Abstract
Mänskliga norovirus är en ledande orsak till epidemin och sporadisk gastroenterit hela världen. Eftersom de flesta infektioner är antingen sprids direkt via den person-till-person rutt eller indirekt genom miljö ytor eller mat, förorenade fomiter och livlösa ytor är viktiga fordon för spridning av viruset under norovirusutbrott.
Vi utvecklade och utvärderade ett protokoll med hjälp av makroskum svabbar för detektering och typning av humana norovirus från hårda ytor. Jämfört med fiber spets kompresser eller antistatiska våtservetter, makroskum kompresser tillåter virusutvinning (intervall 1,2-33,6%) från toalettsitsen ytor på upp till 700 cm 2. Protokollet inkluderar stegen för utvinning av viruset från bomullstopparna och ytterligare koncentration av det virala RNA med användning av centrifugeringskolonner. Totalt 127 (58,5%) av 217 pinnprover som samlats in från ytor i kryssningsfartyg och långvårdsanläggningar där norovirus gastroenterit hade varitrapporterade testat positivt för GII norovirus genom RT-qPCR. Av dessa 29 (22,8%) kunde framgångsrikt genotypas. Sammanfattningsvis, detektion av norovirus om miljö ytor använder protokollet vi utvecklat kan bidra till fastställandet av miljöföroreningar under utbrott samt detektion av virus när kliniska prover inte är tillgängliga; Det kan också underlätta övervakningen av effektiviteten i saneringsstrategier.
Introduction
Mänskliga norovirus är en ledande orsak till epidemin och sporadisk akut gastroenterit i världen en, två, tre. Viruset är mycket smittsam och överföring sker genom direkt person till person interaktion eller indirekt genom kontakt med förorenat mat, vatten eller miljö ytor. Norovirus kan kasta under längre perioder och förlängd överlevnad av viruset på miljö ytor har dokumenterats en, två, tre. Under topp avlösning, är miljarder av viruspartiklar frigörs per gram avföring och uppkastningar innehåller även ett tillräckligt antal virala partiklar att orsaka infektion 4, 5, 6, 7, 8,EF "> 9, 10. Dessutom kan överföring av viruset mellan livlösa ytor och mänsklig hud uppstår lätt 2, 11, 12. Därför kan övervakningen av miljöförorening bistå vid undersökningar av sjukdomsutbrott och bedöma effektiviteten av saneringen och desinfektion.
Flera provtagningsprotokoll miljö har beskrivits för detektion av rotavirus, colifag MS2, felint calicivirus (FCV), och bakteriofag P22 13, 14, 15, 16. Men validerings villkor som beskrivs i dessa studier, inklusive snabb uttorkning (<1 timme) och små ytor (25 x 100 cm 2), får inte tillräckligt representera inställningar. Dessutom förväntas kontamineringen av environmental ytor kräver protokoll som är i stånd att detektera mycket få viruspartiklar.
Vi utvecklade ett makroskum baserad yta provtagningsmetod för att upptäcka och typning av norovirus. Denna metod har validerats under flera norovirusutbrott. Protokollet omfattar 1) hur man samlar pinnprover från miljöytor (2) hur man bäst upprätthålla integriteten hos proverna under insamling och transport till laboratoriet, och 3) laboratorietester och typning av norovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Swab Provtagning i fält
- Använd en ren par handskar.
- Mäta storleken på provytan utan att röra vid ytan med hjälp av ett måttband eller linjal. Försöka uppskatta det område som så exakt som möjligt och fyller i ett formulär (Supplementary Tabell 1).
- Kontrollera pinnen kit för eventuella läckage och etikett provtransportväskor och pinnsatser.
- Flytta pinnen tvärs över provtagningsområdet på följande sätt: en stroke i horisontell riktning, en stroke i vertikal riktning, och en stroke i en diagonal riktning. Do not kompress en ytarea större än 700 cm 2.
- Placera varje pinnen i ett rör och dra åt locket ordentligt.
