Summary
Este protocolo é uma alternativa de custo eficaz para a expressão de ADN de plasmídeo despido na pele do rato. O objectivo geral do protocolo é a entrega de genes imuno-relacionados no tecido da pele para delinear o papel funcional de um gene específico em inflamação cutânea.
Abstract
A desregulação da resposta imune em pele está associado com numerosas desordens da pele humanos. transferência directa de genes imuno-relacionados no tecido da pele é uma abordagem fascinante para investigar a modulação imune de inflamação cutânea em modelos de ratinho de doenças humanas. Aqui apresentamos um protocolo de baixo custo que entregue DNA nu na pele do rato e leva a expressão do transgene. O método é cunhado "acufection", que denota ADN mediada por punção trans fecção acu. Para realizar acufection, pele de ratinho foi infundido em primeiro lugar com ADN em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois picado levemente com um feixe de agulhas de acupunctura para facilitar a absorção de ADN e transfeco em culas. O DNA de plasmídeo é presumivelmente retomado pelo queratinócitos e células dendríticas (DC) na pele e expressa em proteína. Picada mecânica com o agulhas per se não causar danos à pele ou induzir a ativação de queratinócitos. A expressãodos genes transfectados foi detectado na pele, tanto a nível da transcrição e tradução seguintes acufection durante 2 dias e mantiveram-se a 7 dias. O objectivo principal para o desenvolvimento deste método acufection foi investigar uma isoforma anteriormente indefinido de IL-15. Usando este método, um splicing alternativo de IL-15 isoforma com remoção parcial do exão 7 (IL-15ΔE7) foi expressa na pele e subsequentemente tratado com um receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para induzir a inflamação. Acufection-entregue IL-15ΔE7 na pele suprimiu a proliferação de queratinócitos, a espessura da epiderme e o recrutamento de neutrófilos na inflamação cutânea induzida por IMQ. Com o aumento do interesse em identificar os mecanismos de regulação da inflamação cutânea, o protocolo aqui descrito proporciona um custo alternativo eficaz e versátil para o sistema de canh de genes ou microdispersão para entrega de ADN in vivo. Ele pode potencialmente permitir a descoberta da função de um romancegene na pele ou para a investigação de novos tratamentos para doenças cutâneas.
Introduction
A pele é a primeira linha de defesa do hospedeiro. Os queratinócitos (KCs) são o tipo de célula principal na pele de seres humanos e ratinhos. Em resposta a estímulos ambientais (por exemplo, luz solar, oxigénio, produtos químicos e invasão patogénico), KCs são activados e produzir uma vasta gama de citocinas prinflamatias e quimiocinas, tais como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α e GM-CSF 1. Juntos, desencadear o recrutamento de células do sistema imunológico para a pele. Inflamação cutânea agravada é muitas vezes associada com numerosas doenças humanas, incluindo a dermatite de contacto ectópico aguda e inflamação mediada por células T crónica (por exemplo, dermatite de contacto alérgica e psoríase) 2. Modular as respostas pró-inflamatórias da pele através da inibição da activação KC é uma abordagem aceitável para tratar a inflamação cutânea. Este protocolo descreve uma nova abordagem para expressar transitoriamente um gene de citoquina na epiderme, a fim de estudar res imunesponse como consequência de um tal tratamento na pele.
