Summary
פרוטוקול זה מהווה חלופה חסכונית להיבעת פלסמיד דנ"א עירומה עור עכבר. המטרה הכללית של הפרוטוקול היא לספק גנים חיסוניים הקשורות לתוך רקמות עור כדי להתוות את התפקיד הפונקציונלי של גן ספציפי דלקת עורית.
Abstract
חוסר ויסות תגובה חיסונית עור קשור מחלות עור אדם רבות. העברה ישירה של גנים חיסוניים הקשורות לתוך רקמת עור היא גישה מרתקת לחקור אפנון חיסון של דלקת עורית בעכברי מודל של מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול חסכוני כי נמסר DNA עירומה עור עכבר ומוביל ביטוי transgene. השיטה שטבע "acufection", המציין fection טרנס בתיווך לנקב ACU DNA. כדי לבצע acufection, עכבר עור היה חדור ראשון עם ה- DNA פוספט שנאגר מלוח (PBS) ולאחר מכן דקר בקלילות עם חבילה של מחטי דיקור כדי להקל על קליטת ה- DNA ואת transfection לתוך תאים. ה- DNA פלסמיד כנראה נלקח על ידי keratinocyte ותאים דנדריטיים (DCS) בעור והביע לתוך חלבון. שמוק מכני עם מחטים כשלעצמה לא לגרום נזק לעור או לגרום ההפעלה keratinocyte. הביטוישל גנים טרנספקציה אותרה בעור ברמות תעתיק ו translational הן הבאות acufection עבור 2 ימים ומתוחזק עד 7 ימים. המטרה העיקרית לפיתוח שיטה acufection זה היה כדי לחקור איזופורם מוגדר בעבר של IL-15. באמצעות שיטה זו, איזופורם שחבור חלופי IL-15 עם 7 אקסון נמחק חלקית (IL-15ΔE7) הובעה בעור ובהמשך מטופלים עם קולטן אגרה דמוי 7 (TLR7) אגוניסט, imiquimod (IMQ), כדי לגרום לדלקת. Acufection-נמסר IL-15ΔE7 בעור מודחקים התפשטות keratinocyte, עובי אפידרמיס גיוס נויטרופילים דלקת עורית הנגרמת IMQ. עם הגדלת ריבית בזיהוי מנגנוני הוויסות של דלקת עורית, הפרוטוקול המתואר כאן מספק אלטרנטיבה יעילה תכליתית עלות למערכת אקדח הגנים או microseeding למסירת DNA in vivo. זה עלול פוטנציאלי לאפשר גילוי הפונקציה של רומןהגן בעור או לחקירת הטיפול החדש למחלות עורית.
Introduction
העור הוא קו ההגנה הראשון המארח. קרטינוציטים (KCS) הם סוג התאים העיקרי בעור של בני אדם ועכברים. בתגובה לגירויים סביבתיים (למשל השמש, חמצן, כימיקלים הפלישה פתוגניים), KCS מופעלים לייצר מגוון רחב של ציטוקינים מעודדי דלקת וכמוקינים כגון IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α ו- GM-CSF 1. יחד הם מפעילים את הגיוס של תאי מערכת החיסון של העור. דלקת עורית מחמירות קשורה לעיתים קרובות עם מחלות אנושיות רבות כולל דלקת עור ממגע אקטופי חריפה ודלקת בתיווך התא T כרונית (דלקת עור אלרגית ממגע למשל ופסוריאזיס) 2. ויסות תגובות מעודדות דלקת בעור על ידי עיכוב הפעלת KC היא גישה סבירה לטיפול בדלקת עורית. פרוטוקול זה מתאר גישה חדשה לבטא את גן ציטוקינים זמני האפידרמיס על מנת ללמוד מיל חיסוניponse תוצאתי כדי טיפול כזה בעור.
