Summary
Dit protocol is een kosteneffectief alternatief voor expressie van naakt plasmide DNA in muizenhuid. Het algemene doel van het protocol is immuun-gerelateerde genen in huidweefsel aan de functionele rol van een specifiek gen in huidontsteking bakenen.
Abstract
Ontregeling van de immuunrespons in de huid wordt in verband gebracht met tal van menselijke huid aandoeningen. Rechtstreekse overdracht van immuun-gerelateerde genen in huidweefsel is een fascinerende benadering van immuunmodulatie van cutane ontsteking in muismodellen van ziekten bij de mens te onderzoeken. Hier presenteren we een kosteneffectieve protocol dat naakt DNA in muizenhuid geleverd en leidt tot transgenexpressie. De werkwijze is bedacht "acufection", duidt acu-lek gemedieerde DNA-trans fection. Acufection te voeren, werd muizenhuid eerst toegediend met DNA in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en daarna licht geprikt met een bundel acupunctuurnaalden om de absorptie van DNA en transfectie in cellen te vergemakkelijken. Het plasmide DNA wordt vermoedelijk door de keratinocyten en dendritische cellen (DC's) in de huid genomen en expressie gebracht eiwit. Mechanische prik met de naalden op zich niet leiden tot beschadiging van de huid of induceren keratinocyten activering. De uitdrukkingvan de getransfecteerde genen gedetecteerd in de huid zowel transcriptionele en translationele niveaus na acufection gedurende 2 dagen en onderhouden tot 7 dagen. De primaire doelstelling van de ontwikkeling van deze acufection methode was een niet eerder gedefinieerd isovorm van IL-15 te onderzoeken. Met deze werkwijze wordt een alternatief gesplitste IL-15 isovorm met gedeeltelijk verwijderde exon 7 (IL-15ΔE7) werd tot expressie gebracht in de huid en vervolgens behandeld met een Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), ontsteking veroorzaken. -Acufection geleverd IL-15ΔE7 huid onderdrukte proliferatie van keratinocyten, epidermale dikte en rekrutering van neutrofielen in IMQ geïnduceerde huidontsteking. Met de toenemende belangstelling voor het identificeren van de regulerende mechanismen van huidontsteking, het protocol beschreven verschaft een kosteneffectieve en veelzijdig alternatief voor gen kanonsysteem of microzaaien voor DNA afgifte in vivo. Het kan mogelijk maken ontdekking van de functie van een nieuwgen in de huid of voor het onderzoeken van nieuwe behandeling van huidziekten.
Introduction
Skin is de eerste verdedigingslinie van het lichaam. Keratinocyten (KCS) zijn het belangrijkste celtype in de huid van mensen en muizen. In reactie op prikkels uit de omgeving (bijvoorbeeld zonlicht, zuurstof, chemicaliën en pathogene invasie) worden KCS geactiveerd en produceren een breed scala van pro-inflammatoire cytokines en chemokines zoals IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α en GM-CSF 1. Samen leiden zij de rekrutering van immuuncellen op de huid. Verergerd huidontsteking wordt vaak geassocieerd met talrijke menselijke ziekten, waaronder acute ectopische contact dermatitis en chronische T-cel gemedieerde inflammatie (zoals allergische contact dermatitis en psoriasis) 2. Modulerend pro-inflammatoire reacties in de huid door remming KC activering aannemelijk benadering voor de behandeling van huidontsteking. Dit protocol beschrijft een nieuwe benadering van een cytokine gen in de epidermis transiënte expressie te brengen om immune res bestuderenPonse voortvloeiend uit dergelijke behandeling in de huid.