A epiderme compõe a camada mais superficial da pele. Ele serve como uma barreira física manter as substâncias externas, tais como os ácidos nucleicos e os agentes patogénicos de entrar nas camadas mais profundas da pele. Várias técnicas sem agulha foram estabelecidas para a transferência de ADN epidérmico 3, 4. ADN em solução ou associado com lipossomas catiónicos ou vectores de adenovus foi directamente aplicado à epiderme modificados com técnicas tais como a remoção do estrato córneo ou para o tratamento com depilating reagente. A remoção do epitélio córneo facilita ADN de atravessar a barreira epidérmica e interacção com queratinócitos e células de Langerhans para induzir respostas imunes 5. Enquanto uma grande área de superfície está disponível para transferência de DNA e esta abordagem não envolve agulhas, há desvantagens, incluindo a exigênciapara as grandes quantidades de ADN (10 - 100), o tratamento dura sobre a pele por decapagem e os resultados inconsistentes na indução da resposta imunitária nos animais imunizados, sem reforço de entrega de ADN 6. Entrega intracelular mediada por micropartícula de ADN nu para a pele tem sido mostrado para ser altamente eficiente e reprodutível para a indução de resposta imune 7, 8. Uma pistola de genes de mão tem sido usado para bombardear o local alvo da pele com partículas de ouro revestidas com ADN de plasmídeo de 2 um de diâmetro em tamanho por meio de hélio pressurizado fluxo de ar 9. O DNA de plasmídeo é presumivelmente absorvidos pelas células dendríticas (DC) KCsand na pele e a proteína é expressa localmente ou ser transportado para nódulos linfáticos de drenagem por DCs 10. Embora o sistema arma gene é simples e requer experiência técnica limitada, o custo para a preparação e entrega dos "bul DNAlet "(isto é, pós de ouro, de gás hélio) e para a pistola de genes em si tem limitado a sua aplicação geral. Além disso, o requisito de um sistema de fornecimento de gás hélio limita a facilidade de transporte pistola de genes quando as experiências são realizadas em locais diferentes. microdispersão demonstrou-se conseguir uma maior eficiência de transferência de genes que única injecção e bombardeamento de partículas 11. microdispersão utiliza uma pistola de tatuagem para entregar ADN para a pele sem o uso de grânulos de partículas 11. oscilante as microagulhas na pele utilizando esta abordagem é provável raspar directamente a membrana celular e assim transferir DNA para várias células, ao mesmo tempo. no entanto, a dor associada com o grande número de injecções com agulhas 0,254 mm de diâmetro é uma desvantagem.
Aqui nós fornecemos uma abordagem alternativa para a entrega de ADN in vivo. O "acufection" 12. Enquanto acufection prova ser um dema fácil e menosnding método para entrega de ADN in vivo, a quantidade óptima de ADN para genes diferentes e os tempos para picar a pele tem que ser cuidadosamente optimizadas para obter resultados reprodutíveis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ratinhos fêmea, com 8 - 12 semanas de idade foram usados para este estudo. C57 / BL6 de tipo selvagem (WT) e IL-15 deficientes (IL-15 - / -) foram adquiridos a partir de National Center Animal Laboratory (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, respectivamente. -IL-15 deficientes (IL-15 - / -) e IL-15 dominante (+/- IL-15 e IL-15 + / +) mostrou uma proporção de 1: 3 na segunda geração a partir do cruzamento de heterozigotos de IL-15 +/-. O genótipo de IL-15 - / - ratos foi confirmada por análise de PCR. Camundongos foram mantidos na instalação Specific Pathogen gratuito (SPF) no Laboratório animal Center (LAC), Universidade Nacional de Taiwan (NTU) College of Medicine. Todos os procedimentos animais, incluindo os materiais e métodos anestésicos foram realizados de acordo com o protocolo de animais aprovado pela Taiwan University College Nacional de Medicina e Faculdade de Animal Care Institucional Saúde Pública e Use Committee (IACUC) (Declaração de Aprovação do Protocolo animal 20130225).
<p class = "jove_title"> 1. Preparação de agulhas de acupunturaNOTA: agulhas de acupunctura são dispositivos médicos constituídos por uma pega e uma ponta de agulha (Figura 1A). Os diâmetros da agulha de acupuntura variou entre 0,2 mm (36 L) a 0,35 mm (28 G). Nós seleccionar o ponto mais fino do que a agulha, para evitar o dano celular excessivo potencial durante a punção da pele. Existem 4 comprimentos diferentes da agulha de 0,2 mm, sendo 13 mm (0,5 polegada), 25 mm (1,0 pol), de 40 mm (1.5 in) e 50 mm (2,0 in) de comprimento. Um conjunto de agulhas 10 com comprimento de 13 milímetros desde a aderência melhor confortável durante a oscilação da agulha na pele do ratinho C57BL / 6. Os parâmetros podem ser modificados se o método é aplicado à pele de animais maiores ou realizado por pesquisadores com as mãos maiores.
