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Immunology and Infection

पर सतहों मानव Norovirus की जांच के लिए स्वाब नमूने विधि

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55205
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

Abstract

मानव noroviruses महामारी और दुनिया भर में छिटपुट आंत्रशोथ का एक प्रमुख कारण हैं। क्योंकि सबसे अधिक संक्रमण या तो सीधे व्यक्ति से व्यक्ति के मार्ग के माध्यम से या परोक्ष रूप से पर्यावरण सतहों या भोजन के माध्यम से फैल रहे हैं, दूषित fomites और निर्जीव सतहों नोरोवायरस प्रकोप के दौरान वायरस के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण वाहनों रहे हैं।

हम विकसित किया है और एक प्रोटोकॉल का पता लगाने और कठोर सतहों से मानव noroviruses की टाइपिंग के लिए macrofoam swabs का उपयोग कर मूल्यांकन। फाइबर इत्तला दे दी swabs या antistatic पोंछे के साथ तुलना में, macrofoam के फाहे से अप करने के लिए 700 सेमी 2 के शौचालय की सीट सतहों वायरस वसूली (रेंज 1.2-33.6%) अनुमति देते हैं। प्रोटोकॉल के फाहे से वायरस की निकासी और वायरल शाही सेना स्पिन स्तंभों का उपयोग कर के आगे एकाग्रता के लिए कदम भी शामिल है। कुल में, 127 217 झाड़ू नमूने है कि क्रूज जहाजों और लंबे समय तक देखभाल सुविधाओं में सतहों जहां नोरोवायरस आंत्रशोथ किया गया था से एकत्र किया गया था (58.5%)RT-qPCR द्वारा जी आई आई नोरोवायरस के लिए सकारात्मक परीक्षण की सूचना दी। इन 29 (22.8%) का सफलतापूर्वक genotyped किया जा सकता है। अंत में, हम प्रोटोकॉल वायरस का पता लगाने के साथ ही प्रकोप के दौरान पर्यावरण प्रदूषण के स्तर को निर्धारित करने में सहायता कर सकते हैं जब नैदानिक ​​नमूने उपलब्ध नहीं हैं विकसित का उपयोग कर पर्यावरण सतहों पर नोरोवायरस का पता लगाने; यह भी remediation रणनीति के प्रभाव की निगरानी की सुविधा हो सकती है।

Introduction

मानव noroviruses महामारी और छिटपुट तीव्र आंत्रशोथ दुनिया भर में 1, 2, 3 के एक प्रमुख कारण हैं। वायरस बहुत संक्रामक है और ट्रांसमिशन व्यक्ति बातचीत करने के लिए या परोक्ष रूप से दूषित भोजन, पानी या पर्यावरण सतहों के साथ संपर्क के माध्यम से प्रत्यक्ष व्यक्ति के माध्यम से होता है। Noroviruses विस्तारित अवधि के लिए बहाया जा सकता है और लंबे समय तक पर्यावरण सतहों पर वायरस के जीवित रहने की 1, 2, 3 प्रलेखित किया गया है। शिखर बहा दौरान वायरस कणों के अरबों मल के ग्राम प्रति जारी कर रहे हैं, और उल्टी भी संक्रमण 4, 5, 6, 7, 8 पैदा करने के लिए वायरल कणों की एक पर्याप्त संख्या में मौजूद हैं,एफई "> 9, 10। इसके अलावा, निर्जीव सतहों और मानव त्वचा के बीच वायरस के हस्तांतरण आसानी से हो सकता है 2, 11, 12 है। इसलिए, पर्यावरण प्रदूषण की निगरानी प्रकोप जांच में सहायता के लिए और साफ-अप की प्रभावशीलता का आकलन करने में कर सकते हैं और कीटाणुशोधन प्रक्रियाओं।

कई पर्यावरणीय नमूने प्रोटोकॉल रोटावायरस का पता लगाने के लिए वर्णित किया गया है, coliphage MS2, बिल्ली के समान calicivirus (एफ सी वी), और जीवाणुभोजी P22 13, 14, 15, 16। हालांकि, मान्यता की स्थिति में तेजी से सुखाना (<1 घंटा) और छोटे सतह क्षेत्रों सहित इन अध्ययनों में वर्णित (25 x 100 सेमी 2), पर्याप्त रूप से क्षेत्र सेटिंग्स का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इसके अलावा, उम्मीद वातावरण के प्रदूषण का स्तर कमnmental सतहों प्रोटोकॉल है कि बहुत कुछ वायरस कणों का पता लगाने में सक्षम हैं की आवश्यकता होती है।

हम पता लगाने और नोरोवायरस की टाइपिंग के लिए एक macrofoam आधारित सतह नमूने विधि विकसित की है। इस विधि के कई नोरोवायरस प्रकोप के दौरान मान्य किया गया है। प्रोटोकॉल में शामिल हैं 1) कैसे पर्यावरण सतहों से झाड़ू नमूने एकत्र करने के लिए (2) कैसे सबसे अच्छा करने के लिए प्रयोगशाला संग्रह और शिपिंग के दौरान नमूनों की अखंडता को बनाए रखने के लिए, और 3) प्रयोगशाला परीक्षण और नोरोवायरस की टाइपिंग।

