex RT-qPCR detectie van genogroup I en II Norovirussen en colifaag MS 2 (aanvullende tabel 2)
- Schoon werken oppervlakken, pipettes en centrifuges met RNase decontaminatie oplossing om mogelijke verontreiniging te verminderen.
- Ontdooi RT-qPCR reagentia op het ijs. Dooi RNA op ijs (in een aparte ruimte / kamer).
- Bepaal het aantal reacties en voeg ten minste 10% meer daarvan (bijvoorbeeld als 10 reacties nodig zijn, maken master mix voor 11).
- Vortex afzonderlijke master mix componenten, met uitzondering van de 25x RT-qPCR enzym, gedurende 5 s. Zorgvuldig mengen van het enzym door de knop van de buis met een vinger.
- Kort centrifuge master mix componenten gedurende 5 s.
- Bereid de master mix voor realtime RT-PCR detectie van norovirus GI en GII volgens de kit instructies toevoegen norovirus-specifieke oligonucleotideprimers en probes in een 1,5 ml microcentrifugebuis (aanvullend tabel 3).
- Meng de master mix door pipetteren 5-10 keer op en neer (vortexen wordt niet aanbevolen). Aliquot 22 pi van de master mix in elk putje van real time PCR 96-well plaat.
- Vortex monster RNAvoor 5 sec, en het verzamelen van korte (5 s) centrifugeren.
- Voeg 3 ul van het monster RNA en GI en GII positieve controles voor de RT-qPCR plaat (volg sjabloon in tabel 2). Voeg 3 ul van nuclease-freewater in de niet-matrijs-control (NTC) wells.
- Verzegeling van de real-time plaat met optische zelfklevende film.
- centrifuge voorzichtig de real-time plaat bij 1300 xg gedurende 1 min om eventuele luchtbellen of vloeistofdruppels die in de putjes kunnen worden verwijderd.
- Het opzetten van een real-time PCR-instrument en de set-up van de volgende thermische cycli voorwaarden: 1) RT stap gedurende 10 min. bij 45 ° C (2) activering van Taq polymerase, 10 min. bij 95 ° C en (3) 45 cycli van 15 s bij 95 ° C en 60 s bij 60 ° C.
7. Kwantificering van Norovirus in Swabmonsters
- Controleer de resultaten van positieve en negatieve controles voor RT-qPCR resultaten (aanvullend tabel 3) bevestigen.
- Bepalen of elke standaard curve voldoet aan deacceptabele waarden in aanvullende tabel 2 en de berekening van de totale standaardafwijking voor de standaard curve met behulp van Vergelijking 1.
(Vergelijking 1)% rendement = 100 x 10 (gemiddelde Ct Values-Intercept) / Helling. - Als de PCR thermal cycler software niet de helling voor elke standaard curve heeft te berekenen, bepalen helling en R2-waarden door regressie met behulp van statistische software (bijvoorbeeld Excel, SPSS of SAS). Bereken bovendien de efficiëntie% voor standaard curves volgende vergelijking I
- Noteer het RNA kopienummer berekend door de thermische cycler software voor alle monsters gebaseerd op standaard curven die aan de in tabel 4 aanvullende criteria. Herhaald alle monsters met standaard krommen D at niet voldoen aan de criteria of vals-positieve controles. Controleer Ct waarden van colifaag MS2, die als een interne controle voor PCR remming volgen werd toegevoegd.
- Bepaal het aantal RNA-kopieën per monster, door het RNA kopienummer in stap 7,2, berekend door de verhouding van het volume (25-50 pi) totaal RNA elutiemiddel dat het RNA (3-5 ul) gebruikt voor de RT-qPCR reactie vermenigvuldigen. Als alternatief, het berekenen van de RNA dichtheid door het totale RNA aantal kopieën te delen door het oppervlak object gebied (cm2) geanalyseerd.
8. Genotypering van Real-time RT-PCR-positieve monsters door Hemi Geneste Conventionele PCR Amplification
- Bereid de eerste ronde van de master mix voor elke primer set van de RT-PCR-test (Aanvullende tabellen 2 en 5).
