Summary
Questo protocollo è un'alternativa economica per esprimere il DNA plasmidico nudo in pelle topo. L'obiettivo generale del protocollo è quello di consegnare i geni immuno-correlati nel tessuto della pelle di delineare il ruolo funzionale di un gene specifico in infiammazione cutanea.
Abstract
Disregolazione della risposta immunitaria in pelle è associata a numerosi disturbi della pelle umana. Trasferimento diretto dei geni immuno-correlati nel tessuto della pelle è un approccio interessante per indagare la modulazione immunitaria di infiammazione cutanea in modelli murini di malattie umane. Qui vi presentiamo un protocollo costo-efficacia che ha trasportato DNA nudo in pelle mouse e porta alla espressione del transgene. Il metodo è coniato "acufection", che denota acu DNA puntura mediata fection trans. Per eseguire acufection, pelle di topo è stato infuso con il DNA in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi punge leggermente con un fascio di aghi per favorire l'assorbimento di DNA e trasfezione in cellule. Il DNA plasmidico è presumibilmente occupato da cheratinociti e cellule dendritiche (DC) nella pelle ed espresso in proteine. Puntura meccanico con il aghi per sé non ha causato danni alla pelle o indurre attivazione dei cheratinociti. L'espressionedei geni trasfettati è stato rilevato nella pelle sia a livello trascrizionale e traslazionale seguenti acufection per 2 giorni e mantenuto fino a 7 giorni. L'obiettivo primario per lo sviluppo di questo metodo acufection è stato quello di indagare su un'isoforma precedenza indefinito di IL-15. Usando questo metodo, un splicing alternativo IL-15 isoforma con parzialmente eliminato esone 7 (IL-15ΔE7) è stata espressa nella pelle e successivamente trattati con un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), per indurre infiammazione. Acufection consegnate IL-15ΔE7 in pelle soppressa proliferazione dei cheratinociti, spessore epidermico e il reclutamento di neutrofili nell'infiammazione cutanea IMQ-indotta. Con crescente interesse nell'identificazione dei meccanismi regolatori di infiammazione cutanea, il protocollo qui descritto fornisce un costo alternativo efficace e versatile al cannone gene o microseeding per la consegna del DNA in vivo. Essa può consentire potenzialmente scoperta della funzione di un romanzogene in pelle o per indagare nuovo trattamento per le malattie cutanee.
Introduction
La pelle è la prima linea di difesa ospite. Cheratinociti (KC) sono il tipo di cellula importante nella pelle degli esseri umani e topi. In risposta a stimoli ambientali (per esempio luce solare, ossigeno, prodotti chimici e invasione patogeni), KC sono attivati e produrre una vasta gamma di citochine proinfiammatorie e chemochine, quali IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α e GM-CSF 1. Insieme innescano il reclutamento di cellule immunitarie per la pelle. Infiammazione cutanea aggravata è spesso associata a numerose malattie umane compresi dermatite da contatto ectopica acuta e l'infiammazione mediata da cellule T cronica (es dermatite allergica da contatto e psoriasi) 2. Modulando risposte proinfiammatorie nella pelle inibendo l'attivazione KC è un approccio plausibile per trattare l'infiammazione cutanea. Questo protocollo descrive un nuovo approccio per esprimere transitoriamente un gene citochina nell'epidermide per studiare res immunitarioponse conseguenti ad un tale trattamento nella pelle.