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Protocol

1. क्षेत्र में स्वाब नमूने

  1. दस्ताने की एक साफ जोड़ी पहनें।
  2. एक मापने टेप या शासक का उपयोग कर सतह को छूने के बिना नमूना क्षेत्र के आकार को मापने। सही रूप में संभव के रूप में क्षेत्र का अनुमान है और एक रिपोर्ट फार्म (पूरक तालिका 1) बाहर भरने के लिए प्रयास करें।
  3. संभव लीकेज और लेबल नमूना परिवहन बैग और झाड़ू किट झाड़ू किट की जाँच करें।
  4. क्षैतिज दिशा में एक स्ट्रोक, ऊर्ध्वाधर दिशा में एक ही झटके, और एक विकर्ण दिशा में एक स्ट्रोक: इस प्रकार के रूप नमूना क्षेत्र भर में झाड़ू ले जाएँ। एक सतह क्षेत्र 700 2 सेमी से भी बड़ा झाड़ू मत करो।
  5. प्रत्येक झाड़ू एक ट्यूब में रखें और सुरक्षित रूप से टोपी कस लें।

2. भंडारण और प्रयोगशाला के लिए Swabs का परिवहन

  1. अप करने के लिए 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर swabs रखें। लंबी अवधि के लिए भंडारण की आवश्यकता है, -20 डिग्री सेल्सियस पर swabs दुकान (या -70 डिग्री सेल्सियस)।
  2. 0-4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों रखें (यानी। , संग्रह की 24-48 घंटे के भीतर प्रयोगशाला और जहाज करने के लिए परिवहन के दौरान एक अछूता कंटेनर में ठंडा पैक का उपयोग करें)।

3. वायरस एकाग्रता, वायरल शाही सेना निष्कर्षण और शोधन

नोट: सभी centrifugation कदम एक तालिका के शीर्ष सेंट्रीफ्यूज, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 5000 XG पर उपयोग करें जब तक अन्यथा कहा। अतिरिक्त सावधान रहो, जब यूनिवर्सल न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण (UNEX) बफर के साथ काम कर रहे हैं। काले चश्मे या चेहरा शील्ड पहनें।

  1. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और प्रत्येक नमूना के लिए एक आरएनए मिडी स्तंभ लेबल। प्रत्येक प्रयोग में एक नकारात्मक निकासी नियंत्रण शामिल हैं।
  2. 10 swabs के लिए lysis समाधान तैयार करने के लिए, PBST के 25 एमएल के साथ UNEX बफर के 25 मिलीलीटर मिश्रण (पीबीएस पीएच 7.2 0.02% युक्त बीच 80)।
  3. Coliphage MS2 निलंबन (10 6 pfu / μl) के 50 μL lysis समाधान के 50 एमएल में जोड़े।
  4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक झाड़ू रखें और 5 मिलीलीटर lysis समाधान जोड़ें। मिक्स और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. 10 एस के लिए प्रत्येक ट्यूब और भंवर करने के लिए 5 मिलीलीटर 100% इथेनॉल जोड़ें।
  6. ध्यान से 15 एमएल ट्यूब से हटाने झाड़ू ट्यूब के पक्ष के खिलाफ धीरे इसे दबाने के अतिरिक्त तरल निकालने के लिए और फिर झाड़ू त्यागने (यह UNEX बफर शामिल हैं)। शेष मात्रा में 9-10 एमएल के बीच होना चाहिए।

4. मिडी कॉलम वायरल न्यूक्लिक एसिड निकासी

  1. ध्यान से एक मिडी स्तंभ, सेंट्रीफ्यूज पर कदम 3.6 से 4.5 एमएल UNEX / इथेनॉल मिश्रण हस्तांतरण और छानना त्यागें।
  2. उसी स्तंभ, सेंट्रीफ्यूज पर एक ही मिश्रण से एक और 4.5 एमएल लोड, और छानना त्यागें।
  3. पहली बार धोने के लिए, मिडी स्तंभ, सेंट्रीफ्यूज पर 70% इथेनॉल के 3.5 मिलीलीटर जोड़ने और छानना त्यागें।
  4. दूसरे धोने के लिए, मिडी स्तंभ पर 70% इथेनॉल का एक और 3.5 मिलीलीटर जोड़ें। अपकेंद्रित्र और छानना त्यागें।
  5. सूखी स्पिन के लिए, इथेनॉल के सभी निशान (जो नकारात्मक अपने वायरल शाही सेना वसूली प्रभावित कर सकते हैं) को हटाने के लिए मिडी कॉलम अपकेंद्रित्र।
  6. एक नया 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में मिडी स्तंभ रखें। मिडी स्तंभ पर 250 μl क्षालन बफर जोड़ें; उच्चतम वायरल शाही सेना वसूली प्राप्त करने के लिए centrifuging से पहले 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  7. -70 डिग्री सेल्सियस पर निकाले न्यूक्लिक एसिड स्टोर या तुरंत आगे बढ़ना चरण 5।

5. वायरल न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता आरएनए स्वच्छ और concentrator किट का उपयोग

  1. आरएनए 10 एस के लिए ऊपर चरण 4.7 और भंवर में eluted शाही सेना के 250 μL के लिए बाध्यकारी बफर के 500 μL जोड़ें।
  2. 10 एस के लिए 750 μL 100% इथेनॉल और भंवर जोड़ें।
  3. प्रत्येक नमूना के लिए एक स्पिन स्तंभ लेबल। एक स्पिन स्तंभ पर 750 μL नमूना लोड।
  4. 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर स्पिन स्तंभों अपकेंद्रित्र। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  5. 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर एक स्पिन स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज पर शेष 750 μL लोड।
  6. पूर्व धोने के लिए, 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर प्रत्येक स्पिन स्तंभ और अपकेंद्रित्र के लिए 400 μL आरएनए तैयारी बफर जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  7. पहली बार धोने के लिए, 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर प्रत्येक स्पिन स्तंभ और अपकेंद्रित्र के लिए 800 μL आरएनए धो बफर जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  8. दूसरे धोने के लिए, 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज स्पिन करने के लिए 400 μL आरएनए धो बफर जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  9. सूखी स्पिन के लिए, 2 मिनट के लिए 12,000 XG पर धो बफर के सभी निशान को दूर करने के लिए स्पिन स्तंभ अपकेंद्रित्र।
  10. ध्यान से एक साफ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्पिन स्तंभ हस्तांतरण।
  11. स्पिन स्तंभ पर 25 μL क्षालन बफर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं। यह कॉलम से वायरल शाही सेना की वसूली में वृद्धि होगी।
  12. 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर स्पिन स्तंभ centrifuging द्वारा शाही सेना लीजिए।
  13. या तो -70 डिग्री सेल्सियस पर RT-qPCR (चरण 6) या दुकान आरएनए के लिए सीधे आगे बढ़ना।