De epidermis componeert de meest oppervlakkige laag van de huid. Het dient als een fysieke barrière houden externe stoffen zoals nucleïnezuren en pathogenen die in de diepere lagen van de huid. Verschillende naaldvrije technieken zijn vastgesteld voor epidermale DNA-overdracht 3, 4. DNA in oplossing of in verband met kationische liposomen of adenovirusvectoren is rechtstreeks op de epidermis gemodificeerd met technieken zoals het verwijderen van het stratum corneum of de behandeling met reagens ontharen. Verwijdering van de verhoornde epitheel vergemakkelijkt DNA die de epidermale barrière en interactie met keratinocyten en Langerhans cellen immuunresponsen 5 induceren. Terwijl een groot oppervlak is beschikbaar voor DNA-overdracht en deze aanpak niet naalden te betrekken, zijn er nadelen, waaronder de eisde grote hoeveelheden DNA (10-100 ug), harde behandeling van de huid door strippen en inconsistente resultaten in het induceren van immunologische respons in de geïmmuniseerde dieren zonder DNA afgifte booster 6. Micropartikels gemedieerde intracellulaire afgifte van naakt DNA aan de huid is getoond zeer efficiënt en reproduceerbaar is voor het induceren immuunreactie 7, 8 zijn. Een draagbare genpistool werd gebruikt om de huid doelwitplaats met plasmide-DNA beklede gouddeeltjes 2 urn diameter in grootte door middel van stromend helium luchtstroom 9 bombarderen. Het plasmide DNA wordt vermoedelijk door KCsand dendritische cellen (DC's) die in de huid en het eiwit tot expressie lokaal of transport naar drainerende lymfeknopen door DCs 10. Hoewel het gen pistool systeem is eenvoudig en vereist beperkte technische ervaring, de kosten voor de voorbereiding en het leveren van de "DNA bullet "(dat wil zeggen goud poeders, helium gas) en het genenpistool zelf is van algemene toepassing beperkt. Bovendien is de eis van een heliumgas afgiftesysteem beperkt de gemakkelijke gengeweer transport wanneer de proeven op verschillende plaatsen worden uitgevoerd. microzaaien aangetoond is dat een hogere efficiëntie van genoverdracht dan enkele injectie en deeltjesbombardement 11 bereiken. microzaaien gebruikt een tatoegeringskanon om DNA te leveren aan de huid zonder het gebruik van deeltjes kralen 11. Oscillerende de micronaalden op de huid met behulp van deze benadering waarschijnlijk direct schrapen het celmembraan en daardoor overdragen DNA om meerdere cellen tegelijk. echter, pijn bij het grote aantal injecties met 0,254 mm diameter naalden nadeel.
Hier geven we een alternatieve benadering van DNA-afgifte in vivo. De "acufection" 12. Terwijl acufection blijkt te zijn een gemakkelijke en minder dema zijnnding werkwijze voor DNA afgifte in vivo, de optimale hoeveelheid DNA voor verschillende genen en de tijd op de huid prikken moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vrouwelijke muizen met 8 - 12 weken oud werden gebruikt voor deze studie. C57 / BL6 wildtype (WT) en IL-15 deficiënte (IL-15 - / -) muizen werden gekocht bij National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan en Taconic Farm resp. IL-15-deficiënte (IL-15 - / -) en IL-15-dominante (+/- IL15 en IL15 + / +) toonde een 1: 3 verhouding in de tweede generatie van het kruis van IL-15 +/- heterozygoten. Het genotype van IL-15 - / - muizen werd bevestigd door PCR-analyse. De muizen werden in de specifiek pathogeenvrije (SPF) faciliteit in Laboratory Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine onderhouden. Alle dierlijke procedures inclusief de verdoving materialen en methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met het dier protocol door de National Taiwan University College of Medicine en het College van Volksgezondheid Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) (beëdigde verklaring van goedkeuring van Animal Protocol 20.130.225) goedgekeurd.
<p class = "jove_title"> 1. Bereiding van AcupunctuurnaaldenOPMERKING: Acupunctuurnaalden zijn medische hulpmiddelen bestaan uit een handgreep en een naalduiteinde (Figuur 1A). De diameters van de acupunctuurnaald varieerden van 0,2 mm (36 G) tot 0,35 mm (28 G). Wij selecteren de beste punt van de naald om mogelijke overmatige celbeschadiging tijdens het prikken van de huid te voorkomen. Er zijn 4 verschillende lengten van de naald 0,2 mm, waarvan 13 mm (0,5 inch), 25 mm (1,0 inch), 40 mm (1,5 in) en 50 mm (2,0 in) lang. Een bundel van 10 naalden met een lengte van 13 mm aangebracht de beste optimale grip oscilleren van de naald op C57BL / 6 muizen huid. De parameters kunnen worden aangepast indien de werkwijze wordt toegepast op de huid van grotere dieren of uitgevoerd door onderzoekers met grotere handen.
