Abstract
Menneskelige norovira er en førende årsag til epidemien og sporadisk gastroenteritis verdensplan. Fordi de fleste infektioner enten spredes direkte via den person-til-person rute eller indirekte via miljøet overflader eller mad, forurenede fomites og døde overflader er vigtige køretøjer til spredning af virus under norovirus udbrud.
Vi udviklede og evaluerede en protokol ved hjælp makroskum svaberprøver til påvisning og typning af menneskelige norovira fra hårde overflader. Sammenlignet med fiber-tippes podninger eller antistatiske klude, makroskum svaberprøver tillader virus recovery (interval 1,2-33,6%) fra toilet sæde overflader på op til 700 cm2. Protokollen omfatter trin til udvinding af virus fra podninger og yderligere koncentrering af det virale RNA ved anvendelse af spin-søjler. I alt 127 (58,5%) af 217 podninger prøver, der var blevet indsamlet fra overflader i krydstogtskibe og langtidspleje faciliteter, hvor norovirus gastroenteritis havde væretrapporteret testet positiv for GII norovirus ved RT-qPCR. Af disse 29 (22,8%) kunne med held genotype. Konklusionen er, påvisning af norovirus på miljømæssige overflader ved hjælp af den protokol, vi udviklede, kan hjælpe med at bestemme niveauet af miljøforurening under udbrud samt påvisning af virus, når kliniske prøver ikke er tilgængelige; Det kan også lette overvågningen af effektiviteten af oprydningsstrategierne.
Introduction
Menneskelige norovira er en førende årsag til epidemien og sporadisk akut gastroenteritis verdensplan 1, 2, 3. Den virus er ekstremt smitsom og transmission sker gennem direkte person til person interaktion eller indirekte via kontakt med forurenet mad, vand eller miljømæssige overflader. Norovira kan kaste i længere perioder og langvarig overlevelse af virus på miljø overflader er dokumenteret 1, 2, 3. Under spidsbelastning udgydelse, milliarder af viruspartikler frigøres per gram fæces, og opkast indeholder også et tilstrækkeligt antal viruspartikler til at forårsage infektioner 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. Derudover kan overførsel af virus mellem døde overflader og menneskehud forekomme let 2, 11, 12. Derfor kan overvågning af miljøforurening hjælpe med undersøgelser af udbrud og vurdering af effektiviteten af oprydning og desinfektion.
Adskillige miljøprøver protokoller er blevet beskrevet til påvisning af rotavirus, colifag MS2, felin calicivirus (FCV), og bakteriofag P22 13, 14, 15, 16. Men de validering, der er beskrevet i disse studier, herunder hurtig udtørring (<1 time) og lille areal (25 x 100 cm 2), kan ikke i tilstrækkelig grad repræsenterer field indstillinger. Derudover forventes lave niveauer for forurening environmental overflader kræver protokoller, der er i stand til at detektere meget få viruspartikler.
Vi udviklede en makroskum-baserede overflade prøvetagning metode til påvisning og typning af norovirus. Denne metode er blevet valideret i flere norovirus udbrud. Protokollen indeholder en) hvordan indsamle prøver podninger fra miljømæssige overflader (2) hvordan man bedst bevare integriteten af prøverne under indsamling og forsendelse til laboratoriet, og 3) laboratorieundersøgelser og typning af norovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Swab Prøveudtagning i Field
- Bær en ren par handsker.
- Måle størrelsen af prøveudtagningsarealet uden at røre overfladen med et målebånd eller en lineal. Prøv at estimere området så præcist som muligt og udfylde en formular (Supplerende tabel 1).
- Tjek podepinden kit til mulige lækager og label prøve transport tasker og podninger kits.
- Flyt podepinden tværs prøveudtagningsarealet som følger: en slagtilfælde i vandret retning, et slag i lodret retning, og et slag i en diagonal retning. Må ikke svaber et areal større end 700 cm2.
- Placer hver vatpind ind i et rør, og stram låget forsvarligt.