- Voeg 5 ul van norovirus positieve RNA tot 20 ul van master mix.
- Voer het RT-PCR onder de volgende voorwaarden: (1) RT stap gedurende 30 minuten bij 42 ° C (2) activering van Taq polymerase, 15 min bij 95 ° C, en (3) 40 cycli van 30 s bij 95 ° C , 30 s bij 50 ° C en 60 sec bij 72 ° C. Na 40 cycli, incubeer gedurende nog 10 min bij 72 ° C.
- Bereid de tweede ronde van mater mix voor elke primer set van de RT-PCR-test (Aanvullende tabellen 2 en 5).
- Voeg 23 ul master mix en voeg 2 ul van de eerste ronde RT-PCR-producten (van de eerste ronde) aan elke buis (idealiter de eerste ronde product moet worden verdund 1/10 in RNase-free water).
- Herhaal stap 8.3.
- Bereid een 2% agarosegel in 1 x 100 ml Tris-acetaat EDTA (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, en 1 mM EDTA, pH 8,3). Na agarose oplossen door het mengsel in de magnetron, voeg 10 pl nucleïnezuur vlek per 100 ml bereide gel na afkoelen van het mengsel tot 60-70 ° C, giet de gel en plaats de kammen. Laat de gel regelen ten minste 30 min.
- Mix 15 pi van elke RT-PCR product met 3 pi van 6x ladingskleurstof. Load 15 pi van elk monster en de Electrophorese agarosegel bij 100 V gedurende 1 uur.
- Accijnzen doel RT-PCR-fragmenten van geschikte grootte (330 bp voor GI en 341 bp voor GII) uit de gel eend RNA te zuiveren onder toepassing van een commercieel gelextractiekit. Het gezuiverde PCR-product kan nu worden gebruikt voor Sanger sequentiebepaling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een stroomdiagram van het staafje bemonsteringsprotocol. Dit protocol bestaat uit vier stappen; 1) monstername, 2) sample opslag en het transport, 3) viraal RNA zuivering en concentratie en 4) RT-qPCR assay en genotypering.
Figuur 1: Stroomdiagram van de definitieve protocol voor het milieu oppervlakte bemonstering van norovirus Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1 geeft een overzicht van de resultaten van 34 staafje monsters die werden verzameld van een cruiseschip dat tijdens een reis gevallen van vermoedelijke norovirus buikgriep had gemeld. Swabmonsters werden geëxtraheerd en tested in tweevoud voor norovirus door multiplex real-time RT-qPCR. Zeventien (18,5%) monsters testten positief, waaronder 8 monsters van oppervlakken in hutten, waar passagiers met norovirus symptomen op het schip was gebleven en 9 van de gemeenschappelijke ruimtes. Het aantal kopieën per genoom monster werden berekend uit de Ct-waarden (die varieerde 16-31) met een standaardcurve van een GII.7 norovirus RNA transcript. Het mediane aantal exemplaren van het genoom van swab samples in de hutten was 3,6 log 10 (bereik: 2,4-4,5 log 10 RNA kopieën), die aanzienlijk hoger is dan de exemplaren van het genoom van de gemeenschappelijke ruimtes (bereik: 1,2-2,1 log 10 exemplaren van het genoom) was ( P <0,001). Vier (23,5%) van de 17 positieve swabmonsters konden worden gegenotypeerd en alle monsters hadden identieke GII.1 sequenties.