האפידרמיס מלחין השכבה השטחית ביותר של העור. הוא משמש כמחסום פיזי שמירת חומרים חיצוניים כגון חומצות גרעין ופתוגנים מלהיכנס לשכבות העמוקות של העור. כמה טכניקות מחט ללא הוקמו DNA אפידרמיס העברת 3, 4. דנ"א בתמיסה או הקשורים ליפוזומים קטיוני או וקטורים אדנווירוס יושם ישירות האפידרמיס שונה עם טכניקות כגון הסרת השכבה הקרנית או הטיפול עם depilating מגיב. הסרת האפיתל cornified מקל DNA חציית מחסום האפידרמיס ואינטראקציה עם קרטינוציטים ותאי לנגרהנס לגרום תגובה חיסונית 5. בעוד שטח פנים גדול זמין עבור העברת דנ"א גישה זו אינה כרוכה מחטים, ישנם חסרונות לרבות הדרישהעבור הכמויות הגדולות של DNA (10 - 100 מיקרוגרם), יחס קשה על העור על ידי הפשטה, ואת התוצאות לא העקביות בזירוז תגובה חיסונית של חיות המחוסנות בלי מאיץ משלוח DNA 6. Microparticle בתיווך משלוח תאי של DNA ערום אל העור הוכח להיות יעיל מאוד לשחזור גרימת תגובה חיסונית 7, 8. אקדח גני כף יד נעשה שימוש כדי להפציץ את אתר יעד עור עם חלקיקי זהב מצופה פלסמיד דנ"א 2 מיקרומטר בקוטר בגודל באמצעות זרימת אוויר הליום בלחץ 9. ה- DNA פלסמיד כנראה הוא נלקח על ידי תאים דנדריטים KCsand (DCS) בעור ואת החלבון מתבטא באופן מקומי או מועברים ניקוז בלוטות הלימפה ידי DCs 10. למרות שמערכת אקדח גנים היא פשוטה ודורשת ניסיון טכני מוגבל, העלות להכנה ושולח את "bul DNAתן "(כלומר אבקות זהב, גז הליום) ועבור אקדח הגן עצמו הגביל היישום הכללי שלה. בנוסף, הדרישה עבור מערכת הולכת גז הליום מגביל את הקלות של תחבורה אקדח גנים כאשר הניסויים נערכים במקומות שונים. Microseeding הודגם להשיג יעילות גבוהה יותר של העברת גנים מ זריקה אחת חלקיקי הפגזה 11. Microseeding משתמשת אקדח קעקוע להעביר דנ"א לעור ללא שימוש חרוזי חלקיקים 11. מתנודד microneedles על העור באמצעות גישה זו עשוי ישירות לגרד את קרום התא ובכך להעביר DNA לתאים מרובים בו זמנית. עם זאת, הכאב הקשור למספר רב של זריקות עם מחטים 0.254 מ"מ בקוטר הוא חיסרון.
כאן אנו מספקים גישה חלופית למסירת DNA in vivo. את "acufection" 12. בעוד acufection מוכיח להיות Dema קל ופחותnding שיטה למסירה DNA in vivo, את הכמות האופטימלית של DNA עבור גנים שונים בזמנים לדקור את העור צריך להיות מותאם בקפידה כדי להשיג תוצאות לשחזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברים נקבה ב 8 - 12 שבועות של גיל ששימשו במחקר זה. C57 / BL6 wild-type (WT) ו- IL-15 חסר (IL15 - / -) עכברים נרכשו ממרכז Animal National Laboratory (NLAC), טייוואן חוות Taconic, בהתאמה. IL-15-בחסר (IL15 - / -) ו- IL-15-דומיננטי (IL15 +/- ו IL15 + / +) הראו יחס של 1: 3 בדור השני מהצלב של heterozygotes +/- IL15. הגנוטיפ של IL15 - / - עכברים אושרו על ידי ניתוח PCR. עכברים נשמרו הפתוגן ללא ספציפי (SPF) במתקן במרכז בחיות מעבדה (LAC), האוניברסיטה הלאומית טייוואן (NTU) המכללה לרפואה. הנהלים כל חיה כולל חומרים ושיטות ההרדמה בוצעו בהתאם לפרוטוקול חיה שאישר מכללת האוניברסיטה הלאומית טייוואן לרפואה המכללה טיפול בבעלי חיים מוסדיים לבריאות הציבור ועדת שימוש (IACUC) (תצהיר של אישור בעלי חיים פרוטוקול 20,130,225).
<p class = "jove_title"> 1. הכנת מחטי דיקורהערה: מחטי הדיקור הן מכשירים רפואיים מורכבים ידית למבוי מחט (איור 1A). בקטרים של מחט דיקור נע בין 0.2 מ"מ (36 G) כדי 0.35 מ"מ (28 G). אנו בוחרים את הנקודה הטובה ביותר של המחט, כדי למנוע נזק לתא מוגזם פוטנציאל במהלך עוקץ את העור. ישנם 4 אורכים שונים של מחט 0.2 מ"מ כולל 13 מ"מ (0.5 ב), 25 מ"מ (1.0 ב), 40 מ"מ (1.5 ב) ו 50 מ"מ (2.0 ב) באורך. חבילה של 10 מחטים עם 13 מ"מ אורך ספקה אחיזה הנוחה ביותר במהלך נדנוד המחט על עור עכבר C57BL / 6. הפרמטרים יכולים להיות שונים אם השיטה מוחלת על העור של בעלי חיים גדולים יותר או מבוצעת על ידי חוקרים עם ידות גדולות.