2. Opbevaring og Transport af svaberprøver til laboratoriet
- Hold swabs ved 4 ° C i op til 48 timer. Hvis opbevaring i længere perioder er påkrævet, opbevare podninger ved -20 ° C (eller -70 ° C).
- Hold rørene ved 0-4 ° C (dvs.. Brug kolde pakninger) i en isoleret beholder under transporten til laboratoriet og skib inden for 24-48 timer for indsamlingen.
3. Virus Koncentration, Viral RNA ekstraktion og oprensning
BEMÆRK: Alle centrifugeringstrin bruge en bordcentrifuge ved 5000 xg i 5 min ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Vær ekstra forsigtig, når du arbejder med den universelle nukleinsyre ekstraktion (UNEX) buffer. Brug beskyttelsesbriller eller ansigtsskærm.
- Mærk et 15 ml rør og en RNA Midi-søjle for hver prøve. Medtag en negativ udvinding kontrol i hvert forsøg.
- Til fremstilling lyseopløsningen i 10 podninger, bland 25 ml UNEX puffer med 25 ml PBST (PBS pH 7,2 indeholdende 0,02% Tween-80).
- Der tilsættes 50 pi af colifag MS2 suspension (10 6 PFU / pl) til 50 ml Lysis opløsning.
- Placer en vatpind i en 15 ml rør og tilsæt 5 ml Lysis løsning. Blandes og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 5 ml 100% ethanol til hvert rør og vortex i 10 s.
- Fjern forsigtigt podepinden fra 15 ml rør (den indeholder UNEX puffer) at trykke den forsigtigt mod siden af røret for at fjerne overskydende væske og derefter kassere podepinden. De resterende mængder bør være mellem 9-10 ml.
4. Midi Column Viral Nucleic Acid Extraction
- overføre forsigtigt 4,5 / ethanol-blanding ml UNEX fra trin 3.6 på en midi kolonne, centrifuge og filtratet kasseres.
- Læg en anden 4,5 ml fra samme blanding på den samme kolonne, centrifuge, og filtratet kasseres.
- For første vask, tilsættes 3,5 ml 70% ethanol på Midi kolonnen, centrifuge og filtratet kasseres.
- For den anden vask, tilføje yderligere 3,5 ml 70% ethanol på Midi kolonnen. Centrifuger og kassér filtratet.
- For den tørre-spin centrifugeres Midi søjler for at fjerne alle spor af ethanol (som kan have en negativ indflydelse på din virus-RNA opsving).
- Placer Midi-søjle i en ny 15 ml centrifugerør. Tilsæt 250 pi elueringspuffer på Midi-søjle; vente 1 min før centrifugering for at opnå den højeste virale RNA recovery.
- Opbevar udvindes nukleinsyre ved -70 ° C eller fortsæt straks til trin 5.
5. Koncentration af virusnukleinsyre anvendelse af RNA Ren og Concentrator Kits
- Tilsæt 500 pi RNA bindingspuffer til 250 pi RNA elueret i trin 4.7 ovenfor og vortex i 10 s.
- Tilføj 750 uL 100% ethanol og vortex i 10 s.
- Mærke et spin-kolonnen for hver prøve. Indlæse prøve de 750 pi på et spin-søjle.
- Centrifuger spin-søjler ved 12.000 x g i 1 min. Kassér gennemløbet.
- Indlæse de resterende 750 pi onto et spin kolonne og centrifugeres ved 12.000 xg i 1 min.
- For forvask, tilsættes 400 pi RNA Prep puffer til hver spinkolonne og centrifugeres ved 12.000 xg i 1 min. Kassér gennemløbet.
- For første vask, tilsæt 800 pi RNA vaskebuffer til hver tur søjle og centrifuger ved 12.000 xg i 1 min. Kassér gennemløbet.
- For den anden vask, tilsæt 400 uL RNA Wash Buffer til at spinde kolonnen og centrifuger ved 12.000 xg i 1 min. Kassér gennemløbet.
- For tør-spin centrifugeres spin kolonne for at fjerne alle spor af vaskebufferen ved 12.000 xg i 2 min.