- Verwijderen acupunctuurnaalden uit de steriele, pyrogeenvrije pakket. Plaats de naalden op een steriel laken.
- -Haft labeling tape 10 naalden samenbinden ina bundel (Figuur 1B).
OPMERKING: De naalden 10 zijn geometrisch ingericht om een cilindervorm te vormen. Gebruik bij voorkeur een stuk paraffinefilm de inrichting te stabiliseren voordat het kleefband. Zorg ervoor dat alle de naald punten zijn op hetzelfde vlak. Met behulp van een bundel in plaats van een enkele naald vergemakkelijkt maximale DNA infusie door het vergroten van het contactoppervlak tussen de naalden en de huid.
2. Bereiding van een grote hoeveelheid en endotoxine-vrij plasmide DNA
- Transformatie chemisch competente bacteriële cellen met het plasmide-DNA.
- Selecteren en beënt een bacteriekolonie in 3 ml LB medium met antibiotica en incubeer bij 37 ° C in een schudder overnacht.
- Schaal van de cultuur door het verdunnen van de bacteriecultuur 1: 100 in 250 ml LB-medium met antibiotica en schudden overnacht bij 37 ° C
- Bereid een grote hoeveelheid DNA met een hoog quality, endotoxine plasmideselectie voorbereiding kit volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Acufection protocol vereist hoge zuiverheid en een grote hoeveelheid plasmide-DNA. Gebruik van een hoge kwaliteit, wordt endotoxine vrij en kolom gezuiverd plasmide-DNA aanbevolen. - Elueer DNA in steriel water. WINKEL DNA in kleine porties bij -20 ° C tot gereed voor acufection.
LET OP: Vermijd herhaalde vries-en-dooi van DNA om consistente plasmide DNA meningsuiting te waarborgen. - Verdun plasmide DNA tot 1 mg / ml in steriel PBS gedurende acufection.
3. Procedure voor Acufection
OPMERKING: De optimale hoeveelheid DNA en het gebied van het doel huidoppervlak is afhankelijk van de genen en moeten verder worden geoptimaliseerd. Prikken kracht en het aantal keren los de hoornlaag van de huid kan ook variëren afhankelijk van de huiddikte. Dienen zorgvuldig te worden bepaald na evaluatie van het expressieniveau van genen acufected transcripts door qRT-PCR.
- Weeg de muizen en dienen tribroomethanol (400 ug per gram lichaamsgewicht) door peritoneale injectie.
OPMERKING: 2,2,2-tribroomethanol is een injecteerbaar anestheticum dat gewoonlijk gebruikt in muizen. Oplossingen worden bereid door het oplossen van een niet-farmaceutische kwaliteit 2,2,2-tribroomethanol (2,5 g) in gedestilleerd water (200 ml) die 2,5% 2-methyl-2-butanol. - Gebruik dierenarts oogheelkundige zalf op de ogen tot droog onder narcose te voorkomen.
OPMERKING: verdovend effect wordt opgewekt in 1-2 min. Controleer de teen knijpen reflex om voldoende diepte van de anesthesie voor de operatie te verzekeren. - Scheer de dorsale flank huid en toepassing ontharingscrème op keratineproteïnen oplossen in de haarschacht.
LET OP: Het gebruik van ontharingscrème om haar te verwijderen zal infusie van DNA in de huid te vergemakkelijken. - Gebruik water doordrenkte watten af te vegen de ontharingscrème.
Attentie: de ontharingscrème is oplosbaar in water. Volledige verwijdering van de crème will voorkomen dat een vettige ondergrond en zorgen voor een betere prikken resultaat. - Gebruik een steriel wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol om het huidoppervlak te desinfecteren.
- Markeer het doelgebied (1 cm x 1 cm) op de onthaarde huid met een afgemeten stencil. LET OP: Het merken van de doellocatie zal helpen om de naald bundel van toepassing up-and-down binnen een afgebakend gebied. Dit is belangrijk om de levering van dezelfde hoeveelheid DNA waarborgen een specifiek oppervlak tot experiment te experimentvariant minimaliseren.