- הסר מחטי דיקור מהחבילה סטרילי, הלא pyrogenic. מניח את המחטים על וילון סטרילית.
- השתמש קלטת תיוג דבק כדי לאגד 10 מחטים ביחד iצרור נה (איור 1B).
הערה: 10 מחטים מאורגנות בצורה גיאומטרית ויוצרות צורת גליל. לנוחיותך, להשתמש חתיכת סרט פרפין כדי לייצב את הסדר לפני החלת דבק. ודא שכל נקודות המחט נמצאות על אותו המישור. באמצעות צרור במקום מחט אחת מקלת עירוי DNA מקסימלי על ידי הגדלת שטח המגע בין המחטים ואת העור.
2. הכנת כמות גדולה ו רעלן פנימי ללא פלסמיד דנ"א
- Transform תאים חיידקיים המוסמכות כימית עם פלסמיד דנ"א.
- בחר לחסן מושבת חיידקים אחת 3 מ"ל של אנטיביוטיקה המכיל מדיום LB דגירה על 37 מעלות צלזיוס שייקר לילה.
- הסולם את התרבות על ידי דילול התרבות חיידקים על 1: 100 ב 250 מ"ל של מדיום LB עם אנטיביוטיקה ומטלטל לילה בשעה 37 ° C.
- הכינו כמות גדולה של דנ"א באמצעות qualit גבוההy, ערכת הכנה פלסמיד חינם רעלן פנימי בעקבות הוראות היצרן.
הערה: פרוטוקול Acufection דורש טוהר גבוה וכמות גדולה של פלסמיד דנ"א. שימוש באיכות גבוהה, רעלן פנימי חינם פלסמיד דנ"א מטוהר טור מומלץ. - Elute DNA במים סטריליים. חנות ה- DNA aliquots קטן -20 ° C עד מוכן acufection.
הערה: הימנע חזרתי להקפיא ו-הפשרה של DNA כדי להבטיח ביטוי פלסמיד דנ"א עקבי. - לדלל DNA פלסמיד 1 מ"ג / מ"ל ב PBS סטרילי עבור acufection.
נוהל 3. עבור Acufection
הערה: הכמות האופטימלית של ה- DNA ואת השטח של משטח עור היעד עשויה להשתנות עבור גנים שונים צריכה להיות מותאמים יותר. הכח הדוקר ומספר פעמים כדי לשחרר את שכבת חרמן העור גם עשויים להשתנות בהתאם לעובי העור. תנאים אלה חייבים להיקבע בזהירות לאחר הערכת רמת הביטוי של הגן transcri acufectedנק 'על ידי qRT-PCR.
- לשקול את העכברים ולנהל tribromoethanol (400 מיקרוגרם לכל משקל גוף GM) על ידי הזרקת הצפק.
הערה: 2,2,2-tribromoethanol הוא סוכן הרדמה בזריקות היה נפוץ עכברים. פתרונות מבוצעים על ידי המסת כיתה שאינו תרופתי 2,2,2-tribromoethanol (2.5 גרם) במים מזוקקים (200 מ"ל) המכיל 2.5% של 2-מתיל-2-butanol. - השתמש משחת ophthalmologic וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש בהרדמה.
הערה: מאלחשים יהיה המושרה ב 1 - 2 דק '. בדוק את רפלקס קמצוץ הבוהן כדי להבטיח עומק מספיק של הרדמה לפני הניתוח. - לגלח את עור גב האגף ולהחיל קרם מקריח לפרק חלבוני קראטין השערה.
הערה: שימוש קרם מקריח להסיר שיער יקל עירוי של דנ"א לתוך העור. - השתמש כדורי צמר גפן טבול במים כדי לנגב את הקרם המקריח.
הערה: הקרם המקריח הוא מסיס במים. הסרה מלאה של וויל השמנהl למנוע משטח שמנוני להבטיח תוצאה דוקרת יותר. - השתמש במקלון צמר גפן סטרילי ספוג אתנול 70% לחטא את פני העור.