6. Genogroup मैं की Mutiplex RT-qPCR जांच, और द्वितीय noroviruses, और Coliphage एमएस 2 (पूरक तालिका 2)

  1. स्वच्छ काम सतहों, pipettes, और RNase परिशोधन समाधान के साथ सेंट्रीफ्यूज संभव प्रदूषण को कम करने के लिए।
  2. बर्फ पर पिघलना RT-qPCR अभिकर्मकों। बर्फ पर पिघलना आरएनए (एक अलग क्षेत्र / कमरे में)।
  3. प्रतिक्रियाओं की संख्या निर्धारित करते हैं और उनमें से कम से कम 10% और अधिक जोड़ने के लिए (जैसे कि अगर 10 प्रतिक्रियाओं की जरूरत है, 11 के लिए मास्टर मिश्रण बनाने के लिए)।
  4. भंवर व्यक्तिगत मास्टर मिश्रण घटकों, 25x RT-qPCR एंजाइम, 5 एस के लिए के लिए छोड़कर। ध्यान से एक उंगली के साथ ट्यूब flicking द्वारा एंजाइम मिश्रण।
  5. 5 एस के लिए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज मास्टर मिश्रण घटकों।
  6. किट निर्देशों के अनुसार नोरोवायरस सैनिक और जी आई आई के realtime आरटी पीसीआर का पता लगाने के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (पूरक तालिका 3) में नोरोवायरस विशिष्ट oligonucleotide प्राइमरों और जांच जोड़ें।
  7. 5-10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मास्टर मिश्रण मिक्स (vortexing अनुशंसित नहीं है)। अशेष 22 वास्तविक समय पीसीआर 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में मास्टर मिश्रण के μL।
  8. भंवर नमूना आरएनए5 सेकंड के लिए, और संक्षिप्त (5 एस) centrifugation इकट्ठा।
  9. नमूना शाही सेना और सैनिक और जी आई आई सकारात्मक नियंत्रण के 3 μL RT-qPCR प्लेट (2 टेबल से टेम्पलेट का पालन करें) में जोड़े। nuclease-Freewater के 3 μL कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) कुओं में जोड़ें।
  10. ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म के साथ वास्तविक समय प्लेट सील।
  11. ध्यान से 1300 XG पर वास्तविक समय थाली अपकेंद्रित्र 1 मिनट किसी भी हवाई बुलबुले या तरल बूंदों कि कुओं में मौजूद हो सकता है को दूर करने के लिए।
  12. 1) 10 मिनट के लिए आरटी कदम: एक वास्तविक समय पीसीआर साधन और निम्न thermocycling की स्थिति सेट अप सेट करें। पर 45 डिग्री सेल्सियस (2) Taq पोलीमर्स के सक्रियण, 10 मिनट। 95 डिग्री सेल्सियस और (3) 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस के 45 चक्र, और 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 एस।

स्वाब नमूने में Norovirus की मात्रा 7.

  1. मान्य करने के लिए RT-qPCR परिणाम (पूरक तालिका 3) सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के परिणामों की जाँच करें।
  2. निर्धारित बनाने के लिए प्रत्येक मानक वक्र को पूरा करती है कि क्यास्वीकार्य मूल्यों पूरक तालिका 2 में दिए गए और मानक वक्र 1 समीकरण प्रयोग करने के लिए समग्र मानक विचलन की गणना।
    (समीकरण 1)% दक्षता = 100 x 10 (औसत सीटी मूल्यों अवरोधन) / ढाल।
  3. पीसीआर थर्मल साइक्लर सॉफ्टवेयर प्रत्येक मानक वक्र के लिए ढलान की गणना नहीं करता है, तो ढलान और आर आंकड़ा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिगमन द्वारा 2 मूल्यों (जैसे एक्सेल, SPSS, या एसएएस) का निर्धारण। इसके अलावा, मैं समीकरण निम्न मानक घटता के लिए% दक्षता की गणना
  4. आरएनए प्रति सभी परीक्षण मानक घटता है कि मानदंड पूरक तालिका 4 में निर्दिष्ट सफर पर आधारित नमूने के लिए थर्मल साइक्लर सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की संख्या रिकार्ड। मानक घटता टी टोपी के साथ किसी भी नमूने फिर से दौड़ना मानदंडों को पूरा या झूठी सकारात्मक नियंत्रण नहीं है। coliphage MS2, जो पीसीआर निषेध पर नजर रखने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में जोड़ा गया है की सीटी मूल्यों की जाँच करें।
  5. आरएनए प्रतियां पी की कुल संख्या का निर्धारणआरएनए प्रतिलिपि आरएनए (3 से 5 μL करने के लिए) RT-qPCR प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल की है कि कुल शाही सेना eluent की मात्रा (25 से 50 μL) के अनुपात से कदम 7.2 में गणना की संख्या से गुणा करके एर नमूना। वैकल्पिक रूप से, वस्तु की सतह क्षेत्र (2 सेमी) का विश्लेषण द्वारा कुल शाही सेना की नकल संख्या से भाग दिया आरएनए घनत्व की गणना।