2. Lagring och transport av svabbar till laboratoriet
- Hålla bomullstoppar vid 4 ° C i upp till 48 timmar. Om lagring under längre perioder krävs, lagra bomullstopparna vid -20 ° C (eller -70 ° C).
- Hålla rören vid 0-4 ° C (dvs.. Använd kallt förpackningar) i en isolerad behållare under transport till laboratoriet och fartyg inom 24-48 timmar för insamlingen.
3. Virus Koncentration, viral RNA-extraktion och rening
NOTERA: Alla centrifugeringssteg använder en bordscentrifug vid 5000 xg under 5 min vid rumstemperatur, om inte annat anges. Var extra försiktig när du arbetar med den universella nukleinsyra extraktion (UNEX) buffert. Använd skyddsglasögon eller ansiktsskärm.
- Märka en 15 ml tub och en RNA Midi-kolonn för varje prov. Inkludera en negativ extraktion kontroll i varje experiment.
- Att förbereda Lysis lösningen under 10 kompresser, blanda 25 ml UNEX-buffert med 25 ml PBST (PBS pH 7,2 innehållande 0,02% Tween-80).
- Tillsätt 50 | il av colifag MS2 suspension (10 6 PFU / il) till 50 ml lyseringslösning.
- Placera en bomullstopp i en 15 ml rör och tillsätt 5 ml Lysis lösning. Blanda och inkubera under 10 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 5 ml 100% etanol till varje rör och vortexblanda i 10 s.
- Försiktigt bort pinnen från 15 ml rör (det innehåller UNEX buffert) trycker det försiktigt mot sidan av röret för att avlägsna överskottsvätska och sedan kasta pinnen. De återstående volymerna bör vara mellan 9-10 ml.
4. Midi Kolumn viral nukleinsyra Extraction
- Försiktigt överföra 4,5 ml UNEX / etanolblandning från steg 3,6 till en midi kolonn, centrifugera och kasta filtratet.
- Fyll ytterligare 4,5 ml från samma blandning på samma kolumn, centrifug, och kasta filtratet.
- För den första tvätten, tillsätt 3,5 ml 70% etanol på Midi kolonnen, centrifugera och kassera filtratet.
- För den andra tvättningen, tillsätt ytterligare 3,5 ml av 70% etanol på Midi kolonnen. Centrifugera och häll bort filtratet.
- För torr-spin, centrifugera Midi kolonner för att avlägsna alla spår av etanol (som negativt kan påverka din viralt RNA återhämtning).
- Placera Midi kolonnen i ett nytt 15 ml centrifugrör. Tillsätt 250 pl elueringsbuffert på Midi-kolonn; vänta en minut innan centrifugering för att erhålla den högsta viralt RNA återhämtning.
- Lagra den extraherade nukleinsyran vid -70 ° C eller omedelbart gå till steg 5.
5. Koncentration av viral nukleinsyra Använda RNA Clean och Concentrator Kits
- Tillsätt 500 mikroliter av RNA Binding Buffer till 250 mikroliter av RNA elueras i steg 4,7 ovan och vortex under 10 s.
- Lägg 750 mikroliter 100% etanol och virvel för 10 s.
- Märk en spin kolumn för varje prov. Ladda 750 mikroliter prov på en spinnkolonn.
- Centrifugera spinnkolonner vid 12.000 xg i 1 min. Kassera genomströmning.
- Ladda de återstående 750 | il på en spinnkolonn och centrifugera vid 12.000 xg under 1 min.
- För fördisk, tillsätt 400 mikroliter RNA Prep buffert till varje spinnkolonn och centrifugera vid 12.000 xg under en minut. Kassera genomströmning.
- För den första tvätten, tillsätt 800 | il RNA tvättbuffert i varje spinnkolonn och centrifugera vid 12.000 xg under 1 min. Kassera genomströmning.
- För den andra tvättningen, tillsätt 400 | il RNA-tvättbuffert för att snurra kolonnen och centrifugera vid 12.000 xg under 1 min. Kassera genomströmning.