- overføre omhyggeligt spinkolonne til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- 25 pi elueringspuffer på spin-søjle og inkuberes i 1 minut ved stuetemperatur. Dette vil øge genvinding af viralt RNA fra søjlen.
- Collect RNA ved centrifugering af spinkolonne ved 10.000 x g i 1 min.
- Enten fortsætte direkte til RT-qPCR (trin 6) eller opbevares RNA ved -70 ° C.
6. Mutiplex RT-qPCR Påvisning af genogruppe I, og II norovira, og colifag MS 2 (Supplerende tabel 2)
- Rens arbejdsforhold overflader, pipettes, og centrifuger med RNase dekontaminering løsning til at reducere eventuel forurening.
- Optø RT-qPCR reagenser på is. Thaw RNA på is (i et separat område / rum).
- Bestem antallet af reaktioner og tilføje mindst 10% flere af dem (fx hvis der er behov for 10 reaktioner, gør mester mix til 11).
- Vortex individuelle mester mix komponenter, bortset fra 25x RT-qPCR enzym, i 5 sek. Bland forsigtigt enzymet ved at stille rør med en finger.
- Kortvarigt centrifuge master-mix komponenter til 5 s.
- Forbered master mix for realtime RT-PCR påvisning af norovirus GI og GII ifølge kittets instruktioner, og tilføj norovirus-specifikke oligonukleotidprimere og prober i et 1,5 ml mikrocentrifugerør (Supplerende tabel 3).
- Bland master mix ved pipettering 5-10 gange op og ned (hvirvelbehandling ikke anbefales). Aliquot 22 pi af master mix i hver brønd af real time PCR 96-brønds plade.
- Vortex prøve RNAi 5 sek, og indsamle ved kort (5 s) centrifugering.
- Tilsæt 3 pi prøve RNA og GI og GII positive kontroller til RT-qPCR plade (følg skabelon fra tabel 2). Tilsæt 3 uL af nuklease-Freewater i no-template-kontrol (NTC) brønde.
- Forsegl realtid plade med optisk selvklæbende film.
- centrifugeres forsigtigt realtid plade ved 1.300 xg i 1 min for at fjerne eventuelle luftbobler eller flydende dråber, der kan være til stede i brøndene.
- Opsæt en real-time PCR instrument og opsætning følgende termocykliseringsbetingelser: 1) RT trin i 10 min. ved 45 ° C (2) aktivering af Taq-polymerase, 10 min. ved 95 ° C og (3) 45 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 60 sekunder ved 60 ° C.
7. Kvantificering af Roskildesyge i Svaberprøver
- Kontroller resultaterne af positive og negative kontroller til at validere RT-qPCR resultater (supplerende tabel 3).
- Undersøg, om hver standardkurve opfylderacceptable værdier givet i supplerende tabel 2 og beregne den samlede standardafvigelse for standardkurven ved hjælp ligning 1.
(Ligning 1)% effektivitet = 100 x 10 (gennemsnit Ct Værdier-Intercept) / Slope. - Hvis PCR termiske cycler software ikke beregne hældningen for hver standard kurve bestemmes hældning og R 2 værdier ved regression ved hjælp af statistik software (f.eks Excel, SPSS eller SAS). Desuden beregne% effektivitet for standardkurver følgende ligning I
- Optag RNA kopi nummer beregnet af den termiske variator software til alle prøver baseret på standardkurver, der opfylder kriterierne i supplerende tabel 4. Køres igen nogen prøver med standard kurver t hat ikke opfylder kriterierne eller har falsk-positive kontroller. Tjek Ct-værdier for colifag MS2, som blev tilføjet som en intern kontrol til overvågning af PCR-hæmning.
- Bestemme det samlede antal af RNA kopier pER prøve ved at multiplicere RNA kopital beregnet i trin 7.2 af forholdet mellem volumenet (25 til 50 pi) totalt RNA eluent til den for RNA (3.-5 pi) anvendes til RT-qPCR reaktion. Alternativt beregne RNA tæthed ved at dividere det totale RNA kopiantal af objektet overfladeareal (cm2) analyseret.