L'epidermide compone lo strato più superficiale della pelle. Essa funge da barriera fisica mantenendo sostanze esterne come acidi nucleici e patogeni di entrare negli strati più profondi della pelle. Diverse tecniche senza ago sono stati stabiliti per il trasferimento epidermica DNA 3, 4. DNA in soluzione o associata con liposomi cationici o vettori di adenovirus è stata applicata direttamente alla epidermide modificati con tecniche come la rimozione dello strato corneo o il trattamento con il reagente depilazione. Rimozione dell'epitelio corneo facilita DNA attraversare la barriera epidermica e l'interazione con cheratinociti e cellule di Langerhans per indurre risposte immunitarie 5. Mentre una grande area di superficie disponibile per il trasferimento di DNA e questo approccio non comporta aghi, ci sono svantaggi tra cui il requisitoper le grandi quantità di DNA periodo (10 - 100 pg), trattamento duro sulla pelle di strippaggio, ei risultati inconsistenti nell'indurre risposta immunitaria negli animali immunizzati senza consegna DNA richiamo 6. Consegna intracellulare microparticelle mediata da DNA nudo alla pelle ha dimostrato di essere altamente efficiente e riproducibile per indurre la risposta immunitaria 7, 8. Una pistola gene portatile è stato utilizzato per bombardare sito bersaglio pelle con plasmide particelle d'oro rivestite di DNA 2 micron di diametro di dimensioni per mezzo del flusso d'aria in pressione dell'elio 9. Il DNA plasmidico è presumibilmente assorbito dalle cellule dendritiche (DC) KCsand nella pelle e la proteina è espressa localmente o essere trasportati a linfonodi drenanti dalle DC 10. Anche se il sistema di pistola gene è semplice e non richiede esperienza tecnica limitata, il costo per la preparazione e la consegna dei "bul DNAlet "(cioè polvere d'oro, gas elio) e per la pistola gene stesso ha limitato l'applicazione generale. Inoltre, la necessità di un sistema di erogazione di gas elio limita la facilità di trasporto pistola genica quando gli esperimenti sono condotti in luoghi diversi. Microseeding è stato dimostrato per ottenere una maggiore efficienza del trasferimento genico di singola iniezione e bombardamento di particelle 11. Microseeding utilizza una pistola tatuaggio per consegnare il DNA alla pelle senza l'uso di perline di particelle 11. oscillante i microaghi sulla pelle utilizzando questo approccio rischia di raschiare direttamente la membrana cellulare e quindi trasferire il DNA a più celle contemporaneamente. Tuttavia, il dolore associato con il gran numero di iniezioni con aghi 0,254 mm di diametro è uno svantaggio.
Qui forniamo un approccio alternativo alla consegna del DNA in vivo. Il "acufection" 12. Mentre acufection dimostra di essere un dema facile e menoMetodo nding per la consegna del DNA in vivo, la quantità ottimale di DNA per i diversi geni e le volte per pungere la pelle deve essere attentamente ottimizzata per ottenere risultati riproducibili.
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Protocol
topi femmina a 8 - 12 settimane di età sono stati utilizzati per questo studio. C57 / BL6 wild-type (WT) e IL-15 carente (IL15 - / -) topi sono stati acquistati da National Laboratory Animal Centre (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, rispettivamente. IL-15-deficienti (IL15 - / -) e IL-15-dominante (IL15 +/- e IL15 + / +) hanno mostrato un rapporto 1: 3 nella seconda generazione dalla croce di eterozigoti IL15 +/-. Il genotipo di IL-15 - / - mice è stata confermata da analisi PCR. I topi sono stati mantenuti nella struttura specifico patogeno libero (SPF) presso il Laboratorio Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Tutte le procedure di animali, tra cui i materiali ei metodi di anestesia sono stati eseguiti in conformità con il protocollo degli animali approvato dalla National Taiwan University College of Medicine e al Collegio della sanità pubblica Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) (Dichiarazione giurata di approvazione del protocollo Animal 20.130.225).
<p class = "jove_title"> 1. Preparazione di aghi agopunturaNOTA: Aghi di agopuntura sono dispositivi medici composti da un'impugnatura ed un'estremità dell'ago (Figura 1A). I diametri dell'ago agopuntura variava da 0,2 mm (36 G) a 0,35 mm (28 G). Selezioniamo il punto più fine dell'ago per evitare danni potenziali delle cellule eccessivo durante pungendo la pelle. Ci sono 4 differenti lunghezze dell'ago 0,2 mm di cui 13 mm (0,5 pollici), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 pollici) e 50 mm (2,0 pollici) di lunghezza. Un fascio di 10 aghi con spezzone 13 mm, purché la presa migliore confortevole durante oscillazione dell'ago su C57BL / 6 mouse pelle. I parametri possono essere modificati se il metodo viene applicato sulla pelle di animali più grandi o eseguito da ricercatori con mani più grandi.