- Remover agulhas de acupunctura a partir da embalagem estéril, não pirogénico. Colocar as agulhas em um campo estéril.
- Utilizar fita adesiva para ligar rotulagem 10 agulhas em conjunto ifeixe na (Figura 1B).
NOTA: As agulhas 10 são geometricamente dispostos de modo a formar uma forma de cilindro. Por conveniência, utilizar uma peça de película de parafina para estabilizar o arranjo antes de aplicar a fita adesiva. Certifique-se de todos os pontos de agulha estão no mesmo plano. Usando um pacote, em vez de uma única agulha facilita infusão ADN máxima, aumentando a área de contacto entre as agulhas e a pele.
2. Preparação de uma quantidade grande e livre de Endotoxina O DNA de plasmídeo
- Transformar células bacterianas quimicamente competentes com o plasmídeo de ADN.
- Seleccionar e inocular uma única colónia bacteriana em 3 ml de meio LB contendo antibióticos e incubar a 37 ° C num agitador durante a noite.
- Dimensionar-se a cultura por diluição da cultura bacteriana em 1: 100 em 250 ml de meio LB com antibióticos e agitando durante a noite a 37 ° C.
- Prepara-se uma grande quantidade de ADN, utilizando um elevado Qy, kit de preparação de plasmídeo livre de endotoxina seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: protocolo Acufection exige elevado grau de pureza e uma grande quantidade de DNA de plasmídeo. Uso de uma alta qualidade, endotoxina livre e o DNA de plasmídeo purificado em coluna é recomendado. - Elui-se o ADN em água estéril. ADN loja em pequenas alíquotas a -20 ° C até estar pronto para acufection.
NOTA: Evite repetidos de congelamento e descongelamento de DNA para garantir a expressão de DNA plasmídeo consistente. - Dilui-se DNA de plasmídeo a 1 mg / ml em PBS estéril para acufection.
3. Procedimento para Acufection
NOTA: A quantidade óptima de ADN e a área da superfície da pele o alvo pode variar para diferentes genes e precisam de ser ainda mais optimizado. A força de perfurao e o número de vezes para soltar a camada córnea da pele também pode variar dependendo da espessura da pele. Estas condições devem ser cuidadosamente determinada depois de avaliar o nível de gene transcri acufected expressãopts por qRT-PCR.
- Pesar os ratinhos e administrar tribromoetanol (400 ug por g de peso corporal) por injecção peritoneal.
NOTA: 2,2,2-tribromoetanol é um agente anestésico injectável que foi utilizada em ratinhos. As soluções são preparadas por dissolução de um grau não-farmacêuticos 2,2,2-tribromoetanol (2,5 g) em água destilada (200 ml) contendo 2,5% de 2-metil-2-butanol. - Use vet oftalmológico pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
NOTA: O efeito anestésico vai ser induzida em 1-2 min. Verifique o aperto reflexo dedo do pé para garantir profundidade suficiente de anestesia antes da operação. - Raspar a pele do flanco dorsal e aplica o creme depilatório para dissolver proteínas de queratina na haste do cabelo.
NOTA: O uso de creme depilatório para remover o cabelo vai facilitar a infusão de DNA na pele. - Use bolas de algodão embebidas em água para limpar o creme depilatório.
NOTA: O creme depilatório é solúvel em água. A remoção completa do wil cremel evitar uma superfície gordurosa e garantir um resultado melhor picada. - Usar uma mecha de algodão estéril embebido em etanol a 70% para desinfectar a superfície da pele.
- Mark área alvo (1 centímetro x 1 cm) sobre a pele depilada com uma matriz pré-medido. NOTA: Marcando o site de destino ajudará a aplicar o pacote agulha para cima e para baixo dentro de uma área definida. Isto é importante para assegurar a entrega da mesma quantidade de ADN para uma área de superfície específica para minimizar a variação da experiência-a-experimento.