8. Genotypebestemmelse af Real-time RT-PCR positive prøver af Hemi Nested Konventionel PCR-amplifikation
- Forbered den første runde af master-mix for hvert primer sæt af RT-PCR-assay (Supplerende tabel 2 og 5).
- Tilsæt 5 pi norovirus positive RNA til 20 pi mester mix.
- Kør RT-PCR under følgende betingelser: (1) RT trin i 30 minutter ved 42 ° C (2) aktivering af Taq-polymerase, 15 min ved 95 ° C, og (3) 40 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C , 30 s ved 50 ° C og 60 sekunder ved 72 ° C. Efter 40 cykler, inkuberes i yderligere 10 minutter ved 72 ° C.
- Forbered den anden runde af mater mix for hver primer sæt af RT-PCR assay (Supplerende tabel 2 og 5).
- Tilføj 23 uL mester mix og tilsættes 2 pi første runde RT-PCR-produkter (fra første runde) til hvert rør (ideelt set første runde produkt skal fortyndes 1/10 i RNase-frit vand).
- Gentag trin 8.3.
- En 2% agarosegel i 100 ml 1x Tris-acetat-EDTA (40 mM Tris, 20 mM eddikesyre, og 1 mM EDTA ved pH 8,3). Efter opløsning agarose ved opvarmning af blandingen i en mikrobølgeovn, der tilsættes 10 pi nucleinsyrefarve pr 100 ml rede gel efter afkøling af blandingen til 60-70 ° C, hæld gelen og indsætte kamme. Lad gelen nøjes med mindst 30 min.
- Bland 15 pi af hver RT-PCR-produkt med 3 pi 6x loading dye. Belastning 15 pi af hver prøve og elektroforese agarosegelen ved 100 V i 1 time.
- Excise target RT-PCR-fragmenter af passende størrelse (330 bp for GI og 341 bp for GII) fra gelen end oprense RNA under anvendelse af et kommercielt gelekstraktionskit. Det oprensede PCR-produkt kan nu anvendes til Sanger-sekventering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et flowchart af protokollen vatpind prøvetagning. Denne protokol består af fire hovedtrin; 1) prøvetagning, 2) Opbevaring og transport, 3) viral RNA oprensning og koncentration og 4) RT-qPCR assay og genotypebestemmelse.
Figur 1: Flowdiagram af den endelige protokol for overflade prøvetagning af norovirus miljømæssige Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1 opsummerer resultaterne fra 34 podning prøver, der blev indsamlet fra et krydstogtskib, der havde rapporteret tilfælde af mistanke om norovirus gastroenteritis under sejladsen. Svaberprøver blev ekstraheret og teplace in duplo for norovirus ved multiplex real-time RT-qPCR. Sytten (18,5%) prøver testet positive herunder 8 prøver fra overflader i hytter, hvor passagerer med norovirus symptomer havde opholdt sig og 9 fra fællesarealer på skibet. Antallet af genomiske kopier pr prøve blev beregnet ud fra de Ct-værdier (som lå 16-31) ved hjælp af en standardkurve af en norovirus GII.7 RNA transcript. Det mediane antal genom kopier fra prøver podninger i hytter var 3,6 log 10 (interval: 2,4 - 4,5 log 10 RNA-kopier), hvilket var betydeligt højere end de genom kopier fra fælles områder (interval: 1,2-2,1 log 10 genom kopier) ( P <0,001). Fire (23,5%) af 17 positive prøver de podninger var i stand til at blive genotypebestemmes, og alle prøver havde identiske GII.1 sekvenser.