- Rimuovere aghi dalla confezione sterile, apirogena. Mettere gli aghi su un telino sterile.
- Usare nastro adesivo per legare l'etichettatura 10 aghi insieme ina fascio (Figura 1B).
NOTA: I 10 aghi sono geometricamente disposti a formare una forma cilindrica. Per comodità, utilizzare un pezzo di parafilm per stabilizzare la disposizione prima di applicare il nastro adesivo. Assicurarsi che tutti i punti di ago sono sullo stesso piano. Utilizzando un fascio invece di un singolo ago facilita infusione DNA massima aumentando l'area di contatto tra gli aghi e la cute.
2. Preparazione di un Importo di grandi dimensioni e privo di endotossine plasmidi DNA
- Trasformare cellule batteriche competenti chimicamente con il DNA plasmidico.
- Selezionare e inoculare una singola colonia batterica in 3 mL di terreno LB contenenti antibiotici e incubare a 37 ° C in un agitatore notte.
- Scalare la cultura diluendo la coltura batterica a 1: 100 a 250 mL di terreno LB con antibiotici e agitazione durante la notte a 37 ° C.
- Preparare una grande quantità di DNA utilizzando un alta quality, endotossine kit di preparazione gratuito plasmide seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: protocollo Acufection richiede un'elevata purezza e una grande quantità di DNA plasmidico. Uso di alta qualità, è consigliabile endotossine e DNA plasmidico purificato colonna. - Eluire il DNA in acqua sterile. DNA Conservare in piccole aliquote a -20 ° C fino al momento acufection.
NOTA: Evitare ripetuti di congelamento e scongelamento del DNA al fine di garantire plasmide di espressione del DNA coerente. - Diluire DNA plasmidico a 1 mg / ml in PBS sterile per acufection.
3. Procedura per Acufection
NOTA: La quantità ottimale di DNA e l'area della superficie della pelle bersaglio può variare per diversi geni e devono essere ulteriormente ottimizzata. La forza spillatura e il numero di volte per disperdere lo strato corneo della pelle può anche variare a seconda dello spessore della pelle. Queste condizioni devono essere determinate con cura dopo aver valutato il livello di espressione del gene transcri acufectedpts da qRT-PCR.
- Pesare i topi e amministrare tribromoethanol (400 ug per peso corporeo gm) mediante iniezione peritoneale.
NOTA: 2,2,2-tribromoethanol è un agente anestetico iniettabile che era comunemente usata nei topi. Le soluzioni sono realizzate sciogliendo un grado non farmaceutico 2,2,2-tribromoethanol (2,5 g) in acqua distillata (200 mL) contenente 2,5% di 2-metil-2-butanolo. - Utilizzare veterinario oftalmologica pomata sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia.
NOTA: effetto anestetico sarà indotta a 1 - 2 min. Controllare il pinch riflesso punta a garantire sufficiente profondità dell'anestesia prima del funzionamento. - Radere la pelle dorsale fianco e applicare una crema depilatoria per sciogliere proteine di cheratina nel fusto del capello.
NOTA: L'uso della crema depilatoria per eliminare i peli faciliterà l'infusione di DNA nella pelle. - Utilizzare batuffoli di cotone imbevuto di acqua per rimuovere la crema depilatoria.
NOTA: La crema depilatoria è solubile in acqua. La rimozione completa del wil cremal prevenire una superficie unta e garantire un risultato migliore puntura. - Usare un tampone di cotone sterile imbevuta di etanolo al 70% per disinfettare la superficie della pelle.
- Mark l'area di destinazione (1 cm x 1 cm) sulla pelle depilata con uno stampino predosato. NOTA: In occasione del sito di destinazione vi aiuterà ad applicare il fascio ago su e giù all'interno di un'area definita. Questo è importante per garantire la consegna della stessa quantità di DNA ad una superficie specifica per minimizzare la variazione esperimento a esperimento.