- Plaats een 10 ul druppel plasmide-DNA (10 ug) op de gemarkeerde huid.
OPMERKING: De hoeveelheid DNA voor acufection varieert met verschillende genen en het type expressievector. De hoeveelheid DNA gebruikt moet zorgvuldig worden getitreerd voor het uitvoeren van het experiment van belang. De 10 pl is een klein vloeistofdruppel en het ligt goed op de geschoren en onthaard huid zonder afrollen tijdens het prikken. Omvatten een controlegroep van muizen behandeld met 10 uL lege vector-DNA te vergelijken met een muizencufected de studie gen. - Houd de acupunctuurnaald bundel (Figuur 1B) en prik het gemarkeerde oppervlak met een op en neer gaande beweging voor 100 keer of tot het vochtgehalte van DNA in PBS op de huid verdwijnt. OPMERKING: Sommige roodheid van de huid oppervlak kan optreden. Vermijd het maken van diepe sneden dat bloedt. Het aantal op- en neer bewegingen prikken op het huidoppervlak wordt functioneel bepaald wanneer het vocht van DNA in PBS (10 pl) verdwijnt op de huid. We besloten om 100 keer in 30 s, omdat het de meest consistente resultaten uit acufection geleverd genen heeft gegeven. Eventueel kunnen de naalden worden hergebruikt voor maximaal 6 doelhuid prikt (1 cm x 1 cm elk). Spoel de naalden in 70% ethanol en PBS tussen acufection. Wissel naar nieuwe naalden wanneer ze saai of voor verschillende plasmide-DNA om kruisbesmetting te voorkomen.
- Plaats acufected muizen op een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur te handhaven tot wakker.
- Terug muizen om hun kooi als zeweer voldoende bewustzijn. Opmerking: Houd acufected muizen in afzonderlijke kooi (minder dan 5 dieren per kooi) van de kooi-un acufected muizen.
- Zet waterfles plaats en zet de kooi naar de IVC (individueel geventileerde kooi) rek.
4. Post-operatieve Zorg
- Voor de eerste 48 uur na de procedure nauwlettend muizenmaagjes ongemak zoals gedragsveranderingen (rusteloosheid, agitatie of eetstoornis) of afwijking vertoont (ruwe vacht of gebogen houding).
5. Imiquimod (IMQ) Behandeling van IL-15ΔE7-acufected Skin
OPMERKING: Transcriptionele expressie en eiwitproductie van acufected gen detecteerbaar op dag 3. Muizen acufected met plasmide plaats kan worden behandeld met verschillende stimulerende 3 dagen na transfectie. We illustreren hier door het behandelen van de IL-15ΔE7-acufected huid van muizen met IMQ crème. IMQ een imidazoquinolin amine goedgekeurd fof de behandeling van externe genitale en perinatale wratten 13. Topische behandeling IMQ is aangetoond dat humane psoriasis-achtige huidaandoeningen bij de muis met de manifestatie van schilferige huid, epidermale proliferatie en dermale neutrofielinfiltratie 12, 14, 15.
OPMERKING: De plasmidevector bevat full-length muis IL-15 cDNA gereguleerd door elongatie factor-1 α (pEF), geflankeerd door een IL-2 signaalpeptide en een FLAG-vlag aan de C-terminus (pEF-IL- 15, 5859 basenparen), die werd geconstrueerd zoals beschreven door Bamford et al. 16. Het plasmide wordt gebruikt als een IL-15 matrijs voor de eerste 16 aminozuren verwijderen bij resten 33-48 in exon 7 van het IL-15 gen voor IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5811 baseparen) van SOE (synthese door overlappende extensie) PCR methode 17. Bacteriële kolonies die succesvol warengetransformeerd met IL-15ΔE7 werden geverifieerd door restrictie-enzymdigestie, gevolgd door DNA-sequentiebepaling 12, 18. Een grote hoeveelheid endotoxine-vrij plasmide-DNA werd bereid zoals beschreven in het protocol stap 2.