- Colocar uma gota de 10 ul de ADN de plasmídeo (10 ug) sobre a pele marcada.
NOTA: A quantidade de ADN para acufection varia com diferentes genes e o tipo de vector de expressão. A quantidade de ADN utilizado deve ser cuidadosamente ajustado antes de realizar a experiência de interesse. A 10 uL é uma pequena gota de líquido e situa-se bem sobre a pele raspada e depiladas sem rolar para baixo enquanto picar. Incluem um grupo de controlo de ratinhos tratados com 10 uL de ADN vector vazio para comparar com ratinhos umacufected com o gene estudo. - Segurar o feixe de agulhas de acupuntura (Figura 1B) e picar a superfície marcada com um movimento para cima e para baixo para 100 vezes ou até que a humidade a partir do ADN em PBS na pele desaparece. NOTA: Alguns vermelhidão da superfície da pele podem ocorrer. Evite fazer cortes profundos que sangram. O número de cima e para baixo da punção movimentos sobre a superfície da pele está operativamente determinada quando a humidade a partir do ADN em PBS (10 mL) desaparece na pele. Decidimos 100 vezes em 30 s, porque ele tem dado os resultados mais consistentes de genes entregou-acufection. Se for o caso, as agulhas podem ser reutilizados para até 6 picadas na pele-alvo (1 cm x 1 cm cada). Lavam-se as agulhas em etanol a 70% e PBS entre acufection. Mudar para novas agulhas quando eles são opaca ou por DNA de plasmídeo diferente a fim de evitar a contaminação cruzada.
- Coloque ratinhos acufected sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo até acordado.
- Voltar ratos para sua gaiola quando eles têmconsciência suficiente recuperou. Nota: Observar ratinhos acufected em gaiola separada (menos de 5 animais por gaiola) da gaiola de ratinhos acufected-un.
- Coloque a garrafa de água no lugar e voltar a gaiola para o IVC (gaiola ventilado individualmente) rack.
Cuidados 4. Pós-operatório
- Durante as primeiras 48 h após o procedimento, ratos acompanhar de perto para qualquer desconforto incluindo alterações comportamentais (agitação, agitação ou eating disorder) ou aparência anormal (pelagem áspera ou postura arqueada).
5. Imiquimod (IMQ) Tratamento de Pele de IL-15ΔE7-acufected
NOTA: expressão transcricional e produção de proteína do gene acufected são detectáveis no dia 3. Os ratinhos acufected com o plasmídeo de interesse podem ser tratadas com diferentes tipos de estimulantes 3 dias após a transfecção. Nós ilustramos aqui tratando a pele IL-15ΔE7-acufected rato com creme IMQ. IMQ é um f imidazoquinolin amina aprovadoou o tratamento de verrugas genitais externas e perinatais 13. Tratamento IMQ tópica é mostrado para induzir doenças de pele com psoríase de tipo humano em ratinhos com a manifestação de pele escamosa, proliferação epidérmica e infiltração 12, 14, 15 de neutrófilos dérmica.
NOTA: O vector plasmídeo continha-rato de comprimento completo de ADNc de IL-15, sob a regulação do factor de alongamento 1 α (PEF), flanqueado com um péptido sinal de IL-2 e uma etiqueta FLAG no terminal C (pEF-IL 15, 5859 pares de bases), que foi construído como descrito por Bamford et al. 16. O plasmídeo é utilizado como um modelo de IL-15 para eliminar os primeiros 16 aminoácidos nos resíduos 33-48 do exão 7 do gene da IL-15 para IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 pares de bases) por SOE (síntese por extensão de sobreposição) método de PCR de 17. colônias de bactérias que estavam com sucessotransformada com IL-15ΔE7 foram verificadas por digestão com enzimas de restrição e sequenciação de ADN, seguido por 12, 18. Uma grande quantidade de DNA de plasmídeo isento de endotoxina foi preparado como descrito no passo 2 do protocolo.