| Locatie milieu-swap verzamelde | | Gemiddelde Ct-waarde (# positief van het totale aantal geteste monsters) | Genotype | Norovirus RNA aantal kopieën per bemonsterd gebied c | |
| Atrium | leuningen | 34,3 (1/2) | GII | 16 |
| Cabin A | Toiletbril | 31.4 (2/2) | GII. b | 31.217 |
| Cabin A | Kraan | 37,5 (1/2) | GII | 491 |
| Cabin A | Deurklink | 35,0 (2/2) | GII | 2675 |
| Cabin A | Afstandsbediening | 38,6 (2/2) | GII.1 b | 233 |
| Cabin B | Toiletbril | 33,5 (2/2) | GII.1 b | 986 | Ijsmachine | 34,2 (2/2) | GII | 16 |
| Lido | table Specerijen | 35,2 (1/2) | GII | 15 |
| Lido | Tafelblad | 35,3 (1/2) | GII | 14 |
| Pizzeria | Counter oppervlak | 35,7 (1/2) | GII | 14 |
| belangrijkste Galley | Fun-tijd Machine | 37,1 (1/2) | GII | 64 |
| Automaat | Touchable Surfaces | 38,8 (1/2) | GII | 18 |
| crew lounge | Toetsenbord en muis Surface | 36,8 (1/2) | GII | 80 |
| cabine C | Kraan en deurklink | 31,6 (2/2) | GII.1 b | 26.458 |
| cabine C | Telefoon | 36,4 (2/2) | GII | 1035 |
| cabine C | Toetsenbord | 33,0 (2/2) | GII | 1317 |
| Medisch Centrum | Clipboard | 36,0 (2/2) | GII | 113 |
| a Cabin A, heeft B en C zijn bezet door mensen die klinisch ziek was geweest met virale gastoenteristis symptomen. | ||||
| b Vier van de 17 GII-positieve swab samples kunnen worden gegenotypeerd. | ||||
| c RNA kopieën werden caluated op basis van een standaard curve van norovirus GII.7 RNA-transcripten. | ||||
| Opmerking: de bovenstaande datum waren enigszins gewijzigd ten opzichte van het oorspronkelijke artikel 6. | ||||
Tabel 1: Resultaten van 34 staafje monsters die werden verzameld van een cruiseschip dat tijdens een reis gevallen van vermoedelijke norovirus buikgriep had gemeld.
Figuur 2 toont de relatie tussen Ct waarden bepaald met RT-qPCR en de mogelijkheid om deze monsters sequentie. In totaal zijn 127 van de 217 swab geteste monsters positief voor GII norovirus door RT-qPCR. De monsters toonde een groot aantal (12-40) van Ct-waarden. In totaal konden 29 (22,8%) van de RT-qPCR positieve monsters worden gegenotypeerd. Swabmonsters met Ct-waarden van minder dan 27 en die ligt tussen 28-31 werd het genotype met een snelheid van 100% en 72,2% respectievelijk. Daarentegen, slechts 22,0% en 1,6% van swabmonsters met Ct-waarden van 32-36 en 37-40 respectievelijk geproduceerd hemi-nested amplicons die kon worden gesequenced.
Figuur 2: De resultaten van RT-qPCR screening en de opeenvolging van wattenstaafje monsters die waren verzameld tijdens bevestigd norovirus uitbraken. Witte balken geven het aantal RT-qPCR positieve swab samples virus. Human norovirus nucleïnezuren in die RT-qPCR positieve monsters werden versterkt met behulp van hemi geneste PCR-test en vervolgens de sequentie voor de bevestiging van genotypering. Zwarte balken en lijn geven het aantal en het percentage van het genotype bevestigd swab samples, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Ct-waarde range | Aantal RT-qPCR positieve monsters | Number (%) van de sequentie bevestigde monsters een |
| 20-23 | 4 | 3 (75) |
| 24-27 | 3 | 3 (100) |
| 28-31 | 18 | 13 (72,2) |
| 32-36 | 41 | 9 (22,0) |
| 37-40 | 61 | 1 (1,6) |
| a) hemi geneste PCR | ||
Tabel 2: RT-qPCR en genotypering resultaten van wattenstaafje monsters.
| sample Number | PLAATS | Beschrijving oppervlakte | Oppervlak (cm2) | Datum / tijd van monstername | Clean (J / N) | Als schoongemaakt, wat ontsmettingsmiddel werd gebruikt? </ Strong> | Gedetailleerde beschrijving van oppervlaktemateriaal en locatie |
| 1 | Room # 7-1302 | Toiletbril | 700 cm 2 | 2016/06/26; 09:00 | Nee | niet toepasbaar | Toiletbril [top oppervlakken), en hard plastoc |
| 2 | Room # 7-1330 | telefoon handvat | 500 cm 2 | 2016/06/26; 09:25 | Ja | 1000 ppm bleekmiddel | Hard plastic, rubber-toets |
Aanvullende Tabel 1: Voorbeeld van een sample omschrijving vorm.