हेमी नेस्ट पारंपरिक पीसीआर प्रवर्धन द्वारा वास्तविक समय आरटी पीसीआर सकारात्मक नमूनों की 8. जीनोटाइपिंग

  1. आरटी पीसीआर परख के प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए मास्टर मिश्रण के पहले दौर तैयार (पूरक टेबल्स 2, और 5)।
  2. नोरोवायरस सकारात्मक शाही सेना के 5 μL मास्टर मिश्रण के 20 μL जोड़ें।
  3. निम्न शर्तों के तहत आरटी पीसीआर चलाने के लिए: (1) आर टी 95 डिग्री सेल्सियस पर कम से 42 डिग्री सेल्सियस (2) Taq पोलीमरेज़ की सक्रियता, 15 मिनट 30 मिनट के लिए कदम है, और (3) 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 40 चक्रों 50 डिग्री सेल्सियस पर 30, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड। 40 चक्रों के बाद 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. आरटी पीसीआर परख के प्रत्येक प्राइमर सेट (पूरक टेबल्स 2 और 5) के लिए मेटर मिश्रण के दूसरे दौर तैयार करें।
  5. 23 μL मास्टर मिश्रण जोड़ें और प्रत्येक ट्यूब (आदर्श पहले दौर उत्पाद RNase मुक्त पानी में 1/10 पतला होना चाहिए) से (पहले दौर से) पहले दौर आरटी पीसीआर उत्पादों के 2 μL जोड़ें।
  6. दोहराएँ कदम 8.3।
  7. 100 मिलीलीटर 1x Tris- एसीटेट EDTA में एक 2% agarose जेल (40 मिमी Tris, 20 मिमी एसिटिक एसिड, और 1 मिमी EDTA, पीएच 8.3 पर) तैयार करें। एक माइक्रोवेव ओवन में मिश्रण हीटिंग द्वारा agarose भंग करने के बाद, 60-70 डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रण को ठंडा करने के बाद प्रति तैयार जेल के 100 एमएल न्यूक्लिक एसिड दाग के 10 μL जोड़ने जेल डालो और कंघी डालें। जेल में कम से कम 30 मिनट के लिए तय है।
  8. 6x लोडिंग डाई के 3 μL के साथ प्रत्येक आरटी पीसीआर उत्पाद के 15 μl मिक्स। लोड प्रत्येक नमूने की 15 μL और 1 घंटे के लिए 100 वी पर agarose जेल Electrophorese।
  9. जेल एक से उचित आकार (सैनिक के लिए 330 बीपी और जी आई आई के लिए 341 बीपी) के आबकारी लक्ष्य आरटी पीसीआर टुकड़ेशाही सेना शुद्ध डी एक वाणिज्यिक जेल निकालना किट का उपयोग। शुद्ध पीसीआर उत्पाद अब सेंगर अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

चित्रा 1 झाड़ू नमूने प्रोटोकॉल का एक फ़्लोचार्ट प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल चार मुख्य चरण के होते हैं; 1) नमूना संग्रह, 2) नमूना भंडारण और परिवहन, 3) वायरल शाही सेना शुद्धि और एकाग्रता और 4) RT-qPCR परख और जीनोटाइपिंग।

आकृति 1
चित्रा 1: नोरोवायरस के पर्यावरण सतह नमूना लेने के लिए अंतिम प्रोटोकॉल फ्लो चार्ट यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1 34 झाड़ू नमूने है कि एक क्रूज जहाज है कि एक यात्रा के दौरान संदिग्ध नोरोवायरस आंत्रशोथ के मामलों की सूचना दी थी से एकत्र किए गए परिणामों से सार। स्वाब के नमूने निकाले और ते थेमल्टीप्लेक्स वास्तविक समय RT-qPCR द्वारा नोरोवायरस के लिए दो प्रतियों में sted। सत्रह (18.5%) नमूने केबिनों में सतहों जहां नोरोवायरस लक्षणों के साथ यात्रियों को जहाज पर रोक लगा दी थी और 9 सामान्य क्षेत्रों से 8 नमूने सहित सकारात्मक परीक्षण किया। नमूना प्रति जीनोमिक प्रतियों की संख्या सीटी मूल्यों (जो 16 से 31 तक बताया गया है) एक नोरोवायरस GII.7 शाही सेना प्रतिलेख का एक मानक वक्र का उपयोग करने से गणना की गई। (: - 4.5 लॉग 10 आरएनए प्रतियां 2.4 रेंज) है, जो आम क्षेत्रों (रेंज: 1.2 - 2.1 लॉग 10 जीनोम प्रतियां) से जीनोम प्रतियां की तुलना में काफी अधिक था (मंझला केबिनों में झाड़ू नमूनों से जीनोम प्रतियों की संख्या 3.6 लॉग 10 साल का था पी <0.001)। चार (23.5%) 17 सकारात्मक झाड़ू नमूनों की genotyped जा करने में सक्षम थे, और सभी नमूनों समान GII.1 दृश्यों था।