| Placering miljømæssig swap samlet en | | Gennemsnitlig Ct-værdi (# positivt af det samlede antal undersøgte prøver) | Genotype | Norovirus RNA kopi antal pr samplet område c | |
| Atrium | Håndlister | 34.3 (1/2) | GII | 16 |
| Cabin A | Toiletbræt | 31.4 (2/2) | GII. b | 31.217 |
| Cabin A | Vandhane | 37,5 (1/2) | GII | 491 |
| Cabin A | Dørhåndtag | 35,0 (2/2) | GII | 2675 |
| Cabin A | Fjernbetjening | 38,6 (2/2) | GII.1 b | 233 |
| Cabin B | Toiletbræt | 33,5 (2/2) | GII.1 b | 986 | Ice Cream Machine | 34.2 (2/2) | GII | 16 |
| Lido | Tabel Krydderier | 35,2 (1/2) | GII | 15 |
| Lido | Bordplade | 35,3 (1/2) | GII | 14 |
| Pizzeria | modoverflade | 35,7 (1/2) | GII | 14 |
| Main Galley | Fun-tid Machine | 37,1 (1/2) | GII | 64 |
| Automat | berøringsbilleder Overflader | 38,8 (1/2) | GII | 18 |
| Crew-lounge | Tastatur Overflade og mus | 36,8 (1/2) | GII | 80 |
| Cabin C | Hane og dørhåndtag | 31,6 (2/2) | GII.1 b | 26.458 |
| Cabin C | Telefon | 36,4 (2/2) | GII | 1035 |
| Cabin C | Tastatur | 33,0 (2/2) | GII | 1317 |
| Medicinal Center | Udklipsholder | 36,0 (2/2) | GII | 113 |
| en Cabin A, B og C har været besat af personer, som havde været klinisk syg med viral gastoenteristis symptomer. | ||||
| b Fire af prøver de 17 GII-positive podninger kunne genotype. | ||||
| c RNA-kopier blev caluated baseret på en standard kurve af norovirus GII.7 RNA-transkripter. | ||||
| Bemærk: Ovenstående dato blev ændret en smule fra den oprindelige artikel 6. | ||||
Tabel 1: Resultater fra 34 podninger prøver, der blev indsamlet fra et krydstogtskib, der havde rapporteret tilfælde af mistanke om norovirus gastroenteritis under sejladsen.
Figur 2 viser forholdet mellem Ct-værdier bestemt ved RT-qPCR og evnen til at sekventere disse prøver. I alt 127 ud af 217 podninger prøver testet positive for GII norovirus ved RT-qPCR. Prøverne viste en lang række (12-40) af Ct-værdier. I alt kunne 29 (22,8%) af de RT-qPCR positive prøver skal genotypebestemmes. Svaberprøver med Ct-værdier under 27 og på mellem 28-31 blev genotype med hastigheder på 100% og 72,2%, hhv. I modsætning hertil kun 22,0% og 1,6% af prøverne podning med Ct-værdier på 32-36 og 37-40, henholdsvis, produceret hemi-nested amplikoner der kunne sekventeret med held.
Figur 2: Resultater af RT-qPCR screening og sekventering af prøver podninger, der var blevet indsamlet under bekræftede norovirus udbrud. Hvide søjler repræsenterer antallet af RT-qPCR prøver positive podninger virus. Humane norovirus nukleinsyrer i disse RT-qPCR positive prøver blev amplificeret under anvendelse hemi-nested PCR assay og derefter sekventeret til bekræftelse af genotypebestemmelse. Sorte barer og linje repræsenterer antallet og procentdelen af genotypen bekræftede prøver podninger, hhv. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Ct value range | Antal RT-qPCR positive prøver | Nummer (%) af sekvens bekræftede prøver en |
| 20-23 | 4 | 3 (75) |
| 24-27 | 3 | 3 (100) |
| 28-31 | 18 | 13 (72,2) |
| 32-36 | 41 | 9 (22,0) |
| 37-40 | 61 | 1 (1,6) |
| a) hemi nested PCR | ||
Tabel 2: RT-qPCR og genotypebestemmelse resultater af prøver podning.