- För den torra-spinn, centrifugera spinnkolonn för att avlägsna alla spår av tvättbuffert vid 12.000 xg under 2 min.
- Försiktigt överföra spinnkolonn till en ren 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 25 mikroliter elueringsbuffert på spinnkolonn och inkubera i 1 min vid rumstemperatur. Detta kommer att öka återvinningen av viralt RNA från kolonnen.
- Samla RNA genom centrifugering av spinnkolonn vid 10.000 xg i 1 min.
- Antingen fortsätta direkt till RT-qPCR (steg 6) eller lagra RNA vid -70 ° C.
6. Mutiplex RT-qPCR detektion av Genogroup I och II Noroviruses, och colifag MS 2 (Kompletterande tabell 2)
- Rena arbetsytor, pipettes, och centrifuger med RNas sanering lösning för att minska risken för kontaminering.
- Tina RT-qPCR reagenser på is. Tina RNA på is (i ett separat område / rum).
- Bestäm antalet reaktioner och lägga till minst 10% mer av dem (t.ex. om 10 reaktioner behövs göra huvudblandning för 11).
- Vortex individuella mästare blanda komponenter, med undantag för 25x RT-qPCR enzym, 5 s. Blanda försiktigt enzymet genom att ställa röret med ett finger.
- Kortfattat centrifugera masterblandning komponenter för 5 s.
- Förbereda Master Mix för realtids-RT-PCR-detektion av norovirus GI och GII enligt kit instruktioner och tillsätt norovirus specifika oligonukleotidprimrar och sönder i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör (Supplementary Tabell 3).
- Blanda Master Mix genom att pipettera 5-10 gånger upp och ner (vortex rekommenderas inte). Alikvot 22 mikroliter av master blandningen i varje brunn av realtids-PCR 96-brunnar.
- Virvel prov-RNA5 sekunder, och samla med kort (5 s) centrifugering.
- Tillsätt 3 | il av prov-RNA och GI och GII positiva kontroller till RT-qPCR plattan (följ mall från tabell 2). Tillsätt 3 mikroliter av nukleasfritt Free i no-template-kontroll (NTC) brunnar.
- Täta realtid platta med optisk självhäftande film.
- Centrifugera noggrant realtids plattan vid 1300 xg under 1 min för att avlägsna eventuella luftbubblor eller vätskedroppar som kan finnas närvarande i brunnarna.
- Inrätta en realtids-PCR instrument och set-up följande termocykling villkor: 1) RT steg under 10 minuter. vid 45 ° C (2) aktivering av Taq-polymeras, 10 min. vid 95 ° C och (3) 45 cykler om 15 s vid 95 ° C, och 60 s vid 60 ° C.
7. Kvantifiering av Norovirus i pinnprover
- Kontrollera resultatet av positiva och negativa kontroller för att validera RT-qPCR resultat (Kompletterande tabell 3).
- Avgöra om varje standardkurva uppfylleracceptabla värden ges i Kompletterande tabell 2 och beräkna den totala standardavvikelsen för standardkurvan med användning av ekvation 1.
(Ekvation 1)% effektivitet = 100 x 10 (genomsnitt Ct värden-Intercept) / lutning. - Om PCR termocyklern programvara inte beräkna lutningen för varje standardkurva, bestämma lutningen och R 2 värden genom regression med hjälp av statistik programvara (t ex Excel, SPSS eller SAS). Dessutom beräkna verkningsgraden% för standardkurvor följande ekvation I
- Anteckna RNA kopieantalet beräknas av termocyklern programvara för alla testprover baserade på standardkurvor som uppfyller kriterierna i kompletterande tabell 4. Köra några prov med standardkurvor t hatt inte uppfyller kriterierna eller har falskt positiva kontroller. Kolla Ct-värden av colifag MS2, som tillsattes som en intern kontroll för att övervaka PCR inhibition.