लीडो
स्थान पर्यावरण स्वैप एकत्र एक औसत सीटी मूल्य (# नमूनों का परीक्षण की कुल संख्या के सकारात्मक) जीनोटाइप नोरोवायरस आरएनए प्रति नमूना क्षेत्र ग नंबर कॉपी
एट्रियम handrails 34.3 (1/2) जी आई आई 16
केबिन एक शौचालय की सीट 31.4 (2/2) जी आई आई। बी 31,217
केबिन एक नल 37.5 (1/2) जी आई आई 491
केबिन एक दरवाजे का हैंडल 35.0 (2/2) जी आई आई 2675
केबिन एक रिमोट कंट्रोल 38.6 (2/2) GII.1 ख 233
केबिन बी शौचालय की सीट 33.5 (2/2) GII.1 ख 986
आइसक्रीम यंत्र 34.2 (2/2) जी आई आई 16
लीडो टेबल मसालों 35.2 (1/2) जी आई आई 15
लीडो मेज का ऊपरी हिस्सा 35.3 (1/2) जी आई आई 14
पिज़्ज़ेरिया काउंटर सतह 35.7 (1/2) जी आई आई 14
मुख्य गैली मज़ा-बार मशीन 37.1 (1/2) जी आई आई 64
व्यापारिक मशीन सकनेवाला सतहों 38.8 (1/2) जी आई आई 18
क्रू लाउंज कीबोर्ड और माउस भूतल 36.8 (1/2) जी आई आई 80
केबिन सी नल और दरवाज़े के हैंडल 31.6 (2/2) GII.1 ख 26,458
केबिन सी टेलीफोन 36.4 (2/2) जी आई आई 1,035
केबिन सी कीबोर्ड 33.0 (2/2) जी आई आई 1,317
चिकित्सा केंद्र क्लिपबोर्ड 36.0 (2/2) जी आई आई 113
एक केबिन ए, बी और सी व्यक्तियों, जो वायरल gastoenteristis लक्षणों के साथ चिकित्सकीय बीमार हो गया था द्वारा कब्जा कर लिया गया है।
बी 17 जी आई आई पॉजिटिव झाड़ू नमूने के चार genotyped किया जा सकता है।
ग आरएनए प्रतियां नोरोवायरस GII.7 शाही सेना टेप का एक मानक वक्र पर आधारित caluated थे।
नोट: तिथि से थोड़ा ऊपर मूल लेख 6 से संशोधित किया गया है।

तालिका 1: 34 झाड़ू नमूने है कि एक क्रूज जहाज है कि एक यात्रा के दौरान संदिग्ध नोरोवायरस आंत्रशोथ के मामलों की सूचना दी थी से एकत्र किए गए परिणाम से।

चित्रा 2 RT-qPCR और इन नमूनों अनुक्रम करने की क्षमता से निर्धारित सीटी मूल्यों के संबंध को दर्शाता है। कुल में, 217 से बाहर 127 झाड़ू नमूने RT-qPCR द्वारा जी आई आई नोरोवायरस के लिए सकारात्मक का परीक्षण किया। नमूने सीटी मूल्यों की एक विस्तृत रेंज (12-40) का प्रदर्शन किया। कुल में, 29 (22.8%) RT-qPCR सकारात्मक नमूनों की genotyped किया जा सकता है। 27 के नीचे और 28-31 के बीच लेकर सीटी मूल्यों के साथ स्वाब के नमूने क्रमश: 100% और 72.2% की दर पर genotyped थे। इसके विपरीत, केवल 22.0% और 32-36 और 37-40 की सीटी मूल्यों के साथ झाड़ू नमूनों की 1.6%, क्रमशः, उत्पादन अर्ध-नेस्ट amplicons कि सफलतापूर्वक अनुक्रम किया जा सकता है।


चित्रा 2: RT-qPCR स्क्रीनिंग और झाड़ू के नमूनों की अनुक्रमण कि इस बात की पुष्टि नोरोवायरस प्रकोप के दौरान एकत्र किया गया था के परिणाम। सफेद सलाखों RT-qPCR सकारात्मक झाड़ू नमूने वायरस की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। उन RT-qPCR सकारात्मक नमूनों में मानव नोरोवायरस न्यूक्लिक एसिड अर्ध-नेस्ट पीसीआर परख का उपयोग परिलक्षित और फिर जीनोटाइपिंग की पुष्टि के लिए अनुक्रम थे। काले सलाखों और लाइन नंबर और जीनोटाइप का प्रतिशत क्रमश: झाड़ू नमूनों की पुष्टि की, प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सीटी मूल्य रेंज RT-qPCR सकारात्मक नमूनों की संख्या अनुक्रम की पुष्टि की नमूनों की संख्या (%) एक
20-23 4 3 (75)
24-27 3 3 (100)
28-31 18 13 (72.2)
32-36 41 9 (22.0)
37-40 61 1 (1.6)
क) हेमी पीसीआर नेस्ट

तालिका 2: RT-qPCR और झाड़ू के नमूनों की जीनोटाइपिंग का परिणाम है।

नमूने की संख्या स्थान सतह का विवरण सतह क्षेत्र (2 सेमी) दिनांक / नमूना संग्रह के समय स्वच्छ (हाँ / नहीं) तो साफ है, क्या कीटाणुनाशक का इस्तेमाल किया गया था? </ Strong> सतह सामग्री और स्थान का विस्तृत विवरण
1 कक्ष # 7-1302 शौचालय की सीट 700 सेमी 2 2016/06/26; सुबह के 9 बजे नहीं लागू नहीं शौचालय की सीट [शीर्ष सतहों), और कठिन plastoc
2 कक्ष # 7-1330 टेलीफोन संभाल 500 सेमी 2 2016/06/26; 9:25 AM हाँ 1,000 पीपीएम ब्लीच हार्ड प्लास्टिक, रबर बटन