- Verdoven acufected muizen door intraperitoneale injectie van tribroomethanol (400 ug per gram lichaamsgewicht) en breng vet oogheelkundige zalf op de ogen tot droog onder narcose voorkomen. Controleer de teen knijpen reflex om voldoende diepte van de anesthesie te verzekeren voor de start van de operatieve procedures. OPMERKING: Aangezien een 2 cm x 2 cm huid zullen gedurende IMQ wordt 2 doses pIL-15ΔE7 plasmide-DNA (10 pg in 10 pi PBS per dosis) acufected on 2 doelwitplaatsen (1 cm x 1 cm elk).
- Mark flankeren skin (2 cm x 2 cm) die het acufected gebied.
- Gebruik wattenstaafje applicator topisch toepassen IMQ crème op het gemarkeerde oppervlak. Opmerking: stap 5.1 wordt alleen de eerste dosis (60 mg / dosis) uitgevoerd.De volgende opeenvolgende doses worden toegepast op niet-verdoofde muizen.
- Documenteer de veranderingen van IMQ-behandelde dorsale huid dagelijks met een high definition camcorder. Opmerking: Een persoon houdt de muis terwijl een ander opneemt. Stilstaande beelden zijn geschoten en bewerkt op een later tijdstip.
- Euthanaseren muizen door het injecteren van een overdosis tribroomethanol (800 ug per gram lichaamsgewicht) gevolgd door cervicale dislocatie op dag 4 en dag 7 na IMQ behandeling. De huid is uitgesneden en verwerkt (Stappen 4,1-4,5).
6. Homogenaat of Mouse Skin
- Met een paar chirurgische schaar om een horizontale snede van de basis van de staart te maken. Overgaan bilateraal aan de basis van de achterpoot en blijven die verticaal langs de flank aan de basis van de voorpoot.
- Zorgvuldig schil de huid van het onderliggende weefsel van posterior naar de voorste. Gebruik de schaar om de dorsale huid af te snijden. Plaats de huid op een steriele petrischaal.
- Gebruik een scalpel om doelwit te snijdenhuid en bevriezen onmiddellijk in vloeibare stikstof. Opmerking: Dezelfde afmeting van acufected huid zonder (1 cm x 1 cm) of IMQ behandeling (2 cm x 2 cm) wordt voor elke muis experiment tot experiment variaties te minimaliseren.
- Plaats de bevroren huidweefsel in het midden van een pre-gekoelde 2-vaks mortel met handvatten en een stamper. Gebruik een leiding hamer op de mortel op het weefsel te verpulveren.
- Plaats snel de verpulverde weefsel naar een nieuwe buis met 500 ui cellysisreagens voor RNA extractie of een buisje dat 50 ui PBS en 1 x proteaseremmer cocktail eiwitlysaat verkrijgen.
7. H & E en immunohistochemische kleuring van buitenhuiddeel
- Plaats het huidweefsel in een cassette en dompel dit in 4% paraformaldehyde gedurende de nacht.
- Embed en weefsel sectie, die in ons geval werd uitgevoerd door het Pathology Laboratory van de LAC, NTU. Opmerking: Het gedeelte is gesneden in een dikte van 5 urn. Plaats weefsel sections op positief geladen dia's.
- Verhit de objectglaasjes bij 65 ° C gedurende 15 minuten.
- Plaats de dia's in een kleuring rack. Dompel het rek in corresponderende tank met xyleen vervanging van 5 minuten tweemaal gevolgd door achtereenvolgende onderdompeling in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% en 50% ethanol (5 min elk) voor rehydratatie. Dompel de dia's in leidingwater gedurende 3 minuten voor kleuring.
- Voer hematoxyline en eosine. Opmerking: H & E kleuring werd uitgevoerd op verzoek verkrijgbaar bij Pathology Laboratory van de LAC, NTU.
- Voor immunohistochemische kleuring, blokkeren de sectie met blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 min niet-specifieke achtergrondkleuring te verminderen. Opmerking: De blokkade oplossing wordt commercieel ontwikkeld met immunokleuring technieken. Geen enkel dier serum is opgenomen in dit artikel.
- Dompel de dia in PBS te spoelen het blok oplossing.