- Fastställa det totala antalet av RNA kopior pER prov av RNA-kopietalet beräknats i steg 7,2 med kvoten av volymen (25 till 50 mikroliter) av totalt RNA elueringsmedel med den för RNA (3-5 | il) användes för RT-qPCR reaktion multipliceringsorganet. Alternativt beräkna RNA tätheten genom att den totala RNA-kopietalet av föremålet ytarea (cm 2) analyserades.
8. Genotypning av realtids-RT-PCR positiva prover av Hemi kapslade Konventionell PCR-amplifiering
- Förbered den första omgången av Master Mix för varje primer uppsättning av RT-PCR-analys (Kompletterande tabellerna 2 och 5).
- Tillsätt 5 mikroliter av norovirus positiv RNA till 20 mikroliter av masterblandning.
- Köra RT-PCR under följande betingelser: (1) RT-steget under 30 min vid 42 ° C (2) aktivering av Taq-polymeras, 15 min vid 95 ° C, och (3) 40 cykler av 30 s vid 95 ° C , 30 s vid 50 ° C, och 60 sek vid 72 ° C. Efter 40 cykler, inkubera under ytterligare 10 min vid 72 ° C.
- Förbered den andra omgången av mater mix för varje primer uppsättning av RT-PCR-analys (Kompletterande tabellerna 2 och 5).
- Lägg 23 mikroliter Master Mix och tillsätt 2 mikroliter av första omgången RT-PCR-produkter (från första omgången) till varje rör (helst den första omgången produkten ska spädas 1/10 i RNas-fritt vatten).
- Upprepa steg 8,3.
- Bered en 2% agarosgel i 100 ml 1x Tris-acetat EDTA (40 mM Tris, 20 mM ättiksyra och 1 mM EDTA, vid pH 8,3). Efter upplösning av agarosen genom upphettning av blandningen i en mikrovågsugn, tillsätt 10 | il av nukleinsyra fläcken per 100 ml av beredd gel efter kylning av blandningen till 60 till 70 ° C, häll gelén och för in kammarna. Låt gelén sedimentera under minst 30 min.
- Blanda 15 | il av varje RT-PCR-produkten med 3 mikroliter av 6x laddningsfärg. Belastning 15 mikroliter av varje prov och elektrofores på agarosgel vid 100 V under 1 h.
- Punkt mål RT-PCR-fragment av lämplig storlek (330 bp för GI och 341 bp för GII) från gelén end rena RNA med hjälp av en kommersiell gelextraheringskit. Den renade PCR-produkten kan nu användas för Sanger-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 presenterar ett flödesschema över svabben provtagningsprotokoll. Detta protokoll består av fyra huvudsteg; 1) provsamling, 2) prov lagring och transport, 3) viralt RNA rening och koncentration och 4) RT-qPCR analys och genotypning.
Figur 1: Flödesschema i slutprotokollet för miljö yta provtagning av norovirus klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1 sammanfattar resultaten från 34 pinnprover som samlades in från ett kryssningsfartyg som hade rapporterat fall av misstänkt norovirus gastroenterit under en resa. Pinnprover extraherades och tested i duplikat för norovirus från multiplex realtids-RT-qPCR. Sjutton (18,5%) prover testade positivt varav 8 prover från ytor i hytter där passagerare med norovirussymptom hade stannat och 9 från gemensamma utrymmen på fartyget. Antalet genomiska kopior per prov beräknades från Ct-värdena (som varierade från 16 till 31) med användning av en standardkurva av en norovirus GII.7 RNA-transkript. Medianantalet genomkopior från pinnprover i hytter var 3,6 log 10 (intervall: 2,4 - 4,5 log 10 RNA kopior), som var betydligt högre än de genomkopior från gemensamma utrymmen (intervall: 1,2-2,1 log 10 genomkopior) ( P <0,001). Fyra (23,5%) av de 17 positiva pinnprover kunde skall genotypas, och samtliga prover hade identiska GII.1 sekvenser.