पूरक तालिका 1: नमूना विवरण प्रपत्र का उदाहरण है।

<टीडी> 17
genogroup / वायरस नाम oligonucleotide प्राइमर / जांच अनुक्रम 5 → 3 & #900; संदर्भ
सैनिक Cog1F CGY TGG ATG सीजीआई TTY कैट जीए 17
Cog1R सीटीटी आगा CGC कैट कैट कैट TYA सी 17
G1SKF CTG सीसीसी GAA TTY जीटीए AAT जीए 17
G1SKR सीसीए एसीसी कार सीसीए TTR टीएसी एक 17
Ring1E जांच परिवार - TGG एसीए GGR समलैंगिक CGC - MGBNFQ एक ये पढाई
जी आई आई Cog2F कार GAR बीसीएन ATG TTY एजीआर TGG ATG एजी 17
Cog2R टीसीजी ACG सीसीए TCT टीसीए टीटीसी एसीए 17
Ring2-प्राइमर TGG भूमिकाः जीजीसी GAT CGC AAT सीटी 17
G2SKR सीसीआर CCN जीसीए TRH सीसीआर TTR टीएसी एटी
Ring2 जांच Cy5 या कैसर 670 - TGG भूमिकाः जीजीसी GAT CGC AAT सीटी - BHQ2 ख 17
MS2 MS2F TGG सीएसी टीएसी सीसीसी TCT CCG जैसे टीसीए तटरक्षक 18
MS2R जीटीए CGG GCG एसीसी सीसीए सीजीए TGA सी 18
MS2P जांच हेक्स - सीएसी एटीसी GAT आगा टीसीए AGG टी जी सी सीटीए CAAGC - BHQ1 ग 18
एक सैनिक TaqMan जांच 6-Carboxyfluorescein (परिवार) और 3'-लेबल MGBNFQ (माइनर नाली बाध्यकारी साइट) के साथ साथ 5'-लेबल है
बी जी आई आई TaqMan जांच Cy5 या कैसर 670 और साथ 5'-लेबल है 3'-लेबल ब्लैक होल पीने की वस्तु के साथ; ब्लैक होल पीने की वस्तु (BHQ) 2 उपलब्धता की वजह से इस्तेमाल किया, BHQ 3 पसंद किया जाता है।
ग MS2 TaqMan जांच 5R है17; साथ -labeled हेक्स और BHQ1 साथ 5'-लेबल

पूरक तालिका 2: Oligonucleotide प्राइमरों और जांच के बारे में जानकारी।

दांता 2 एफ (10 माइक्रोन) के
अंग प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) अंतिम एकाग्रता
2x आरटी पीसीआर बफर * 12.5 1x
Nuclease मुक्त पानी * 1.08 N / A
डिटेक्शन बढ़ाने * 1.67 N / A
दांता 1F (10 माइक्रोन) के 1 400 एनएम
दांता 1R (10 माइक्रोन) के 1 400 एनएम
रिंग 1E-जांच (10 माइक्रोन) के 0.5 200 एनएम
1 400 एनएम
दांता 2R (10 माइक्रोन) के 1 400 एनएम
अंगूठी 2-जांच (10 माइक्रोन) के 0.5 200 एनएम
MS2F (10 माइक्रोन) के 0.25 100 एनएम
MS2R (10 माइक्रोन) के 0.25 100 एनएम
MS2P जांच (10 माइक्रोन) के 0.25 100 एनएम
2x आरटी पीसीआर एंजाइम * 1 1x
मास्टर मिश्रण की मात्रा 22
* वास्तविक समय आरटी पीसीआर किट में शामिल

पूरक तालिका 3: मल्टीप्लेक्स वास्तविक समय सैनिक / जी आई आई / MS2 नोरोवायरस आरटी पीसीआर के लिए मास्टर मिश्रण

नियंत्रण के प्रकार परिणाम व्याख्या
नमूना नकारात्मक नियंत्रण नकारात्मक होना चाहिए
सकारात्मक नियंत्रण सकारात्मक होना चाहिए
नकारात्मक नमूना नमूना नकारात्मक है, तो प्रत्येक सीटी मूल्य सैनिक / जी आई आई के लिए undetectable है
सकारात्मक नमूना सीटी मूल्यों दोनों प्रतिकृति की (सैनिक / जी आई आई) <38 है; इस (मनमाने ढंग से) कट ऑफ प्रत्येक realtime पीसीआर मंच और किट के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित करने की जरूरत है
अंतरिम सकारात्मक नमूना नमूना अंतरिम रूप से सकारात्मक अगर एक दोहराने की सीटी मूल्य (सैनिक / जी आई आई) है <38
आंतरिक प्रक्रिया नियंत्रण (MS2) एक सीमा के चक्र के साथ नमूने (सीटी) ≥32 च के मूल्यया MS2 undiluted पुनर्परीक्षण किया जाना चाहिए और 1/10 पतला।
पैरामीटर स्वीकार्य मूल्य
मानक वक्र नोरोवायरस शाही सेना टेप का उपयोग कर आर 2 > 0.97
दक्षता 115% से 90%

पूरक तालिका 4: पर्यावरण झाड़ू नमूनों में नोरोवायरस का पता लगाने के लिए प्रत्येक RT-qPCR परीक्षा में शामिल करने के लिए नियंत्रित करता है।