- Anestesiar ratos acufected por injecção intraperitoneal de tribromoetanol (400 ug por g de peso corporal) e aplicar veterinário pomada oftalmológica em olhos para evitar a secura sob anestesia. Verifique o aperto reflexo de igual para assegurar profundidade suficiente de anestesia antes do início dos procedimentos operatórios. Observação: Uma vez que a pele de 2 cm x 2 cm de vão ser tratados para IMQ, 2 doses de pIL-15ΔE7 plasmídeo de ADN (10? G em 10? L de PBS por dose) é acufected em 2 locais-alvo (1 cm x 1 cm cada).
- Mark flanquear pele (2 cm x 2 cm), cobrindo a área acufected.
- Use aplicador Q-tip para aplicar topicamente creme IMQ sobre a área de superfície marcada. Nota: passo 5.1 só é levada a cabo durante a primeira dose (60 mg / dose).As doses seguintes consecutivos são aplicados aos ratos não-anestesiados.
- Documentar as alterações de pele dorsal-tratada IMQ diariamente com uma câmara de vídeo de alta definição. Nota: Uma pessoa segura o mouse enquanto outro está gravando. As imagens estáticas são filmados e editados em um momento posterior.
- Eutanásia ratos por injecção de uma overdose de tribromoetanol (800 ug por g de peso corporal) seguida por deslocamento cervical no dia 4 ou dia 7 após o tratamento IMQ. A pele é retirado e processados (Passos 4,1-4,5).
6. homogeneizado rato Pele
- Use um par de tesouras cirúrgicas para fazer um corte horizontal da base da cauda. Proceder bilateralmente para a base do membro posterior e continuar a cortar verticalmente ao longo do flanco para a base do membro anterior.
- Cuidadosamente tirar a pele a partir do tecido subjacente de posterior para o anterior. Use a tesoura para cortar a pele dorsal. Coloque a pele em uma placa de Petri estéril.
- Use um bisturi para extirpar-alvopele e congelá-lo em azoto líquido imediatamente. Nota: O mesmo tamanho de pele sem acufected (1 cm x 1 cm) ou com tratamento IMQ (2 cm x 2 cm) é fixada para cada rato para minimizar variações experimento-a-experimento.
- Colocar o tecido de pele congelado no centro de uma argamassa de compartimento 2 pré-refrigerada com alças e um pilão. Use um martelo de chumbo na argamassa para pulverizar o tecido.
- coloque rapidamente o tecido pulverizado para um novo tubo contendo 500 ul de reagente de lise de células para a extracção de RNA ou a um tubo contendo 50 uL de PBS e 1x cocktail inibidor de protease para obter lisado de proteína.
7. H & E e imuno-histoquímica Coloração de Secção de pele
- Colocar o tecido da pele de uma cassete e mergulhá-lo em paraformaldeído a 4% durante a noite.
- Incorporar e seco de tecido, que, no nosso caso, foi realizada pelo Laboratório de Patologia no LAC, NTU. Nota: A secção é cortada a uma espessura de 5? M. seç tecido lugarons em linas carregadas positivamente.
- Aquecer as lâminas a 65 ° C durante 15 min.
- Colocar as lâminas em um suporte de coloração. Imergir a cremalheira para dentro do tanque correspondente contendo substituto de xileno durante 5 minutos duas vezes, seguido por imersão sequencial em 100%, 95%, 80%, 75%, 60% e 50% de etanol (5 min cada) para re-hidratação. Mergulhar as lâminas em água da torneira durante 3 min antes da coloração.
- Execute hematoxilina e eosina. Nota: H & E mancha foi realizado a pedido no Laboratório de Patologia no LAC, NTU.
- Para coloração imuno-histoquímica, bloquear a secção com uma solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 5 min para reduzir a colorao de fundo n especica. Nota: A solução de bloqueio é comercialmente desenvolvidas com técnicas de imunocoloração. Nenhum soro animal é contido neste produto.