- מארק באזור היעד (1 ס"מ x 1 ס"מ) על העור מקולף עם סטנסיל טרום נמדד. הערה: סימון באתר היעד יעזור ליישם את המחט צרור למעלה ולמטה בתוך אזור מוגדר. זה חשוב כדי להבטיח אספקה של אותה כמות של דנ"א לאזור משטח ספציפי כדי למזער גרסת ניסוי ל-ניסוי.
- מניח ירידת 10 μL של פלסמיד דנ"א (10 מיקרוגרם) על העור הניכר.
הערה: כמות ה- DNA עבור acufection משתנית עם גנים שונים וסוג וקטור ביטוי. כמות ה- DNA המשמש צריכה להיות טיטרציה בזהירות לפני ביצוע הניסוי של עניין. 10 μL הם טיפה נוזלית קטנה והוא יושב היטב על העור המגולח מקולף ללא זולגות בעוד לדקור. כללו קבוצת ביקורת של עכברים שטופלו 10 DNA וקטור ריק μL להשוות עם עכבריםcufected עם גן המחקר. - החזק את צרור מחט דיקור (איור 1B) ודוקרת משטח המסומנים תנועה מעלה ומטה עבור 100 פעמים או עד לחות מן ה- DNA PBS על העור נעלמת. הערה: אדמומיות על פני העור עלולות להתרחש. הימנע לבצע קיצוצים עמוקים כי לדמם. המספר מעלה-מטה לדקור תנועות על פני העור נקבע operably כשהלחות מ- DNA ב PBS (10 μL) נעלמת על העור. החלטנו 100 פעמים ב 30 s כי זה נתן את התוצאות הכי עקבית מן הגנים-נמסר acufection. במידת הצורך, ניתן לעשות שימוש חוזר במחטים עבור דקירות עד 6 העור היעד (1 ס"מ x 1 ס"מ כל אחת). יש לשטוף את המחטים 70% אתנול ו PBS בין acufection. שנה ל מחטים חדשות כאשר הם משעממים או פלסמיד דנ"א שונה כדי למנוע זיהום צולב.
- מניחים עכברים acufected על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עד ער.
- חזור עכברים לכלוב שלהם כאשר הם צריכיםתודעה מספיק חזר. הערה: שמור עכברים acufected בכלוב נפרד (פחות מ 5 חיות לכל כלוב) מהכלוב של עכברים-acufected האו"ם.
- שים בקבוק מים במקום ולהחזיר את הכלוב אל IVC מתלה (מאוורר בנפרד בכלוב).
טיפול 4. פוסט-אופרטיבי
- עבור 48 h הראשון לאחר ההליך, לעקוב מקרוב אחר עכברים עבור כל אי נוחות כולל שינויים התנהגותיים (אי שקט, עצבנות או הפרעת אכילה) או מראה נורמלי (פרווה גסה או יציבה כפופה).
5. Imiquimod (IMQ) טיפול בעור IL-15ΔE7-acufected
הערה: ייצור ביטוי התעתיק וחלבון של גן acufected ניתן לזיהוי על עכברי יום 3. acufected עם פלסמיד עניין יכול להיות מטופלים עם סוגים שונים של חומרים ממריצים 3 ימים לאחר transfection. אנחנו מדגימים כאן על ידי טיפול בעור עכבר IL-15ΔE7-acufected עם שמנת IMQ. IMQ הוא אמין imidazoquinolin אשר Fאו בטיפול מין חיצוני יבלות סביב לידת 13. טיפול IMQ עכשווי מוצג לגרום פרעות עור אנושיות כמו-פסוריאזיס בעכברים עם הביטוי של עור קשקשי, התפשטות אפידרמיס הסתננות עורי נויטרופילים 12, 14, 15.
הערה: וקטור הפלסמיד כלול IL-15 עכבר באורך מלא cDNA, תחת הרגולציה של התארכות גורם-1 α (PEF), מוקף עם פפטיד אות IL-2 ו תג דגל הסופית- C (PEF-אִי- 15, זוגות בסיסים 5859), אשר נבנה כבית מתואר על ידי במפורד ואחות. 16. הפלסמיד משמש כתבנית IL-15 למחוק 16 חומצות אמינו הראשונות בבית השאריות 33 - 48 אקסון 7 של גן IL-15 עבור IL-15ΔE7 (PEF-IL-15ΔE7, 5811 זוגות בסיסים) על ידי SOE (סינתזה ובהרחבת חפיפה) שיטת PCR 17. מושבות חיידקים שהיו בהצלחהטרנספורמציה עם IL-15ΔE7 אומתו על ידי עיכול אנזים הגבלה ו ואחריו רצפי DNA 12, 18. כמות גדולה של DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי הוכן כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 2.