| genogroup / virus | Naam oligonucleotide primer / probe | Sequence 5 → 3 & #900; | Referentie |
| GI | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | 17 |
| Cog1R | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C | 17 | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | 17 | |
| G1SKR | CCA ACC CAR CCA TTR TAC A | 17 | |
| Ring1E-probe | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ een | Deze studie | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | 17 | |
| Ring2-primer | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <td> 17||
| Ring2-probe | Cy5 of QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C | 18 | |
| Ms2p-probe | HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c | 18 | |
| een GI TaqMan probe is 5'- gelabeld met 6-carboxyfluoresceïne (FAM) en 3'-gelabeld met MGBNFQ (Minor-groef bindingsplaats) | |||
| b GII TaqMan sonde 5'-gelabeld met Cy5 of Quasar 670 en 3'-gelabeld met Black Hole onderdrukker; Black Hole Quencher (BHQ) 2 gebruikt vanwege de beschikbaarheid, BHQ 3 heeft de voorkeur. | |||
| c MS2 TaqMan sonde 5R17, gelabeld met HEX en 5'-gemerkt met BHQ1 | |||
Aanvullende Tabel 2: Oligonucleotide primers en probes informatie.
| bestanddeel | Volume per reactie (pl) | eindconcentratie |
| 2x RT-PCR Buffer * | 12.5 | 1x |
| Nuclease-vrij water * | 1.08 | n / a |
| Detectie Enhancer * | 1.67 | n / a |
| Cog 1F (10 M) | 1 | 400 nM |
| Cog 1R (10 M) | 1 | 400 nM |
| Ring 1E-sonde (10 uM) | 0.5 | 200 nM | 1 | 400 nM |
| Cog 2R (10 M) | 1 | 400 nM |
| Ring 2-probe (10 uM) | 0.5 | 200 nM |
| MS2F (10 uM) | 0.25 | 100 nM |
| MS2R (10 uM) | 0.25 | 100 nM |
| Ms2p-sonde (10 uM) | 0.25 | 100 nM |
| 2x RT-PCR enzym * | 1 | 1x |
| Master Mix volume | 22 | |
| * Opgenomen in de real-time RT-PCR kit | ||
Aanvullende Tabel 3: Master mix voor multiplex real-time GI / GII / MS2 norovirus RT-PCR
| Type regeling | resultaat interpretatie | ||
| Monster | negatieve controle | Moet negatief zijn | |
| Positieve controle | Moet positief zijn | ||
| negatief monster | Monster is negatief als elk Ct-waarde is niet op te sporen voor GI / GII | ||
| positief monster | Ct-waarden (GI / GII) van beide herhalingen is <38; dit (willekeurig) cut-off moet experimenteel worden bepaald voor elke real-time PCR-platform en kit | ||
| Voorlopig positief monster | De steekproef is voorlopig positief als Ct-waarde (GI / GII) van één repliceren is <38 | ||
| Interne procescontrole (MS2) | Monsters met een drempel cyclus (Ct) waarde van ≥32 fof MS2 moet onverdund worden opnieuw getest en 1/10 verdund. | ||
| Parameter | acceptabele waarde | ||
| Standard curve met behulp van norovirus RNA-transcripten | R 2 | > 0,97 | |
| doeltreffendheid | 90% tot 115% | ||
Aanvullende Tabel 4: De controles bij elke RT-qPCR test voor detectie van norovirus in swabmonsters milieu op te nemen.