- Dip slide em PBS para lavar a solução de bloqueio.
- Dilui-se a solução bloco em PBS a 1:10 e adiciona soro fetal de bovino a 2% (FBS) (solução diluente).
- Corar uma secção de série no mesmo ensaio com a mesma solução omitindo o anticorpo primário para controlar a ligação não específica do anticorpo secundário.
8. Foto e análise do tecido Seção manchado
- Visualizar secções de tecidos coradas H & E e IHC sob um microscópio de campo brilhante. As imagens de captura usando dispositivo de acoplamento da câmara de carga (CCD) ligado ao microscópio. para qanálise quantitativas, software de imagem pode ser usado
- Digitalizar todo o secções coradas usando um scanscope com um objetivo 20X.
- Medir a espessura da epiderme dentro de um segmento de 1 mm da epiderme e contar o número de células imunorreactivas-Ki67 no interior do segmento.
NOTA: Quantitative análise é realizada usando microscopia de automação e imagem software de análise. A espessura da epiderme é definida pela distância entre a camada basal e a camada mais externa da epiderme. - Contar o número de células imunorreactivas Ly6G na área dérmica (230 x 270? M 2 rectângulo) imediatamente abaixo tópico da pele tratados com IMQ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enquanto alguns vermelhidão foi evidente durante a primeira hora depois da punção com agulhas de acupunctura, a pele foi afastada no dia 2, e não se observou qualquer reacção adversa da pele até ao dia 7 após repicagem (Figura 2A). Agulha de perfuração induzida nível muito baixo de ortoceratose epidérmica e dérmica infiltração mínima por meio de análise de H & E em comparação com a pele não tratada (Figura 2B). A espessura da epiderme (Figura 2C) e o número de células Ki67 + (Figura 2D) foram comparáveis entre a pele picada de agulha e não tratado, demonstrando que a pele acupunctura de agulha picada não provocar ruptura de tecido visível ou proliferação celular na epiderme. Em comparação com a agulha da seringa (1,067 mm de diâmetro), 12 de picadas com agulhas de acupunctura níveis reduzidos induzidos das expressões de CXCL quimiocina-1 citocina pró-inflamatória e IL-6 no dia 2, que continuaram a diminuir no dia 5 (Figura 3A). Para validar a expressão do transgene acufected na pele do rato, um plasmídeo que expressa ADNc de IL-15 foi acufected na pele de ratinhos C57BL / 6-IL-15 deficientes (IL-15 KO). Embora foram observados baixos níveis de transcrição de ADN de plasmídeo em acufected pele depilada, agulhas de acupunctura com oscilação aumentou o nível de transcrição do gene (Figura 3B). IL-15 de produção foi detectada no dia 2 e manteve-se estável até ao dia 7 (Figura 3C). Estes resultados demonstram que infunde acufection eficazmente o DNA de plasmídeo e permite a expressão da proteína codificada na pele sem induzir activação de queratinócitos excessiva.
ratinhos WT foram acufected com um plasmídeo que codifica a IL-15ΔE7. Ratos expressa IL-15ΔE7 ARNm e a proteína até 3dias após a transfecção (Figura 4A). Os ratinhos foram então tratados topicamente com creme IMQ no dia 3. Enquanto tratamento IMQ induzidas flocos prateadas em ratinhos WT controlo, flocos prateadas induzidas IMQ foram reduzidos em IL-15ΔE7 acufected ratinhos WT (Figura 4B). Curiosamente, a expressão de IL-acufected 15ΔE7 inibiu significativamente Ly6G + infiltração de neutrófilos para a pele tratada com IMQ em comparação com a pele unacufected WT (Figura 4C) 12. Por acufection, demonstramos a nova função de IL-15ΔE7 na pele. IL-15ΔE7 modula IMQ-induzindo a infiltração de neutrófilos.