| Prøve nummer | BELIGGENHED | Beskrivelse af overflade | Areal (cm2) | Dato / tidspunkt for prøvetagning | Clean (J / N) | Hvis rengøres, hvad desinfektionsmiddel blev anvendt? </ Strong> | Detaljeret beskrivelse af overflademateriale og placering |
| 1 | Room # 7-1302 | Toiletbræt | 700 cm 2 | 2016/06/26; 09:00 | Ingen | ikke anvendelig | Toilet sæde [top overflader), og hårde plastoc |
| 2 | Room # 7-1330 | Telefon håndtag | 500 cm 2 | 2016/06/26; 09:25 | Ja | 1.000 ppm blegemiddel | Hård plast, knap gummi |
Supplerende Tabel 1: Eksempel på prøve beskrivelse formular.
| genogruppe / virus | Navn oligonukleotidprimer / probe | Sekvens 5 → 3 & #900; | Reference |
| GI | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | 17 |
| Cog1R | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C | 17 | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | 17 | |
| G1SKR | CCA ACC CAR CCA TTR TAC A | 17 | |
| Ring1E-sonde | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ en | denne undersøgelse | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | 17 | |
| RING2-primer | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <td> 17||
| RING2-sonde | Cy5 eller QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C | 18 | |
| Ms2p-sonde | HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c | 18 | |
| en GI TaqMan probe 5'-mærket med 6-carboxyfluorescein (FAM) og 3'-mærket med MGBNFQ (Minor-groove-bindingssted) | |||
| b GII TaqMan probe 5'-mærket Cy5 eller Quasar 670 og 3'-mærket med Black Hole quencher; Black Hole Quencher (BHQ) 2 anvendes på grund af ledighed, BHQ 3 foretrækkes. | |||
| c MS2 TaqMan probe 5R17; -mærket med HEX og 5'-mærket BHQ1 | |||
Supplerende Tabel 2: Oligonukleotidprimere og prober information.
| Komponent | Volumen pr reaktion (pi) | Endelig koncentration |
| 2x RT-PCR Buffer * | 12.5 | 1x |
| Nuklease-frit vand * | 1,08 | n / a |
| Detection Enhancer * | 1,67 | n / a |
| Cog 1F (10 uM) | 1 | 400 nM |
| Cog 1R (10 uM) | 1 | 400 nM |
| Ring 1E-probe (10 uM) | 0.5 | 200 nM | 1 | 400 nM |
| Cog 2R (10 uM) | 1 | 400 nM |
| Ring 2-probe (10 uM) | 0.5 | 200 nM |
| MS2F (10 uM) | 0.25 | 100 nM |
| MS2R (10 uM) | 0.25 | 100 nM |
| Ms2p-probe (10 uM) | 0.25 | 100 nM |
| 2x RT-PCR-enzym * | 1 | 1x |
| Master Mix volumen | 22 | |
| * Indgår i real time RT-PCR-kittet | ||
Supplerende Tabel 3: Master mix for multiplex real-time GI / GII / MS2 norovirus RT-PCR
| Type kontrol | resultat fortolkning | ||
| Prøve | negativ kontrol | Skal være negativ | |
| positiv kontrol | Skal være positiv | ||
| negativ prøve | Prøve er negativ, hvis hver Ct værdi målbart for GI / GII | ||
| Positiv prøve | Ct-værdier (GI / GII) for begge replikater er <38; dette (vilkårligt) cut-off skal bestemmes eksperimentelt for hver realtime PCR platform og kit | ||
| Foreløbig positiv prøve | Prøve er tentativt positivt, hvis Ct-værdi (GI / GII) på én gentagelse er <38 | ||
| Intern processtyring (MS2) | Prøver med en tærskel cyklus (Ct) værdi på ≥32 feller MS2 bør testes igen ufortyndet og 1/10 fortyndet. | ||
| Parameter | acceptabel værdi | ||
| Standardkurve under anvendelse norovirus RNA-transkripter | R2 | > 0,97 | |
| Effektivitet | 90% til 115% | ||
Supplerende Tabel 4: Styrer at inkludere i hvert RT-qPCR-test til påvisning af norovirus i prøver miljømæssige podninger.