- להרדים עכברים acufected בזריקה intraperitoneal של tribromoethanol (400 מיקרוגרם לכל משקל גוף GM) ולהחיל משחה וטרינר ophthalmologic על העיניים כדי למנוע יובש בהרדמה. בדוק את רפלקס קמצוץ בוהן כדי להבטיח עומק מספיק של הרדמה לפני תחילת ההליכים האופרטיביים. הערה: מאחר עור 2 ס"מ X 2 ס"מ יטופל עבור IMQ, 2 מנות של PIL-15ΔE7 פלסמיד דנ"א (10 מיקרוגרם ב 10 μL PBS לכל מנה) הוא acufected על 2 אתרי היעד (1 ס"מ x 1 ס"מ כל אחת).
- לסימן הצלע העור (2 ס"מ X 2 ס"מ) המכסים את אזור acufected.
- השתמש מוליך Q-Tip ליישם מקומי קרם IMQ על פני השטח המסומן. הערה: צעד 5.1 מתבצעת רק עבור המנה הראשונה (60 מ"ג / מנה).המינונים הרצופים הבאים מוחלים עכברים שאינם הרדים.
- תעד את השינויים של עור גב שטופל IMQ יומי עם מצלמת וידאו בחדות גבוהה. הערה: אדם אחד מחזיק את העכבר בעוד הוא הקלטה. תמונות סטילס מצולמות ונערכו במועד מאוחר יותר.
- להרדים עכברים על ידי הזרקת מנת יתר של tribromoethanol (800 מיקרוגרם לכל משקל גוף GM) ואחריו נקע בצוואר הרחם ביום 4 או יום 7 לאחר טיפול IMQ. העור הוא נכרת ומעובד (צעדים 4.1 - 4.5).
6. homogenate של עור העכבר
- השתמש זוג מספריים כירורגיים לעשות חתך אופקי מבסיס הזנב. Proceed בילטרלי לבסיס של hindlimb ולהמשיך לחתוך אנכית לאורך האגף לבסיס של forelimb.
- בזהירות לקלף את העור מן הרקמה הבסיסית מן אחורי אל הקדמי. השתמש במספריים לחתוך את העור הגבה. מניח את העור על צלחת פטרי סטרילית.
- השתמש אזמל שיחתוך יעדהעור להקפיא אותו בחנקן נוזלי באופן מיידי. הערה: באותו גודל של העור acufected ללא (1 ס"מ x 1 ס"מ) או עם טיפול IMQ (2 ס"מ X 2 ס"מ) הוא קבוע עבור כל עכבר כדי למזער גירסאות הניסוי ל-ניסוי.
- מניח את רקמת העור קפואה במרכז במכתש 2-תא טרום צונן עם ידיות עלי. השתמש בפטיש להוביל על המרגמה לכתוש הרקמה.
- למקם את הרקמה מרסקים במהירות צינור חדש המכיל 500 μL של מגיב תמוגה התא להפקת RNA או אל צינור המכיל 50 μL של PBS ו מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x להשיג lysate חלבון.
7. H & E ו- אימונוהיסטוכימיים מכתים סעיף Skin
- מניחים את רקמת העור ב קלטת לטבול אותו paraformaldehyde 4% בין לילה.
- שבץ ורקמות סעיף, אשר במקרה שלנו בוצעו על ידי מעבדת פתולוגיה בבית LAC, NTU. הערה: הסעיף חותך בעובי של 5 מיקרומטר. מקום רקמות sectiתוספות על גבי שקופיות בעלי מטען חשמלי חיובי.
- מחמם את השקופיות על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- מניחים את השקופיות במעמד מכתים. לטבול את מתל לתוך מקביל מיכל המכיל תחליף קסילן עבור 5 דקות לאחר מכן פעמים על ידי טבילה רציפה ב 100%, 95%, 80%, 75%, 60% ו 50% אתנול (5 דקות כל אחד) עבור התייבשות. לטבול את השקופיות במי ברז במשך 3 דקות לפני מכתים.
- בצעו hematoxylin והכתים eosin. הערה: H & E כתם בוצעה לפי בקשה במעבדת פתולוגיה בבית LAC, NTU.
- עבור כתם אימונוהיסטוכימיים, לחסום את הקטע עם פתרון בלוק בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי להפחית מכתים רקע שאינו ספציפי. הערה: פתרון הגוש מפותח באופן מסחרי עם טכניקות immunostaining. אין בסרום חיה כלול במוצר זה.
- טובל את שקופית PBS לשטוף את פתרון הבלוק.