Figura 1. Ilustração de agulhas de acupuntura. (A) A agulha de acupuntura (36 G x 0,5" ) é composto por ummanusear e uma ponta de agulha. (B) dez agulhas de acupunctura estão ligados num feixe utilizando fitas adesivas. O comprimento do pacote é de aproximadamente 4 cm medido por régua (painel inferior) a. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Picar por agulhas de acupuntura não causar danos à pele perceptível ou queratinócitos Activation. (A) locais triplos marcados em quadrados cinzentos na pele do flanco raspada e depilada do mouse foi picada 100 vezes cada um por agulhas de acupuntura. Fotografias foram tiradas na primeira hora e até 7 dias após a picada para monitorar os danos da pele. Rapada e depilada da pele sem picada de agulha foi usada como o controlo. <forte> (B) A análise de H & E, embebidos em parafina secções de pele fixadas em formalina a partir de pele tratada ou picadas de agulha rato. Barra de escala: 100? m. (C) Uma milímetros-segmento de secções coradas com H & E de pele não tratada ou agulha-pricked murganho foi seleccionado para a medição da espessura da epiderme (a distância a partir da base para a camada mais externa). Cada barra representa a média da espessura da epiderme medida a partir de 3 secções de pele. barra de erro representa o erro padrão da média (SEM). A significância das diferenças entre grupos foi testado pelo teste de t de Student não emparelhado. (D) Secções em série das mesmas amostras foram coradas com anti-Ki67 para análise imuno-histoquímica. Cada barra representa a média de células Ki67 + localizadas em cada 150? M-epiderme em comprimento por segmento de 1 mm. barra de erro representa o erro padrão da média (SEM). A significância das diferenças entre grupos foi testada por ANOVA de duas vias exerdevidos pelo teste post hoc de Bonferroni. (NS: não significativo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Acufection Efetivamente exprime a proteína de interesse, sem causar Perceptível de queratinócitos Activation. (A) e raspado de pele depilada flanco foi deixada sem tratamento (CNT), para desgastar por abrasão com 1,067 mm de diâmetro (19 L) de agulha de seringa (Syr.) Ou punção 100 vezes por agulhas de acupunctura (ACU.). Os níveis de transcrição de CXCL-1 e IL-6 no dia 2 e no dia 5 foram medidos por qRT-PCR (n = 3). (B) e raspado de pele depilada do rato IL-15 deficientes foi aplicada topicamente com uma gota de um ADN de plasmídeo que expressam a IL-15 without (depilação) ou com picada de agulha acupuntura (depilação + picada). A transcrio de IL-15 em cada grupo no dia 2 foi medida por qRT-PCR TaqMan. A transcrio de IL-15 não foi detectada em PBS controlo (NTC) de ratinhos IL-15 deficientes. (C) de IL-15 de produção a partir de pele IL-15 deficientes em rato que não foi tratado ou IL-15-acufected para vários dias (um tecido para cada dia) foram medidos por ELISA de IL-15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Demonstração de IL-15ΔE7 atenua-induzida IMQ pele prateado flocoso e inibe a infiltração de neutrófilos. (A) O nível de produção de proteína e de transcrição de IL-15ΔE7-acufected (WT / pIL-15 [6; pele vector de controlo vazio (WT / pEmpty) E7) ou foram medidos por qRT-PCR e ELISA (n = 2, cada ponto de tempo), respectivamente. (B) vetor vazio ou pele flanco IL-15ΔE7-acufected no dia 3 foi tratado topicamente com creme IMQ (60 mg). De fotografias de WT / pEmpty e WT / pIL-15ΔE7 flanco do rato no dia 6 após o tratamento IMQ. (C) a partir de secções da pele WT / pEmpty ou ratinhos WT / PIL-15ΔE7 após o tratamento IMQ nos dias 3 e 6, foram coradas com anticorpo anti-Ly6G e enumeradas. Cada barra representa a média de células Ly6G + a partir de 4 ratos tratados com IMQ. barra de erro representa o erro padrão da média (SEM). A significância das diferenças entre grupos foi testada por ANOVA de duas vias seguido pelo teste post-hoc de Bonferroni. Painéis A e C são modificados com a permissão do Journal of Investigative Dermatology, número de licença 3901890227597. Por favor cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A etapa mais crítica para assegurar a expressão do DNA de plasmídeo acufected é a oscilar de forma uniforme e soltar a camada córnea da pele. Ao empurrar as agulhas suavemente sem cortar a pele, a força deve ser forte o suficiente para deprimir a superfície. Para facilitar a absorção de ADN em 10 de soluo de em um 1 cm x 1 centímetro a área de superfície, as agulhas devem oscilar para cima e para baixo para cerca de 100 vezes em 30 s. Pode-se determinar a força que tem de picar a pele e anotando o número de vezes que é necessário para se obter o melhor nível de expressão do gene acufected.