| bestanddeel | eindconcentratie | vol / rxn (pl) |
| 5x RT-PCR buffer | 1x | 5.00 |
| dNTP mix (10 mM) 0,4 mM | 1.00 | |
| Enzyme mix (RT en Taq) | 1.00 | |
| Voorwaartse primer een | 0,5 uM | 0.50 |
| Reverse primer een | 0,5 uM | 0.50 |
| Rnase inhibitor (20 U / pl) | 20 U | 1.00 |
| RNase-free water | 11.00 | |
| Totale volume | 20.00 | |
| een voorwaartse en achterwaartse primer sets voor GI en GII groep Cog1F + G1SKR en Cog2F + G2SKR, respectievelijk. | ||
| Tweede ronde RT-PCR | ||
| bestanddeel | eindconcentratie | vol / rxn (pl) |
| 5x RT-PCR buffer < / Td> | 1x | 5.00 |
| dNTP mix (10 mM) | 0,4 mM | 1.00 |
| Enzyme mix (RT en Taq) | 1.00 | |
| Voorwaartse primer b | 0,5 uM | 0.50 |
| Reverse primer b | 0,5 uM | 0.50 |
| Rnase inhibitor (20 U / pl) | 20 U | 1.00 |
| RNase-free water | 14.00 | |
| Totale volume | 23.0 | |
| b voorwaartse en achterwaartse primer sets voor GI en GII groep G1SKF + G1SKR en Ring2 primer + G2SKR, respectievelijk. | ||
| Opmerking: de bovenstaande informaion werd enigszins gewijzigd ten opzichte van het oorspronkelijke artikel 19 | ||
| fase I | Field Sampling | 1. Controleer macroschuim wattenstaafje kits (bijvoorbeeld vervaldatum, buis lekkages en swab nattigheid) |
| 2. Swab oppervlak (limiet oppervlak tot ≤100 inch 2 (645 cm2)) | ||
| 3. Plaats swabs in de transportbuizen, en draai de doppen vast om lekkage te voorkomen tijdens het transport | ||
| 4. Plaats swab-kit in een ziplock-bag | ||
| fase II | Sample transport en opslag | 1. steekproef swabs worden bewaard -70 ° C (of -20 ° C) |
| 2. transporteren swabmonsters naar het laboratorium bij 0-4 ° C (koud-packs) in een geïsoleerde container en schip binnen 48 uur van het verzamelen swabs | ||
| fase III | RNA etraction | 1. Controleer lysisbuffer (bijv expiratie data) |
| 2. Voeg MS2 als een interne controle in lysis buffer voor het toevoegen van 100% ethanol | ||
| RNA-zuivering en concentratie | 3. Reinig labtafel en klein materiaal met behulp van RNA RNase verwijdering oplossing | |
| 4. handschoenen Verander regelmatig tijdens stappen om een RNA kruisbesmetting te voorkomen | ||
| fase IV | RT-PCR-test (QA / QC) | 1. Neem gekwantificeerd norovirus transcript RNA's (GI en GII) voor elke RT-qPCR test om te controleren voor variaties in de Ct-waarden voor elke PCR-run |
| 2.Gebruik afwezigheid van MS2 signaal aanwezigheid van PCR remmers volgen |
Aanvullende Tabel 6: Checklist voor het milieu bemonstering CDC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noroviruses een menselijke infectieuze dosis 50% tussen 18 en 10 3 20 virusdeeltjes. Daarom kan zelfs low-level vervuiling van oppervlakken een gevaar voor de volksgezondheid opleveren. Verschillende aspecten van het staafje bemonsteringsprotocol geëvalueerd waaronder: 1) verschillende swab materialen, 2) opslagpositie swabs tijdens transport, 3) viraal RNA-concentratie, en 4) colifaag MS2 extractie als interne controle.
Tot voor kort was alleen de prestaties van uitstrijkjes gemaakt van katoen, polyester, nylon en antistatische doek) beoordeeld en voor gebruik in het veld 13, 14, 15, 21, 22 voorgesteld. Hiervan zijn wattenstaafjes is aanbevolen door de ISO 15216-protocol voor de detectie van norovirus en hepatitis A-virus van voedselbereiding oppervlakken en fomites 23. Hoeooit, er zijn beperkte gegevens over het testen prestaties van wattenstaafjes onder veldomstandigheden met grote high-touch oppervlakken zoals deurknoppen, computers, en wc-brillen dat meermaals betrokken bij de overdracht van norovirussen 24, 25. Bovendien is de omvang van deze omgevingsoppervlakken -prijs vezel getipt doekjes. In deze studie hebben we aangetoond dat macroschuim swabs, die groter wattenstaafje kop dan de vezel-tip swabs hebben, een hogere terugwinning bekijken van menselijke norovirus bij bemonstering omgevingsoppervlakken met een oppervlak tot 700 cm2.