- לדלל את הפתרון בלוק PBS ב 01:10 ולהוסיף 2% בסרום שור העובר (FBS) (פתרון diluent).
- כתם סעיף סדרה אחד באותו לרוץ עם הפתרון הזהה השמטת הנוגדן הראשוני לשלוט על כריכה הלא ספציפית של נוגדנים משני.
צילום 8. וניתוח של סעיף רקמה צבעונית
- דמיינו H & E מוכתם IHC בסעיפים הרקמה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. צלמו תמונות עם מכשיר חיוב מצמידים (CCD) המצלמה מחוברת למיקרוסקופ. עבור qניתוח uantitative, תוכנת הדמיה ניתן להשתמש
- סרוק את הסעיפים הצבעוניים כולו באמצעות scanscope עם מטרת 20X.
- מדוד את עובי אפידרמיס בתוך קטע 1 מ"מ של האפידרמיס ולספור את מספר התאים immunoreactive-Ki67 במיגזר.
הערה: ניתוח כמותי מתבצע באמצעות אוטומציה מיקרוסקופיה & תוכנת ניתוח התמונה. עובי עוריות מוגדר על ידי המרחק בין שכבת הבסיס, שהיא השכבה החיצונית של האפידרמיס. - ספירת תאים Ly6G-immunoreactive באזור עורי (230 x 270 מיקרומטר מלבן 2) מיד מתחת לעור אקטואלי מטופל-IMQ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעוד כמה אדמומיות בלטה במהלך השעה הראשונה לאחר לדקור עם מחטי דיקור, העור מנוקה ביום 2 ואין תגובה של עור לוואי עד יום 7 נצפתה לאחר לדקור (איור 2 א). דוקר מחט המושרה ברמה נמוכה מאוד של orthokeratosis אפידרמיס הסתננות עורי מינימלית על ידי ניתוח H & E לעומת העור מטופל (איור 2B). עובי אפידרמיס (איור 2 ג) ואת מספר תאי Ki67 + (איור 2 ד) היה דומים בין-דקור ומחט מטופל עור, הוכחה כי דיקור במחט-דקר עור לא לגרום להפרעת רקמות מורגשת או תרבות תאים באפידרמיס. לעומת המחט במזרק (1.067 מ"מימ קוטר) 12, לדקור עם מחטי דיקור מושרות רמות מופחתות של ביטויי הכמוקין CXCLציטוקינים מעודדי דלקת -1 ו IL-6 ביום 2 כי נמשכה הירידה על 5 יום (איור 3A). כדי לאמת את הביטוי של transgene acufected בעור העכבר, פלסמיד המבטא IL-15 cDNA היה acufected בעור של IL-15-בחסר C57BL / 6 (IL-15 KO) עכברים. למרות שרמות נמוכות של תעתיק מן הפלסמיד acufected DNA נצפו העור מקולף, תנודה עם מחטי הדיקור משופר ברמה של שעתוק הגנים (איור 3B). ייצור IL-15 התגלה ביום 2 ונשאר יציב עד יום 7 (איור 3 ג). תוצאות אלו מראות כי acufection ממלא את פלסמיד דנ"א ביעילות ומאפשר הביטוי של החלבון המקודד בעור ללא גרימת הפעלת keratinocyte מוגזמת.
עכברי WT היו acufected עם קידוד פלסמיד IL-15ΔE7. עכברים הביעו IL-15ΔE7 mRNA והחלבון עד 3ימים לאחר transfection (איור 4A). העכברים אז טופלו טופיקלי עם שמנת IMQ ביום 3. בעוד פתיתי כסוף המושרה טיפול IMQ בעכברים מלאי WT, פתיתים כסופות מושרה IMQ הופחתו ב IL-15ΔE7 acufected עכברי WT (איור 4 ב). מעניין, ביטוי acufected IL-15ΔE7 בלמה באופן משמעותי Ly6G + חדירת נויטרופילים לתוך העור מטופל-IMQ לעומת unacufected העור WT (איור 4C) 12. By acufection, הראינו את הפונקציה הרומן של IL-15ΔE7 בעור. IL-15ΔE7 מודולציה חדירת נויטרופילים וישכנע IMQ.