- Una goccia 10 ml di DNA plasmidico (10 ug) sulla pelle sensibile.
NOTA: La quantità di DNA per acufection varia con differenti geni e il tipo di vettore di espressione. La quantità di DNA usato deve essere attentamente titolato prima di effettuare l'esperimento di interesse. Il 10 microlitri è una piccola goccia di liquido e si siede bene sulla pelle rasata e depilate senza rotolare giù mentre puntura. Includere un gruppo di controllo di topi trattati con 10 microlitri vuoto vettore di DNA da confrontare con un topicufected con il gene di studio. - Tenere il fascio di agopuntura (Figura 1B) e forare la superficie contrassegnata con un movimento su e giù per 100 volte o finché l'umidità dal DNA in PBS sulla pelle scompare. NOTA: può verificarsi un certo rossore della superficie della pelle. Evita di fare tagli profondi che sanguinano. Il numero di up-and-down pungendo movimenti sulla superficie della pelle è operativamente determinata quando l'umidità dal DNA in PBS (10 mL) scompare sulla pelle. Abbiamo deciso 100 volte in 30 s, perché ha dato i risultati più consistenti da geni acufection-consegnato. Se del caso, gli aghi possono essere riutilizzati per 6 punture pelle bersaglio (1 cm x 1 cm ciascuno). Risciacquare gli aghi in etanolo al 70% e PBS tra acufection. Cambiare per nuovi aghi quando sono spenti o per diversa DNA plasmidico per evitare la contaminazione incrociata.
- Mettere i topi acufected su una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea fino a quando sveglio.
- Rientro topi per loro gabbia quando hannoripreso conoscenza sufficiente. Nota: Tenere topi acufected in gabbia separata (meno di 5 animali per gabbia) dalla gabbia di topi non-acufected.
- Mettere bottiglia d'acqua in luogo e tornare la gabbia alla IVC (gabbie a ventilazione individuale) rack.
Cura 4. post-operatorio
- Per le prime 48 ore dopo la procedura, monitorare attentamente i topi per qualsiasi disagio compresi i cambiamenti comportamentali (irrequietezza, agitazione o disturbo alimentare) o aspetto anomalo (pelo ruvido o la postura ricurva).
5. Imiquimod (IMQ) trattamento della pelle IL-15ΔE7-acufected
NOTA: l'espressione trascrizionale e proteine produzione di gene acufected sono rilevabili il giorno 3. I topi acufected con il plasmide di interesse può essere trattata con diversi tipi di stimolanti 3 giorni dopo la trasfezione. Illustriamo qui trattando la pelle del mouse IL-15ΔE7-acufected con crema di IMQ. IMQ è un f imidazoquinolin ammina approvatoo trattare genitali esterni e verruche perinatali 13. Il trattamento topico IMQ è mostrato di indurre disturbi della pelle psoriasi-come l'essere umano nei topi con la manifestazione di pelle squamosa, la proliferazione epidermica e l'infiltrazione 12, 14, 15 dei neutrofili cutanea.
NOTA: Il vettore plasmidico conteneva intera lunghezza topo IL-15 cDNA, sotto la regolazione del fattore di allungamento-1 α (PEF), fiancheggiata da un peptide segnale IL-2 e un tag FLAG al C-terminale (pEF-IL- 15, 5859 paia di basi), che è stato costruito come descritto da Bamford et al. 16. Il plasmide viene utilizzato come modello IL-15 per eliminare i primi 16 ammino acidi nelle residui 33 - 48 nell'esone 7 del IL-15 gene IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 paia di basi) da SOE (sintesi per estensione sovrapposizione) PCR 17. colonie batteriche che sono stati con successotrasformato con IL-15ΔE7 sono stati verificati mediante digestione con enzimi di restrizione e sequenziamento del DNA seguita da 12, 18. Una grande quantità di DNA plasmidico privo di endotossine è stato preparato come descritto nel passaggio 2 protocollo.