| Komponent | Endelig koncentration | vol / rxn (pl) |
| 5x RT-PCR-buffer | 1x | 5.00 |
| dNTP-blanding (10 mM) 0,4 mM | 1.00 | |
| Enzymblanding (RT og Taq) | 1.00 | |
| Forward primer a | 0,5 um | 0,50 |
| Revers primer a | 0,5 um | 0,50 |
| Rnase-inhibitor (20 U / pl) | 20 U | 1.00 |
| RNase-frit vand | 11.00 | |
| Samlet volumen | 20.00 | |
| en frem og bak primer sæt til GI og GII gruppe er Cog1F + G1SKR, og Cog2F + G2SKR hhv. | ||
| Anden runde RT-PCR | ||
| Komponent | Endelig koncentration | vol / rxn (pl) |
| 5x RT-PCR-buffer < / Td> | 1x | 5.00 |
| dNTP-blanding (10 mM) | 0,4 mM | 1.00 |
| Enzymblanding (RT og Taq) | 1.00 | |
| Forward primer B | 0,5 um | 0,50 |
| Reverse primer B | 0,5 um | 0,50 |
| Rnase-inhibitor (20 U / pl) | 20 U | 1.00 |
| RNase-frit vand | 14.00 | |
| Samlet volumen | 23,0 | |
| b frem og bak primer sæt til GI og GII gruppe er G1SKF + G1SKR, og RING2 primer + G2SKR hhv. | ||
| Bemærk: Ovenstående informaion blevet ændret en smule fra den oprindelige artikel 19 | ||
| fase I | Felt Sampling | 1. Kontrollér makroskum podninger kits (f.eks, udløbsdato, rør lækager, og vatpind fugtighed) |
| 2. Swab overflade (grænse overfladeareal til ≤100 tommer 2 (645 cm 2)) | ||
| 3. Placer rensepenne ind i transport- rør, og stram hætterne sikkert for at undgå lækage under transport | ||
| 4. Anbring podepinden kit i en lynlås-pose | ||
| fase II | Prøve transport og opbevaring | 1. stikprøven podninger skal opbevares -70 ° C (eller -20 ° C) |
| 2. Transport vatpindprøver til laboratoriet ved 0-4 ° C (koldt-packs) i en isoleret beholder og skib inden 48 timer for indsamling podninger | ||
| fase III | RNA etraction | 1. Kontrollér lysisbuffer (f.eks udløbsdatoer data) |
| 2. Tilføj MS2 som en intern kontrol i lysis buffer inden tilsætning af 100% ethanol | ||
| RNA oprensning og koncentrering | 3. Rengør lab bænk og mindre udstyr ved hjælp af RNA RNase fjernelse løsning | |
| 4. Skift handsker hyppigt under foranstaltninger for at undgå et RNA krydskontaminering | ||
| fase IV | RT-PCR-assay (QA / QC) | 1. Medtag kvantificerede norovirus udskrift RNA (GI og GII) for hver RT-qPCR assay til at kontrollere for variationer i Ct-værdier for hver PCR-kørsel |
| 2.Brug fravær af MS2 signal til at overvåge tilstedeværelsen af PCR-inhibitorer |
Supplerende Tabel 6: Tjekliste for CDC procedure miljøprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Norovira har en menneskelig infektiøs dosis 50% mellem 18 og 10 3 viruspartikler 20. Derfor kan endda forurening af overflader på lavt niveau udgør en risiko for folkesundheden. Flere aspekter af protokollen svaber prøvetagning blev evalueret, herunder: 1) forskellige podninger materialer, 2) opbevaring tilstand svaberprøver under transport, 3) viral RNA-koncentrationen, og 4) colifag MS2 som intern udvinding kontrol.