איור 1. איור של מחטי דיקור. (א) מחט דיקור (36 G x 0.5" ) מורכבידית למבוי מחט. (ב) מחטי דיקור עשר מחויבות בחבילה באמצעות דבק. אורכו של צרור הוא כ 4 ס"מ, כפי שהיא נמדדת על ידי השליט (הפאנל התחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. לדקור ידי מחטי הדיקור אינו גורם נזק לעור בולט או keratinocyte ההפעלה. (א) אתרי Triple המסומנים ריבועים אפורים על עור האגף המגולח המקולף של העכבר נדקר 100 פעמים בכל ידי מחטי דיקור. התמונות צולמו על השעה הראשונה ועד 7 ימים לאחר לדקור כדי לפקח על נזק לעור. מגולח עור מקולף ללא דקירה במחט שמש השליטה. <strong> (B) ניתוח H & E של קבוע בפורמלין, סעיפי עור מוטבע פרפין מן עור עכבר מטופל או-דקר מחט. בר סולם: 100 מיקרומטר. (ג) אחת מילימטר-קטע סעיפים מוכתמים H & E מעור עכבר מטופל או מחט-דקור נבחר למדידת עובי אפידרמיס (המרחק בין בסיס לשכבה החיצונית ביותר). כל עמודה מייצגת את הממוצע של עובי אפידרמיס נמדד מ 3 חלקי עור. שגיאה עמודה מייצגת את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). המשמעות של ההבדל בין הקבוצות היה נבדק על ידי מבחן t של סטודנט מזווג. (ד) סעיפים סידוריים של הדגימות אותו הוכתמו-Ki67 אנטי לניתוח אימונוהיסטוכימיים. כל עמודה מייצגת את הממוצע של תאי Ki67 + מקומיים בכל 150 מיקרומטר האפידרמיס באורך לכל 1 קטע מ"מ. שגיאה עמודה מייצגת את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). המשמעות של ההבדל בין הקבוצות היה נבדק על ידי foll דו כיוונית ANOVAחב ידי מבחן פוסט הוק של Bonferroni. (NS: לא משמעותי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Acufection ביעילות מבטאת את החלבון של עניין מבלי לגרום בולט keratinocyte הפעלה. (א) מגולח העור האגף מקולף היה מטופל (NTC), ששרט עם 1.067 בקוטר מ"מ (19 G) מחט המזרק (Syr.) או דוקרים 100 פעמים על ידי מחטי הדיקור (ACU.). רמות התעתיק של CXCL-1 ו- IL-6 ביום 2 ו ביום 5 נמדדו על ידי qRT-PCR (n = 3). (ב) מגולח העור מקולף של IL-15-בחסר העכבר היה למריחה עם ירידה של DNA פלסמיד המבטא IL-15 without (אפילציה) או עם דקירה במחט דיקור (אפילציה + שמוק). תמלול של IL-15 בכל קבוצה ביום 2 נמדד על ידי TaqMan qRT-PCR. תמלול של IL-15 היה בלתי ניתן לגילוי בשליטה PBS (NTC) של עכברים IL-15-בחסר. (ג) ייצור IL-15 מ IL-15-לקווי עור עכבר כי היה מטופל או IL-15-acufected ימים שונים (רקמה אחת לכל יום) נמדדו על ידי IL-15 ELISA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הפגנה של IL-15ΔE7 פוחתת מושרה IMQ עור הכסוף נימוח מעכבת נויטרופילים הסתננות. (א) ייצור ברמה וחלבון תעתיק של IL-15ΔE7-acufected (WT / PIL-15 [6; E7) או שליטת וקטור ריקה (WT / pEmpty) עור נמדד על ידי qRT-PCR ו ELISA (n = 2, בכל נקודת זמן), בהתאמה. (ב) vector- הריק או IL-15ΔE7-acufected עור אגף ב יום 3 טופל טופיקלי עם שמנת IMQ (60 מ"ג). תמונות של WT / pEmpty ו WT / אגף עכבר PIL-15ΔE7 ב יום 6 לאחר טיפול IMQ. (ג) סעיפי עור מ WT / pEmpty או WT / עכברי PIL-15ΔE7 לאחר טיפול IMQ בימים 3 ו 6 הוכתמו נוגדן אנטי Ly6G ומנה. כל עמודה מייצגת את הממוצע של תאי Ly6G + מ 4 עכברים שטופלו IMQ. שגיאה עמודה מייצגת את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). המשמעות של ההבדל בין הקבוצות היה נבדק על ידי דו כיוונית ANOVA ואחריו מבחן פוסט הוק של Bonferroni. פנלי A ו- C הם שונים באישור בכתב העת של רפואת עור חקירתית, רישיון מספר 3901890227597. אנא לחצוכאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי ביותר להבטיח את הביטוי של פלסמיד דנ"א acufected הוא להתנדנד באופן שווה לשחרר את שכבת חרמן העור. בעוד דוחף מחטים בעדינות בלי לחתוך את העור, הכוח צריך להיות מספיק חזק כדי לדכא את השטח. כדי להקל על קליטת ה- DNA בתמיסה 10 μL על פני שטח 1 ס"מ x 1 ס"מ, מחטים צריך להתנדנד מעלה ומטה במשך כ 100 פעמים ב 30 s. אפשר לקבוע את הכוח שצריך לדקור את העור ועל ידי ציון מספר פעמים כי יש צורך להניב את רמת הביטוי הטוב ביותר של הגן acufected.