अंग अंतिम एकाग्रता खंड / rxn (μl)
5x आरटी पीसीआर बफर 1x 5.00
dNTP मिश्रण (10 मिमी) 0.4 मिमी 1.00
एंजाइम मिश्रण (आरटी और Taq) 1.00
आगे प्राइमर एक 0.5 माइक्रोन के 0.50
रिवर्स प्राइमर एक 0.5 माइक्रोन के 0.50
RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / μl) 20 यू 1.00
RNase मुक्त पानी 11.00
कुल मात्रा 20.00
एक आगे और सैनिक और जी आई आई समूह के लिए प्राइमर सेट रिवर्स Cog1F + G1SKR, और Cog2F + G2SKR, क्रमशः रहे हैं।
दूसरा दौर आरटी पीसीआर
अंग अंतिम एकाग्रता खंड / rxn (μl)
5x आरटी पीसीआर बफर < / Td> 1x 5.00
dNTP मिश्रण (10 मिमी) 0.4 मिमी 1.00
एंजाइम मिश्रण (आरटी और Taq) 1.00
आगे प्राइमर ख 0.5 माइक्रोन के 0.50
रिवर्स प्राइमर ख 0.5 माइक्रोन के 0.50
RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / μl) 20 यू 1.00
RNase मुक्त पानी 14.00
कुल मात्रा 23.0
आगे ख और सैनिक और जी आई आई समूह के लिए प्राइमर सेट रिवर्स G1SKF + G1SKR, और Ring2 प्राइमर + G2SKR, क्रमशः रहे हैं।
नोट: informaion से थोड़ा ऊपर मूल अनुच्छेद 19 से संशोधित किया गया था
_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> पूरक तालिका 5: हेमी-नेस्ट आरटी पीसीआर मास्टर मिश्रण।

चरण 1 फील्ड सैम्पलिंग 1. चेक macrofoam झाड़ू किट (जैसे, समाप्ति तिथि, ट्यूब लीकेज, और झाड़ू नमी)
2. झाड़ू सतह (सीमा सतह क्षेत्र ≤100 इंच 2 (645 सेमी 2) करने के लिए)
3. प्लेस परिवहन ट्यूबों में swabs, और सुरक्षित रूप से टोपियां कसने शिपिंग के दौरान लीक को रोकने के लिए
एक ziplock बैग में 4. जहाँ झाड़ू किट
फेस II नमूना परिवहन और भंडारण 1. नमूना swabs संग्रहित किया जाना चाहिए -70 डिग्री सेल्सियस (या -20 डिग्री सेल्सियस)
2. परिवहन झाड़ूइकट्ठा करने के फाहे के 48 घंटे के भीतर एक अछूता कंटेनर और जहाज में 0-4 डिग्री सेल्सियस (ठंडे-पैक) पर प्रयोगशाला के लिए नमूने
तीसरे चरण आरएनए etraction 1. चेक lysis बफर (जैसे, समाप्ति डेटा)
2. lysis बफर में एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में MS2 मे 100% इथेनॉल जोड़ने से पहले
आरएनए शुद्धि और एकाग्रता 3. साफ प्रयोगशाला बेंच और छोटे उपकरण आरएनए RNase हटाने समाधान का उपयोग
4. दस्ताने एक आरएनए पार संक्रमण से बचने के लिए अक्सर चरणों के दौरान बदलें
चतुर्थ चरण आरटी पीसीआर परख (क्यूए / क्यूसी) 1. प्रत्येक RT-qPCR परख के लिए मात्रा निर्धारित नोरोवायरस प्रतिलेख आरएनए (सैनिक और जी आई आई) शामिल प्रत्येक पीसीआर रन के लिए सीटी मूल्यों में बदलाव के लिए नियंत्रित करने के लिए
2।पीसीआर अवरोधकों की उपस्थिति पर नजर रखने के MS2 संकेत के अभाव का प्रयोग करें

पूरक तालिका 6: सीडीसी के पर्यावरण नमूना प्रक्रिया के लिए चेकलिस्ट।

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Discussion

Noroviruses 18 और 10 3 वायरस कणों 20 के बीच एक 50% मानव संक्रामक खुराक है। इसलिए, भले सतहों के निम्न स्तर के प्रदूषण को एक सार्वजनिक स्वास्थ्य जोखिम पैदा कर सकता है। 1) विभिन्न झाड़ू सामग्री, 2) परिवहन के दौरान भंडारण हालत swabs, 3) वायरल शाही सेना एकाग्रता, और 4) coliphage MS2 आंतरिक निकासी नियंत्रण के रूप में: झाड़ू नमूने प्रोटोकॉल के कई पहलुओं सहित मूल्यांकन किया गया।

अभी हाल तक, केवल कपास, पॉलिएस्टर, नायलॉन और antistatic पोंछ) से बने swabs के प्रदर्शन का मूल्यांकन किया और क्षेत्र में उपयोग के 13, 14, 15, 21, 22 के लिए प्रस्तावित किया गया था। इनमें से कपास swabs नोरोवायरस और हेपेटाइटिस भोजन तैयार सतहों और fomites 23 से एक वायरस का पता लगाने के लिए आईएसओ 15216 प्रोटोकॉल द्वारा सिफारिश की गई है। किस तरहकभी, वहाँ इस तरह doorknobs, कंप्यूटर, और टॉयलेट सीट के रूप में बड़े उच्च स्पर्श सतहों है कि अक्सर noroviruses 24, 25 के प्रसारण में फंसाया गया साथ क्षेत्र की स्थिति के तहत कपास swabs के परीक्षण के प्रदर्शन पर सीमित डेटा रहे हैं। इसके अतिरिक्त, इन पर्यावरणीय सतहों के आकार फाइबर इत्तला दे दी swabs की क्षमता अधिक है। हमारे अध्ययन में, हम दिखा दिया कि macrofoam swabs, जो फाइबर की नोक के फाहे से एक बड़ा झाड़ू सिर है, मानव नोरोवायरस के लिए उच्च वसूली दर है जब 700 सेमी 2 अप करने के लिए एक क्षेत्र के साथ पर्यावरण सतहों के नमूने।