Noroviruses in oplossing relatief stabiel bij kamertemperatuur en ten minste koeling. Daarom moet de scheepvaart naar het laboratorium optreden bij 0-4 ° C binnen 48 uur na collectie van de swabs. De hoeveelheid monster die typisch kunnen worden getest in een PCR reactie is veel kleiner dan de hoeveelheidmonster na elutie uit het staafje (3-5 ul vs. 5-10 ml) die, zonder concentratie, vermindert de positiviteit tarief. In milieu virologie, is polyethyleenglycol (PEG) zijn met succes gebruikt om virussen concentreren van grote volumes water milieu. Echter, volumes tot 10 ml gemakkelijk worden geëxtraheerd en geconcentreerd middels Midi spinkolommen volumes zo laag als 250 pl, en verder 10-voudig geconcentreerd met behulp van hoge terugwinning spinkolommen.
Hoewel RT-qPCR is de gouden standaard voor gevoelige detectie en kwantificering van norovirus, kan de sensitiviteit van deze assays gemakkelijk worden beïnvloed door de aanwezigheid van PCR remmers die zijn co-geëxtraheerd uit het staafje monsters. Het meerekenen van een extractie controle zoals colifaag MS2 virusdeeltjes, in een multiplex PCR formaat dat zowel norovirus detecteert als MS2, helpt de aanwezigheid van PCR remming volgen en evalueren variatie tussen de verschillende experimenten. </ P>
De test variabelen van een laboratorium validatie methode zijn cruciaal voor de discriminerende kracht van een testmethode te bepalen en worden verder vertaald in waarschijnlijk bemonstering prestaties in het veld van de methode. Het nemen van de echte wereld veldconditie (bv vertraagde sampling, grotere oppervlakten van maximaal 700 cm2) in aanmerking genomen, de detectiegrens voor norovirus was 3,4 log 10 (roestvrij staal) en 4 log 10 (toiletbril) kopieën norovirus per oppervlakte de steekproef 6. Bijgevolg negatief uitstrijkje resultaten zijn niet definitief dat er geen virale besmetting is opgetreden. Klinische en epidemiologische gegevens van norovirus ziekte troeven altijd milieu bevindingen 2, 6.
Onze gegevens van een cruiseschip bleek dat high-touch oppervlakken zoals telefoons, computer keyboards, en de deur positief handvatten getest op norovirus in de hutten waar mensenmet gemeld virale gastro-enteritis was gebleven. Deze oppervlakken hetzij werden besmet door direct contact of indirect via druppeltjes die tijdens toiletspoeling of braken episodes 6, 7, 8, 9, 10.
Tot slot, detectie van norovirus op het milieu oppervlakken met behulp van deze nieuw ontwikkelde swab protocol kan helpen bij het bepalen van het niveau van milieuverontreiniging tijdens uitbraken, te detecteren virus wanneer klinische monsters niet beschikbaar zijn en de bewaking van de effectiviteit van het schoonmaken praktijken. Vezels propje (katoen en rayon) gebaseerde oppervlakte bemonsteringsmethoden zijn op grote schaal gebruikt om andere enterische virussen onderzoeken (bijvoorbeeld rotavirus en adenovirus) 27, 28, 29. Gezien de hogereherstelcapaciteit voor norovirus van macroschuim swabs over die vezels getipt swabs 6, we hadden verwacht dat de macroschuim swabs in staat om andere enterische virussen en sporen zal zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
- Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
- Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
- Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
- Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
- Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
- Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277 (2015).
- Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
- Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
- Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
- Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
- Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
- Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
- Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
- Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
- Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
- Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
- Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
- Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
- Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
- Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
- Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
- Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
- Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
- Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
- Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
- Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
- Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).