- Verdun het blok in PBS om 1:10 en voeg 2% foetaal runderserum (FBS) (verdunningsoplossing).
- Vlek één seriële sectie in dezelfde doorgang met dezelfde oplossing weglaten van het primaire antilichaam om te controleren op niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam.
8. Foto en analyse van gekleurde weefselsectie sectie
- Visualiseren H & E gekleurde en IHC weefselcoupes onder een helderveld microscoop. Maak foto behulp ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera op de microscoop. voor qKWANTITATIEVE analyse kunnen imaging software worden gebruikt
- Scan de hele gekleurde secties met behulp van een scanscope met een 20X objectief.
- Meet de epidermale dikte minder dan 1 mm segment van de epidermis en tel het aantal Ki67-immuunreactieve cellen in het segment.
OPMERKING: Kwantitatieve analyse wordt uitgevoerd met behulp van microscopie automatisering en software voor beeldanalyse. Epidermale dikte wordt bepaald door de afstand tussen de basale laag en de buitenste laag van de epidermis. - Tel het aantal Ly6G-immuunreactieve cellen in het dermale gebied (230 x 270 pm2 rechthoek) direct onder topische IMQ behandelde huid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Terwijl sommige roodheid was duidelijk binnen het eerste uur na prikken met acupunctuurnaalden, de huid gewist op dag 2 en geen negatieve huidreactie tot dag 7 waargenomen na prikken (figuur 2A). Naald prikken geïnduceerde zeer lage orthokeratosis epidermale en dermale minimale infiltratie door H & E analyse vergeleken met onbehandelde huid (Figuur 2B). De epidermale dikte (figuur 2C) en het aantal Ki67 + cellen (Figuur 2D) waren vergelijkbaar naald geprikt en onbehandelde huid, waaruit blijkt dat acupunctuur naald geprikt huid heeft merkbaar weefselverstoring of cellulaire proliferatie in de epidermis veroorzaakt. Vergeleken met de naald (1,067 mm) 12, prikken met acupunctuurnaalden induceerde minder intensieve uitingen van chemokine CXCL1 en pro-inflammatoire cytokine IL-6 op dag 2 die verder af op dag 5 (Figuur 3A). Om de expressie van het transgen in acufected muizenhuid valideren, een plasmide dat IL-15 cDNA werd acufected in de huid van IL-15-deficiënte C57BL / 6 (IL-15 KO) muizen. Hoewel lage niveaus van transcriptie van DNA in plasmide acufected onthaarde huid werden waargenomen trilling met acupunctuurnaalden verhoogde het niveau van gentranscriptie (Figuur 3B). IL-15 productie werd waargenomen op dag 2 en bleef stabiel tot dag 7 (Figuur 3C). Deze resultaten demonstreren dat acufection effectief doordringt het plasmide-DNA en maakt de expressie van het gecodeerde eiwit in de huid zonder dat buitenmatige activering keratinocyten.
WT-muizen werden acufected met een plasmide dat codeert voor IL-15ΔE7. Muizen IL-expressie 15ΔE7 mRNA en het eiwit tot 3dagen na transfectie (Figuur 4A). De muizen werden vervolgens topisch behandeld met IMQ room op dag 3. Hoewel behandeling IMQ geïnduceerd zilveren vlokken controle WT-muizen, IMQ geïnduceerde zilveren vlokken werden verlaagd bij IL-15ΔE7 acufected WT-muizen (Figuur 4B). Interessant expressie van IL-acufected 15ΔE7 remde significant Ly6G + neutrofiel infiltratie in IMQ-behandelde huid tegen unacufected WT huid (Figuur 4C) 12. Door acufection, we aangetoond dat de nieuwe functie van IL-15ΔE7 in de huid. IL-15ΔE7 moduleert IMQ-inducerende neutrofielen infiltratie.