| Plats miljö swap samlat en | | Genomsnittliga Ct värde (# positivt av det totala antalet testade prover) | Genotyp | Norovirus RNA kopietal per område c samplade | |
| atrium | Ledstänger | 34,3 (1/2) | GII | 16 |
| cabin A | Toalettsits | 31,4 (2/2) | GII. b | 31217 |
| cabin A | Kran | 37,5 (1/2) | GII | 491 |
| cabin A | Dörrhantag | 35,0 (2/2) | GII | 2675 |
| cabin A | Fjärrkontroll | 38,6 (2/2) | GII.1 b | 233 |
| cabin B | Toalettsits | 33,5 (2/2) | GII.1 b | 986 | Glassmaskin | 34,2 (2/2) | GII | 16 |
| Friluftsbad | bordssmaktillsatser | 35,2 (1/2) | GII | 15 |
| Friluftsbad | Bordsskiva | 35,3 (1/2) | GII | 14 |
| Pizzeria | motyta | 35,7 (1/2) | GII | 14 |
| huvud~~POS=TRUNC Galley | Fun-Time Machine | 37,1 (1/2) | GII | 64 |
| Försäljningsautomat | beröringsytor | 38,8 (1/2) | GII | 18 |
| Crew lounge | Tangentbordsytan och mus | 36,8 (1/2) | GII | 80 |
| cabin C | Kran och dörrhandtag | 31,6 (2/2) | GII.1 b | 26458 |
| cabin C | Telefon | 36,4 (2/2) | GII | 1035 |
| cabin C | Tangentbord | 33,0 (2/2) | GII | 1317 |
| Sjukhus | Urklipp | 36,0 (2/2) | GII | 113 |
| en stuga A, B och C har ockuperats av personer som hade varit kliniskt sjuk med virala gastoenteristis symptom. | ||||
| b Fyra av de 17 GII-positiva pinnprover kan genotypas. | ||||
| c RNA exemplar caluated baserat på en standardkurva av norovirus GII.7 RNA-transkript. | ||||
| Obs: ovanstående datum var något modifierad från den ursprungliga artikeln 6. | ||||
Tabell 1: Resultat från 34 pinnprover som samlades in från ett kryssningsfartyg som hade rapporterat fall av misstänkt norovirus gastroenterit under en resa.
Figur 2 visar förhållandet mellan Ct-värden som bestämts med RT-qPCR och förmågan att sekvensera dessa prover. Totalt 127 av 217 pinnprov testade positivt för GII norovirus genom RT-qPCR. Proverna visade ett brett utbud (12-40) i Ct-värden. Totalt kunde 29 (22,8%) av de RT-qPCR positiva prov genotypas. Pinnprover med Ct-värden under 27 och som sträcker sig mellan 28-31 genotypanalyserades vid hastigheter av 100% och 72,2%, respektive. Däremot endast 22,0% och 1,6% av pinn prover med Ct-värden av 32-36 och 37-40, respektive, som produceras hemi-nested amplikoner som skulle kunna sekvenseras med framgång.
Figur 2: Resultat av RT-qPCR screening och sekvensering av pinnprover som hade samlats under bekräftade norovirusutbrott. Vita staplar representerar antal RT-qPCR positiv pinnprov virus. Mänskliga norovirus nukleinsyror i dessa RT-qPCR positiva prover amplifieras med användning av hemi-kapslad PCR-analys och därefter sekvenserades för att bekräfta genotypning. Svarta fält och linje representerar antalet och andelen genotyp bekräftade pinnprover, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Ct värdeområde | Antal RT-qPCR positiva prov | Antal (%) av sekvens bekräftade prov per |
| 20-23 | 4 | 3 (75) |
| 24-27 | 3 | 3 (100) |
| 28-31 | 18 | 13 (72,2) |
| 32-36 | 41 | 9 (22,0) |
| 37-40 | 61 | 1 (1,6) |
| a) hemi nested PCR | ||
Tabell 2: RT-qPCR och genotypning resultaten av pinnprover.