Indtil for nylig havde kun udførelsen af podninger af bomuld, polyester, nylon og antistatisk tørre) blevet evalueret og foreslået til brug i marken 13, 14, 15, 21, 22. Af disse har vatpinde blevet anbefalet af ISO 15216-protokol til påvisning af norovirus og hepatitis A virus fra tilberedes fødevarer overflader og fomites 23. Hvordannogensinde, er der begrænsede data om test ydeevne vatpinde under markforhold med store high-touch overflader såsom dørhåndtag, computere og toiletsæder, der er blevet hyppigt impliceret i transmissionen af norovira 24, 25. Derudover er størrelsen af disse miljømæssige overflader overstiger kapaciteten af fiber-tippes podninger. I vores undersøgelse viste vi, at makroskum podninger, som har en større vatpind hoved end fiber-tip podninger, har højere genanvendelsesprocenter til human norovirus ved prøvetagning miljømæssige overflader med et areal på op til 700 cm2.
Norovira i opløsning er relativt ustabile ved omgivelsernes temperatur og kræver mindst køling. Derfor bør forsendelse til laboratoriet forekomme ved 0-4 ° C inden for 48 timer efter indsamlingen af podninger. Volumenet af prøven, som kan typisk testes i en PCR reaktion er meget mindre end den mængdeprøve efter eluering fra vatpinden (3-5 uL vs. 5-10 ml), som, uden koncentration, reducerer positivitet sats betydeligt. I miljømæssig virologi, har polyethylenglycol (PEG) med succes blevet anvendt til at koncentrere virus fra store mængder af vandmiljøet. Imidlertid kan mængder op til 10 ml let ekstraheres og koncentreres under anvendelse Midi spin-søjler til voluminer så lave som 250 pi, og yderligere opkoncentreret 10-fold med høj udvinding ved hjælp spin-søjler.
Selvom RT-qPCR er den gyldne standard for følsom påvisning og kvantificering af norovirus, kan følsomheden af disse assays let påvirket af tilstedeværelsen af PCR-inhibitorer, der er co-ekstraheres fra prøver af vatpinden. Derfor optagelsen af et ekstraktionskontrol såsom colifag MS2 viruspartikler, i en multiplex-PCR-format, der detekterer begge norovirus samt MS2, hjælper til at overvåge tilstedeværelsen af PCR-inhibering og vurdere variation blandt forskellige eksperimenter. </ P>
Testen variabler af en laboratorievalidering metode er afgørende for at bestemme den diskriminerende effekt af en testmetode og yderligere oversat til metodens sandsynlige felt sampling ydeevne. Tager virkelige verden felt tilstand (f.eks, forsinket sampling, større arealer på op til 700 cm 2) i betragtning, detektionsgrænsen for norovirus var 3,4 log 10 (rustfrit stål) og 4 log 10 (toilet sæde) kopier norovirus pr overflade stikprøven 6. Derfor podninger resultater negative er ikke endelige, at ingen viral kontaminering er opstået. Klinisk og epidemiologisk information om norovirus sygdom altid overtrumfer miljømæssige resultater 2, 6.
Vores data fra et krydstogtskib viste, at høj-touch overflader såsom telefoner, computer tastaturer og dørhåndtag testet positiv for norovirus i hytter, hvor folkmed rapporterede viral gastroenteritis havde opholdt sig. Disse overflader enten blev forurenet ved direkte kontakt eller indirekte via dråber produceret under toiletskyl eller opkastning episoder 6, 7, 8, 9, 10.
Konklusionen er, påvisning af norovirus på miljømæssige overflader ved hjælp af denne nyudviklede vatpind protokol kan bistå med at fastslå omfanget af miljøforurening under udbrud, opdage virus, når kliniske prøver er ikke tilgængelige, og i overvågningen af effektiviteten af rengøring praksis. Fiber podepind (bomuld og rayon) baseret overflade prøveudtagningsmetoder er ofte blevet brugt til at undersøge andre enteriske vira (f.eks rotavirus, og adenovirus) 27, 28, 29. Overvejer højerenyttiggørelse effektivitet for norovirus af makroskum podninger end de fibre, tippes podninger 6, forventede vi, at makroskum podninger vil være i stand til at opdage andre enteriske virus så godt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
- Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
- Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
- Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
- Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
- Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
- Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277 (2015).
- Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
- Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
- Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
- Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
- Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
- Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
- Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
- Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
- Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
- Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
- Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
- Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
- Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
- Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
- Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
- Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
- Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
- Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
- Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
- Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
- Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).