Figuur 1. Illustratie van acupunctuur naalden. (A) De acupunctuurnaald (36 G x 0,5" ) bestaat uit eenbehandelen en naaldeinde. (B) Ten acupunctuurnaalden zijn gebonden in een bundel met behulp plakband. De lengte van de bundel ongeveer 4 cm zoals gemeten met de liniaal (onderste paneel). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Prikken door Acupunctuurnaalden veroorzaakt geen merkbare beschadiging van de huid of Keratinocyte Activation. (A) Triple plaatsen gemarkeerde grijze vierkanten op de geschoren en onthaard flank huid van de muis werd 100 keer per geprikt door acupunctuurnaalden. Foto's werden genomen op het eerste uur en tot 7 dagen na het prikken om de beschadiging van de huid te controleren. Geschoren en onthaard huid zonder naald prikken werd gebruikt als controle. <strong> (B) H & E analyse van met formaline gefixeerd in paraffine ingebedde coupes van onbehandelde huid of naald geprikt muizenhuid. Schaal bar: 100 urn. (C) één millimeter segment van H & E gekleurde coupes van onbehandelde of naaldvrije geprikte muizenhuid werd geselecteerd voor het meten van de epidermale dikte (de afstand van basale tot de buitenste laag). Elke staaf stelt het gemiddelde van de epidermale dikte gemeten vanaf 3 huidsecties. Fout staaf vertegenwoordigt de standaard fout van het gemiddelde (SEM). De betekenis van het verschil tussen de groepen werd getest door t-test ongepaarde Student's. (D) Seriële secties van dezelfde monsters werden gekleurd met anti-Ki67 voor immunohistochemische analyse. Elke staaf stelt het gemiddelde van Ki67 + cellen gelokaliseerd in elke 150 urn epidermis lengte per segment 1 mm. Fout staaf vertegenwoordigt de standaard fout van het gemiddelde (SEM). De significantie van verschillen tussen groepen werd getest door tweeweg ANOVA follverschuldigd door post hoc-test Bonferroni's. (Ns: niet significant). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Acufection spreekt Effectief het eiwit van belang, zonder dat Merkbaar Keratinocyte Activation. (A) geschoren en onthaard flank huid werd onbehandeld gelaten (NTC), schuren met 1,067 mm diameter (19 G) injectienaald (Syr.) Of prikkelend 100 maal het acupunctuurnaalden (Acu.). De transcriptionele niveaus van CXCL-1 en IL-6 op dag 2 en dag 5 werden gemeten met qRT-PCR (n = 3). (B) geschoren en onthaard huid van IL-15-deficiënte muizen werd topisch aangebracht met een druppel van een plasmide DNA dat IL-15 without (ontharen) of met acupunctuur naald prikken (ontharen + prik). Transcriptie van IL-15 in elke groep op dag 2 werd gemeten met TaqMan qRT-PCR. Transcriptie van IL-15 was detecteerbaar in PBS controle (NTC) of IL-15-deficiënte muizen. (C) IL-15 productie van IL-15-deficiënte muizen onbehandeld of huid die werd IL-15-acufected voor verschillende dagen (één weefsel per dag) werden gemeten met IL-15 ELISA. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Demonstratie van IL-15ΔE7 Verzwakt IMQ-geïnduceerde zilverachtige schilferige huid en remt de infiltratie van neutrofielen. (A) Het transcriptieniveau en eiwitproductie van IL-15ΔE7-acufected (WT / pIL-15 [6; E7) of lege vector controle (WT / pEmpty) huid werden gemeten met qRT-PCR en ELISA (n = 2, elk tijdspunt), respectievelijk. (B) Lege vector- of IL-15ΔE7-acufected flank huid op dag 3 werd topisch behandeld met IMQ room (60 mg). Foto WT / WT pEmpty en / pIL-15ΔE7 muis flank op dag 6 na IMQ behandeling. (C) Skin coupes van WT / pEmpty of WT / pIL-15ΔE7 muizen na IMQ behandeling op dagen 3 en 6 werden gekleurd met anti-antilichaam en Ly6G opgesomd. Elke staaf stelt het gemiddelde van Ly6G + cellen van 4-IMQ behandelde muizen. Fout staaf vertegenwoordigt de standaard fout van het gemiddelde (SEM). De betekenis van het verschil tussen de groepen werd getest door twee-way ANOVA gevolgd door post hoc-test Bonferroni's. Panelen A en C worden aangepast met toestemming van het Journal of Investigative Dermatology, licentienummer 3901890227597. Klikhier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stap om de expressie van het plasmide-DNA acufected waarborgen is gelijkmatig oscilleren en draai de hoornlaag van de huid. Terwijl zachtjes duwen de naald zonder dat de huid, moet de kracht hard genoeg om het oppervlak te drukken. Absorptie van DNA in 10 ui oplossing op een 1 cm x 1 cm oppervlak te vergemakkelijken moet de naalden oscilleren op en neer ongeveer 100 keer 30 seconden. Men kan de kracht die moet de huid prikken bepalen en door vaststellend het aantal keren dat nodig is om de beste expressieniveau van het gen acufected verkregen.