| prov~~POS=TRUNC | PLATS | Beskrivning av ytan | Ytarea (cm 2) | Datum / tid för provtagning | Ren (J / N) | Om rengöras, vad desinfektionsmedel användes? </ Strong> | Detaljerad beskrivning av ytmaterial och plats |
| 1 | Room # 7-1302 | Toalettsits | 700 cm 2 | 2016/06/26; 09:00 | Nej | inte tillämpbar | Toalettsitsen [toppytor), och hård plastoc |
| 2 | Room # 7-1330 | telefon handtag | 500 cm 2 | 2016/06/26; 09:25 | Ja | 1000 ppm blekmedel | Hårdplast, knapp gummi |
Kompletterande Tabell 1: Exempel på samplingsbeskrivningsform.
| genogroup / virus | Namn oligonukleotidprimer / sond | Sekvens 5 → 3 & #900; | Referens |
| soldat- | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | 17 |
| Cog1R | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C | 17 | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | 17 | |
| G1SKR | CCA ACC CAR CCA TTR TAC A | 17 | |
| Ring1E-sond | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ en | Den här studien | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | 17 | |
| Ring2-primer | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <td> 17||
| Ring2-sond | Cy5 eller QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C | 18 | |
| Ms2p-sond | HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c | 18 | |
| en GI TaqMan sond 5'-märkt med 6-karboxifluorescein (FAM) och 3'-märkt med MGBNFQ (Minor-spår bindningsställe) | |||
| b GII TaqMan sond 5'-märkt med Cy5 eller Quasar 670 och 3'-märkt med Black Hole släckare; Black Hole Quencher (BHQ) 2 används på grund av tillgänglighet, BHQ 3 är att föredra. | |||
| c MS2 TaqMan sond är 5R17; -märkt med HEX och 5'-märkt med BHQ1 | |||
Kompletterande Tabell 2: Oligonukleotidprimrar och sönder information.
| Komponent | Volym per reaktion (l) | slutkoncentration |
| 2x RT-PCR-buffert * | 12,5 | 1x |
| Nukleasfritt vatten * | 1,08 | n / a |
| Detektering Enhancer * | 1,67 | n / a |
| Kugge 1F (10 ^ M) | 1 | 400 nM |
| Kugge 1R (10 ^ M) | 1 | 400 nM |
| Ring 1E-sond (10 ^ M) | 0,5 | 200 nM | 1 | 400 nM |
| Kugge 2R (10 ^ M) | 1 | 400 nM |
| Ring 2-sond (10 ^ M) | 0,5 | 200 nM |
| MS2F (10 ^ M) | 0,25 | 100 nM |
| MS2R (10 ^ M) | 0,25 | 100 nM |
| Ms2p-sond (10 ^ M) | 0,25 | 100 nM |
| 2x RT-PCR enzym * | 1 | 1x |
| Master Mix volym | 22 | |
| * Ingår i realtid RT-PCR-kit | ||
Kompletterande Tabell 3: Master mix för multiplex realtid GI / GII / MS2 Norovirus RT-PCR
| Typ av kontroll | resultat tolkning | ||
| Prov | negativ kontroll | Bör vara negativ | |
| positiv kontroll | Bör vara positiv | ||
| negativt prov | Provet är negativt om varje Ct värde är omöjlig att upptäcka för GI / GII | ||
| positivt prov | Ct-värden (GI / GII) i båda replikat är <38; detta (godtyckligt) cut-off måste bestämmas experimentellt för varje realtids PCR plattform och kit | ||
| Preliminärt positivt prov | Prov är preliminärt positivt om Ct värde (GI / GII) av ett replikat är <38 | ||
| Intern processkontroll (MS2) | Prover med ett tröskelvärde cykel (Ct) värde av ≥32 feller MS2 bör testas outspädda och 1/10 utspätt. | ||
| Parameter | acceptabelt värde | ||
| Standardkurva med användning norovirus RNA-transkript | R 2 | > 0,97 | |
| Effektivitet | 90% till 115% | ||
Kompletterande Tabell 4: Kontroller som ska ingå i varje RT-qPCR test för detektion av norovirus i miljöpinnprov.