Modificação para a quantidade de ADN de plasmeo aplicado para atingir um nível satisfatório de expressão após acufection pode ser necessária porque pode variar para diferentes genes. experiências de titulação devem ser realizados para determinar a quantidade óptima de DNA de plasmídeo a ser aplicada antes da experiência bem. Os resultados de análise de RT-PCR quantitativo ajudará a determinar o óptimal quantidade de DNA de plasmídeo e a melhor condição para a obtenção de resultados reprodutíveis.
O mecanismo exacto do processo acufection permanece para ser clarificado. Enquanto a transcrição a partir do ADN plasmídeo entregue topicamente ocorreu na pele rapada e depilada em nível baixo, picar por agulhas de acupunctura aumento da eficiência de transfecção (Figura 3B). Por analogia de protocolo microdispersão em que múltiplas perfurações com a pistola de tatuagem 11, DNA de plasmídeo entregue-acufection é provavelmente facilitada através da raspagem da membrana celular de queratinócitos e folículos de cabelo 19, 20. As estimulações de epiderme por remoção do cabelo, reagente depilating e oscilação agulha pode induzir a activação de queratinócitos em certa medida, e aumentar ainda mais a absorção de ADN de Langerhans e DCs 6. Uma limitação deste protocolo é que a quantidade de ADN de plasmeo retomadopor células não pode ser controlada com precisão. Não sugerimos usar este método para tratar uma área de pele de grande porte. Para minimizar as variações nos níveis do gene entregue entre experiências de expressão, o volume da solução de DNA e o tamanho da superfície da pele alvo deve ser corrigido para o mesmo conjunto de experiências. Para gerar resultados reprodutíveis, é aconselhável que as experiências em replicado estão a ser realizadas pelo mesmo indivíduo.
Com respeito ao dispositivo de pistola de genes e microdispersão, o uso de um feixe de agulhas de acupunctura para entregar ADN nu é barato. Os procedimentos também são simples. Ela exige muito pouca experiência técnica para seguir o protocolo acufection. Acufection provoca trauma mínimo para os animais e sem perda de peso é encontrado após a operação. O nível de dor é baixo, como avaliado pela ausência da mudança de comportamento significativo após a operação acufection.
Em resumo, usando agulhas de acupuntura para soltar acamada córnea da pele para a incorporação de ADN pelas células hospedeiras proporciona um método alternativa económica para expressar uma proteína na pele do rato. Um largo espectro de genes imuno-relacionados têm ainda de ser funcionalmente caracterizado pelo revestimento 21, e este facto evidencia a necessidade de um rápido estudo de um novo gene na pele. Empregando este método, pode-se facilmente determinar se o produto do gene de interesse tem qualquer função de novo. Este protocolo acufection proporciona uma ferramenta conveniente e praticável para novas descobertas na modulação da resposta imune para curar a doença cutânea.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo subsídio do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Agradecemos Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee em NTU, Leigh Zerboni na Universidade de Stanford e Dr. Peter Hoffmann, da Universidade do Havaí para a leitura do manuscrito, Yun Chien em NTU para assistência técnica, e Dr. Wen-Chi Wei na Agricultura Biotecnologia Centro de pesquisa da Academia Sinica para aconselhamento técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