Modificatie van de hoeveelheid plasmide DNA toegepast op een bevredigend niveau van expressie te bereiken na acufection kan nodig zijn omdat het kan variëren voor verschillende genen. Titratie experimenten worden uitgevoerd ter bepaling van de optimale hoeveelheid plasmide-DNA worden toegepast voor het experiment ook. De resultaten van kwantitatieve RT-PCR analyse zal helpen om de o te bepalenptimale hoeveelheid plasmide-DNA en het beste conditie om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Het precieze mechanisme van de acufection werkwijze nog worden opgehelderd. Terwijl transcriptie van topisch afgegeven plasmide DNA zich in geschoren en onthaard huid op laag niveau, prikken door acupunctuurnaalden verhoogde transfectie-efficiëntie (Figuur 3B). Naar analogie van microzaaien protocol waarin meerdere perforaties met tatoegeringskanon 11 wordt geleverd acufection-plasmide-DNA waarschijnlijk vergemakkelijkt door het schrapen van het celmembraan van keratinocyten en haarfollikels 19, 20. Stimulaties van de epidermis ontharing, epileren reagens en naald oscillatie keratinocyten te induceren enigszins en verdere versterking DNA-opname door Langerhans en 6 DCs. Een beperking van dit protocol is dat de hoeveelheid plasmide-DNA opgenomendoor cellen niet nauwkeurig geregeld worden. We bedoelen niet dat het gebruik van deze methode om een groot huidoppervlak te behandelen. Variaties in de expressieniveaus van het afgeleverde gen tussen experimenten te minimaliseren, moet het volume van de DNA-oplossing en de afmeting van het doel huidoppervlak worden vastgesteld voor dezelfde reeks experimenten. Om reproduceerbare resultaten te genereren, is het raadzaam dat herhaalde experimenten moeten worden uitgevoerd door dezelfde persoon.
Wat de genenkanonapparaat en microzaaien, het gebruik van een bundel acupunctuurnaalden leveren naakt DNA is goedkoop. De procedures zijn ook eenvoudig. Het vereist zeer weinig technische ervaring om de acufection protocol te volgen. Acufection veroorzaakt minimaal trauma voor dieren en geen gewichtsverlies wordt gevonden na de operatie. Het niveau van de pijn is laag als beoordeeld door de afwezigheid van significante gedragsverandering na acufection operatie.
Kortom, het gebruik van acupunctuurnaalden om de loshoornlaag van de huid voor DNA-opname door gastheercellen verschaft een voordelige alternatieve werkwijze om een eiwit in de huid van muizen tot expressie. Een breed spectrum van immuungerelateerde genen nog niet functioneel gekarakteriseerd in de huid 21, en dit benadrukt de behoefte aan een snelle studie van een nieuw gen op de huid. Gebruikmakend van deze werkwijze kan men gemakkelijk bepalen of het product van het gen van belang heeft elke nieuwe functie. Dit acufection protocol biedt een gemakkelijke en haalbaar kan zijn voor nieuwe ontdekkingen in het moduleren van immuunreactie op cutane ziekte te genezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële belangen te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidie van het ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Wij danken Drs. Betty Wu-Hsieh en Chien-Kuo Lee bij NTU, Leigh Zerboni aan de Stanford University en Dr. Peter Hoffmann aan de Universiteit van Hawaii voor het lezen van het manuscript, Yun Chien bij NTU voor technische bijstand, en Dr Wen-Chi Wei op landbouw biotechnologie Research Center bij Academia Sinica voor technisch advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