| Komponent | slutkoncentration | vol / reaktion (l) |
| 5x RT-PCR-buffert | 1x | 5,00 |
| dNTP-blandning (10 mM) 0,4 mM | 1,00 | |
| Enzymblandning (RT och Taq) | 1,00 | |
| Framåtriktad primer en | 0,5 | iM | 0,50 |
| Omvänd primer en | 0,5 | iM | 0,50 |
| RNas-inhibitor (20 U / | il) | 20 U | 1,00 |
| RNas-fritt vatten | 11,00 | |
| Total volym | 20,00 | |
| en framåt och bakåt primeruppsättningar för GI och GII grupp är Cog1F + G1SKR och Cog2F + G2SKR respektive. | ||
| Andra omgången RT-PCR | ||
| Komponent | slutkoncentration | vol / reaktion (l) |
| 5x RT-PCR-buffert < / Td> | 1x | 5,00 |
| dNTP-blandning (10 mM) | 0,4 mM | 1,00 |
| Enzymblandning (RT och Taq) | 1,00 | |
| Framåtriktad primer b | 0,5 | iM | 0,50 |
| Omvänd primer b | 0,5 | iM | 0,50 |
| RNas-inhibitor (20 U / | il) | 20 U | 1,00 |
| RNas-fritt vatten | 14,00 | |
| Total volym | 23,0 | |
| b framåt och bakåt primeruppsättningar för GI och GII grupp är G1SKF + G1SKR och Ring2 primer + G2SKR respektive. | ||
| Obs: ovan informaion ändrades något från den ursprungliga artikeln 19 | ||
| fas I | fält Provtagning | 1. Kontrollera makroskum pinnsatser (t.ex., utgångsdatum, rör läckage, och pinnen väta) |
| 2. Swab yta (gräns ytarea till ≤100 inch 2 (645 cm 2)) | ||
| 3. Placera servetter in i transportrören och dra åt locken ordentligt för att förhindra läckage under transport | ||
| 4. Placera pinnen kit i en ziplock-påse | ||
| fas II | Prov transport och lagring | 1. Prov kompresser bör lagras -70 ° C (eller -20 ° C) |
| 2. Transporte svabbprover till laboratoriet vid 0-4 ° C (kall-pack) i en isolerad behållare och fartyg inom 48 timmar av samla kompresser | ||
| fas III | RNA etraction | 1. Kontrollera lysbuffert (t.ex., utgångsdata) |
| 2. Tillsätt MS2 som en intern kontroll i lysbuffert innan tillsats av 100% etanol | ||
| RNA-rening och koncentration | 3. Rengör lab bänk och liten utrustning som använder RNA RNas borttagning lösning | |
| 4. Byt handskar ofta under åtgärder för att undvika en RNA korskontaminering | ||
| fas IV | RT-PCR-analys (QA / QC) | 1. Inkludera kvantifierade norovirus transkript RNA (GI och GII) för varje RT-qPCR analys för att kontrollera variationer i Ct-värden för varje PCR-körning |
| 2.Använd avsaknad av MS2 signal för att övervaka närvaron av PCR-inhibitorer |
Kompletterande Tabell 6: Checklista CDC förfarande miljöprover för.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Norovirus har en 50% humant smitt dos mellan 18 och 10 tre viruspartiklar 20. Därför kan även smitta låg nivå av ytor utgör en risk för folkhälsan. Flera aspekter av pinnen provtagningsprotokoll utvärderades inklusive: 1) olika pinn material, 2) lagring skick kompresser under transport, 3) viralt RNA-koncentrationen, och 4) colifag MS2 som intern extraktion kontroll.