समाधान में noroviruses परिवेश के तापमान पर अपेक्षाकृत अस्थिर कर रहे हैं और कम से कम प्रशीतन में आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रयोगशाला के लिए शिपिंग swabs के संग्रह के बाद 48 घंटे के भीतर 0-4 डिग्री सेल्सियस पर हो जाना चाहिए। नमूने की मात्रा है कि आम तौर पर एक पीसीआर प्रतिक्रिया में परीक्षण किया जा सकता है की राशि की तुलना में काफी छोटा होता हैनमूना झाड़ू (3-5 μL बनाम 5-10 एमएल) है, जो एकाग्रता के बिना, काफी सकारात्मकता दर कम कर देता से क्षालन के बाद। पर्यावरण विषाणु विज्ञान में, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है पर्यावरण के पानी की बड़ी मात्रा से वायरस ध्यान केंद्रित करने की। हालांकि, 10 एमएल मात्रा में आसानी से निकाला जा सकता है और के रूप में 250 μL के रूप में कम मात्रा में करने के लिए मिडी स्पिन स्तंभों का उपयोग ध्यान केंद्रित किया है, और आगे स्पिन स्तंभों उच्च वसूली का उपयोग के साथ 10 गुना ध्यान केंद्रित किया।

हालांकि RT-qPCR संवेदनशील पता लगाने और नोरोवायरस की मात्रा का ठहराव के लिए स्वर्ण मानक है, इन assays की संवेदनशीलता को आसानी से पीसीआर अवरोधकों की उपस्थिति है कि झाड़ू नमूने से सह-निकाले जाते हैं से प्रभावित हो सकते हैं। इसलिए, इस तरह coliphage MS2 वायरस कणों के रूप में एक निकासी नियंत्रण, एक मल्टीप्लेक्स पीसीआर स्वरूप है कि दोनों नोरोवायरस के रूप में अच्छी तरह से पता लगाता है MS2 के रूप में शामिल किए जाने की पीसीआर निषेध की उपस्थिति पर नजर रखने के लिए और विभिन्न प्रयोगों के बीच भिन्नता का आकलन करने में मदद करता है। </ P>

एक प्रयोगशाला सत्यापन विधि का परीक्षण चर एक परीक्षण विधि की भेदभावपूर्ण शक्ति निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और आगे की विधि की संभावना क्षेत्र नमूना प्रदर्शन में अनुवाद कर रहे हैं। वास्तविक दुनिया क्षेत्र हालत उठाते हुए (जैसे, देरी नमूने, अप करने के लिए 700 सेमी 2 के बड़े सतह क्षेत्रों) खाते में, नोरोवायरस के लिए पता लगाने सीमा 3.4 लॉग 10 (स्टेनलेस स्टील) और 4 लॉग 10 (टॉयलेट सीट) सतह प्रति प्रतियां नोरोवायरस नमूना था 6। नतीजतन, नकारात्मक झाड़ू परिणाम निश्चित है कि कोई वायरल संदूषण हुआ है नहीं कर रहे हैं। नोरोवायरस बीमारी के नैदानिक और महामारी जानकारी हमेशा पर्यावरण निष्कर्षों trumps 2, 6।

एक क्रूज जहाज से हमारे आंकड़ों से पता चला है कि इस तरह के टेलीफोन, कंप्यूटर कीबोर्ड, और दरवाजे के रूप में उच्च स्पर्श सतहों केबिनों में जहां लोगों में नोरोवायरस के लिए पॉजिटिव पाए संभालतीसाथ सूचना वायरल आंत्रशोथ रोक लगा दी थी। इन सतहों या तो शौच या उल्टी एपिसोड 6, 7, 8, 9, 10 के दौरान उत्पादन बूंदों के माध्यम से सीधे संपर्क के माध्यम से दूषित या परोक्ष रूप से बन गया।

अंत में, पर्यावरण सतहों इस नव विकसित झाड़ू प्रोटोकॉल का उपयोग प्रकोप के दौरान पर्यावरण प्रदूषण के स्तर को निर्धारित करने में सहायता कर सकते हैं पर नोरोवायरस का पता लगाने, वायरस का पता लगाने के लिए जब नैदानिक ​​नमूने उपलब्ध है और सफाई प्रथाओं की प्रभावशीलता की निगरानी में नहीं हैं। फाइबर इत्तला दे दी झाड़ू (कपास और रेयान) आधारित सतह के नमूने तरीकों व्यापक रूप से अन्य आंतों का वायरस की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (जैसे रोटावायरस, और adenovirus), 27, 28, 29। उच्च ध्यान में रखते हुएउन फाइबर पर macrofoam swabs के नोरोवायरस के लिए वसूली दक्षता के फाहे 6 इत्तला दे दी है, हम उम्मीद है कि macrofoam swabs के रूप में अच्छी तरह से अन्य आंतों का वायरस का पता लगाने के लिए सक्षम हो जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Generic name for kits
Macrofoam swab Premoistened EnviroMax Swab kit  Puritan 2588060PFUW
RNA Lysis buffer  CDC UNEX buffer Microbiologics Cat No MR0501
RNA extraction spin column Midi column Omega Biotek Cat No R6664-02
RNA purification spin column Zymol RNA Clean and Concentrator kit  Zymo Research Cat No R1016
Real time RT-PCR kit AgPath kit One-Step RT-PCR Kit Life Technologies Cat No 4387391
Conventional RT-PCR kit Qiagen one step RT-PCR kit Qiagen kit Cat No 210212
Gel extraction kit Qiagen QIAquick gel extraction kit Qiagen kit Cat No 28704 or 28706
Coliphage MS2 ATCC Cat No 15597-B1
RNA run-off transcripts
Realtime PCR platform Applied Biosystems Model ABI 7500
Optical 96-well reaction plate Thermo Scientific Cat No 4316813
MicroAmp Clear Adhesive Film  Thermo Scientific Cat No 4306311

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References

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Park, G. W., Chhabra, P., Vinjé, J. Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces. J. Vis. Exp. (120), e55205, doi:10.3791/55205 (2017).

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