שינוי בסכום של פלסמיד דנ"א להחיל להשיג רמה מספקת של ביטוי לאחר acufection ייתכן שיהיה צורך, כי זה יכול להשתנות עבור גנים שונים. ניסויי טיטרציה יש לבצע כדי לקבוע את הכמות האופטימלית של ה- DNA פלסמיד להיות מיושמת לפני הניסוי גם כן. תוצאות מניתוח RT-PCR כמותי יעזור לקבוע את oכמות ptimal של DNA פלסמיד במצב הטוב ביותר כדי להשיג תוצאות לשחזור.
המנגנון המדויק של תהליך acufection נשאר להתברר. בעוד תעתיק מן נמסר מקומי פלסמיד דנ"א התרחשו העור מגולח מקולף ברמה נמוכה, לדקור ידי מחטי הדיקור משופרת ויעילות transfection (איור 3B). לשם השוואה של פרוטוקול microseeding שבו נקבים מרובים עם קעקוע אקדח 11, פלסמיד דנ"א-נמסר acufection הוא הקל סביר להניח שבאמצעות החיכוך של קרום התא של קרטינוציטים וזקיקי השיער 19, 20. הגירויים של האפידרמיס על ידי הסרת שיער, ריאגנט depilating ותנודה מחט יכול לגרום ההפעלה keratinocyte במידה מסוימת ולשפר עוד ספיגת DNA ידי לנגרהנס ו DCs 6. מגבלה של פרוטוקול זה היא שכמות פלסמיד דנ"א שנלקחה עדעל ידי תאים לא יכול להיות נשלט במדויק. אנחנו לא ממליצים להשתמש בשיטה זו כדי לטפל באזור עור גדול. כדי למזער וריאציות ברמות הביטוי של הגן נמסר בין ניסויים, הנפח של פתרון ה- DNA ואת גודל שטח עור היעד צריך להיות קבוע עבור אותה הקבוצה של ניסויים. כדי ליצור תוצאות לשחזור, מומלץ כי ניסויים לשכפל יבוצעו על ידי אותו אדם.
בהתייחס למכשיר אקדח גני microseeding, שימוש חבילה של מחטי דיקור להעביר דנ"א עירום הוא זול. הנהלים הם גם פשוטים. זה דורש ניסיון טכני מעט מאוד לעקוב אחר פרוטוקול acufection. Acufection גורמת טראומה מינימאלית לבעלי חיים ולא הרזיה נמצאה לאחר הניתוח. רמת הכאב היא נמוכה כמו להישפט על ידי בהעדר שינוי התנהגות המשמעותי לאחר ניתוח acufection.
לסיכום, באמצעות מחטי דיקור כדי לשחרר אתשכבת חרמן העור לספיגת DNA על ידי תאי מארח מספקת שיטה חלופית חסכונית להביע חלבון עור עכבר. ספקטרום רחב של גנים חיסוניים הקשורות עדיין להתאפיין תפקודי בעור 21, וזה מדגיש את הצורך במחקר מהיר של גן רומן על העור. השימוש באמצעי זה, אפשר לקבוע בקלות אם המוצר של הגן של עניין יש כל פונקציה חדשנית. פרוטוקול acufection זו מספק כלי נוח ואפשרי עבור תגליות חדשות בויסות תגובה חיסונית לרפא מחלה עורית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין המחברים אינטרסים פיננסיים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם משרד המדע והטכנולוגיה (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). אנו מודים בני זוג. בטי וו-צ'יי Chien-קואו לי בבית NTU, ליי זרבוני באוניברסיטת סטנפורד וד"ר פיטר הופמן באוניברסיטת הוואי לקריאת כתב היד, יון Chien ב NTU לקבלת סיוע טכני, וד"ר וון-צ'י וויי ב ביוטכנולוגיה החקלאות מרכז המחקר בבית Academia Sinica לקבלת ייעוץ טכני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