Tills nyligen hade endast resultatet av kompresser gjorda av bomull, polyester, nylon och antistatisk torka) utvärderats och föreslagits för användning i fält 13, 14, 15, 21, 22. Av dessa har tops blivit rekommenderade av ISO 15216-protokoll för detektering av norovirus och hepatit A-virus från matförberedelseytor ytor och fomiter 23. Hurnågonsin, finns det begränsade uppgifter om test prestanda tops under fältförhållanden med stora hög beröringsytor såsom dörrhandtag, datorer och toalettstolar som har ofta inblandade i överföringen av norovirus 24, 25. Dessutom, storleken på dessa miljöytor överstiger kapaciteten av fiber spets kompresser. I vår studie visade vi att makroskum kompresser, som har en större svabb huvud än fiberspets kompresser, har högre återvinningsgrad för människors norovirus vid provtagning miljö ytor med en yta upp till 700 cm 2.
Norovirus i lösning är relativt instabila vid omgivningstemperatur och kräver minst kylning. Därför bör leverans till laboratoriet ske vid 0-4 ° C inom 48 timmar efter insamling av kompresser. Volymen av provet som typiskt kan testas i en PCR-reaktion är mycket mindre än den för den mängdprovet efter eluering från pinnen (3-5 mikroliter vs 5-10 ml) som, utan koncentration, minskar signifikant positivitet hastigheten. I miljö virologi har polyetylenglykol (PEG) med framgång använts för att koncentrera virus från stora volymer av miljö vatten. Däremot kan volymer upp till 10 ml lätt extraheras och koncentreras med hjälp av Midi spinnkolonner till volymer så låga som 250 mikroliter, och koncentrerades ytterligare 10-faldigt med högt utbyte med hjälp av spinnkolonner.
Även RT-qPCR är den gyllene standarden för känslig detektion och kvantifiering av norovirus, kan känsligheten hos dessa analyser lätt påverkas av närvaron av PCR-inhibitorer som är co-extraheras från pinnprover. Därför införandet av en extraktion kontroll såsom colifag MS2 viruspartiklar, i en multiplex PCR format som detekterar både norovirus samt MS2, bidrar till att övervaka förekomsten av PCR-hämning och bedöma variationen mellan olika experiment. </ P>
Test variabler av en valideringslaboratoriemetod är avgörande för att bestämma diskriminerande kraften i en testmetod och vidare översätts till metodens sannolikt fältprovtagning prestanda. Ta verkliga världen fält tillstånd (t.ex. fördröjd provtagning, större ytor på upp till 700 cm 2) hänsyn gränsen för norovirus upptäckt var 3,4 log 10 (rostfritt stål) och 4 log 10 (toalettsitsen) kopior norovirus per yta samplat 6. Följaktligen negativa pinn resultaten är inte slutgiltiga att ingen viral kontamination har skett. Klinisk och epidemiologisk information av norovirus sjukdom trumf alltid miljö fynd 2, 6.
Våra data från ett kryssningsfartyg visade att hög beröringsytor såsom telefoner, tangentbord för datorer och dörrhandtag testat positivt för norovirus i stugor där människormed rapporterade viral gastroenterit hade stannat. Dessa ytor antingen blev förorenat genom direktkontakt eller indirekt via droppar som produceras under toalettspolning eller kräkningar episoder 6, 7, 8, 9, 10.
Sammanfattningsvis, detektion av norovirus miljö ytor med denna nyutvecklade svabb protokoll kan bidra till fastställandet av miljöföroreningar under utbrott, upptäcka virus när kliniska prover är inte tillgängliga och övervakning av effektiviteten av rengöringsmetoder. Fiber pinne (bomull och rayon) baserad yta provtagningsmetoder har använts i stor utsträckning för att undersöka andra enter virus (t.ex. rotavirus och adenovirus) 27, 28, 29. Med tanke på den högreåterhämtning effektivitet för norovirus av makroskum kompresser över dessa fibrer tippas kompresser 6, vi förväntade oss att de makroskum kompresser kommer att kunna upptäcka andra enter virus också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
- Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
- Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
- Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
- Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
- Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
- Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277 (2015).
- Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
- Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
- Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
- Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
- Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
- Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
- Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
- Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
- Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
- Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
- Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
- Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
- Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
- Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
- Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
- Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
- Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
- Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
- Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
- Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
- Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).