- Anestetizzare topi acufected mediante iniezione intraperitoneale di tribromoethanol (400 ug per peso corporeo gm) e applicare veterinario pomata oftalmica sugli occhi per evitare secchezza sotto anestesia. Controllare il pinch riflesso punta per assicurare sufficiente profondità dell'anestesia prima dell'inizio delle procedure operative. NOTA: Poiché una pelle 2 cm x 2 cm verranno trattati per IMQ, 2 dosi di pil-15ΔE7 DNA plasmidico (10 mg in 10 ml di PBS per dose) è acufected su 2 siti bersaglio (1 cm x 1 cm ciascuno).
- Mark affiancano pelle (2 cm x 2 cm) che copre l'area acufected.
- Utilizzare Q-applicatore per applicare topicamente la crema IMQ sulla superficie contrassegnata. Nota: passo 5.1 viene eseguita soltanto per la prima dose (60 mg / dose).I prossimi dosi consecutive vengono applicati ai topi non anestetizzati.
- Documentare i cambiamenti della pelle dorsale IMQ-trattati giornalmente con una videocamera ad alta definizione. Nota: Una persona tiene il mouse mentre un altro sta registrando. Ancora immagini sono girato e montato in un secondo momento.
- Euthanize topi iniettando una dose eccessiva di tribromoethanol (800 mg per peso corporeo gm) seguita da dislocazione cervicale il giorno 4 o 7 ° giorno dopo il trattamento IMQ. La pelle è asportato ed elaborato (passi 4,1-4,5).
6. Omogenato della pelle del mouse
- Utilizzare un paio di forbici chirurgiche per eseguire un taglio orizzontale dalla base della coda. Procedere bilateralmente alla base della arti posteriori e continuare a tagliare verticalmente lungo il fianco alla base dell'arto anteriore.
- sbucciare accuratamente la pelle dal tessuto sottostante dal posteriormente al anteriore. Usare le forbici per tagliare la pelle dorsale. Posizionare la pelle su una piastra di Petri sterile.
- Utilizzare un bisturi per asportare bersagliopelle e congelare in azoto liquido immediatamente. Nota: Le stesse dimensioni della pelle acufected colpo (1 cm x 1 cm) o con il trattamento IMQ (2 cm x 2 cm) è fissato per ogni mouse per minimizzare le variazioni esperimento-to-esperimento.
- Posizionare il tessuto della pelle congelata al centro di un pre-raffreddata malta 2-vano con manici e un pestello. Utilizzare un martello di piombo sulla malta per polverizzare il tessuto.
- posizionare rapidamente il tessuto polverizzato in una nuova provetta contenente 500 ml di reagente di lisi cellulare per l'estrazione di RNA o ad una provetta contenente 50 ml di PBS e 1x proteasi inibitore cocktail avere lisato proteico.
7. H & E e la colorazione immunoistochimica di Sezione della cute
- Posizionare il tessuto cutaneo in una cassetta e immergerlo in paraformaldeide al 4% durante la notte.
- Incorporare e sezione di tessuto, che nel nostro caso è stato eseguito dal Laboratorio Patologia LAC, NTU. Nota: La sezione è tagliato ad uno spessore di 5 um. Luogo secti tessutions su vetrini con carica positiva.
- Riscaldare le diapositive a 65 ° C per 15 min.
- Porre i vetrini in un rack di colorazione. Immergere il rack in corrispondenti serbatoio contenente sostituto xilene per 5 minuti seguita due volte per immersione sequenziale in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% e 50% di etanolo (5 min ciascuna) per la reidratazione. Immergere i vetrini in acqua di rubinetto per 3 minuti prima della colorazione.
- Eseguire ematossilina ed eosina. Nota: H & E macchia è stata eseguita su richiesta al Laboratorio di Patologia presso il LAC, NTU.
- Per macchia immunoistochimica, bloccare la sezione con soluzione blocco a temperatura ambiente per 5 minuti per ridurre il fondo non specifica colorazione. Nota: La soluzione blocco viene sviluppato commercialmente con tecniche di immunoistochimica. Nessun siero animale è contenuto in questo prodotto.
- Immergerlo in PBS per sciacquare la soluzione blocco.
- Diluire la soluzione blocco in PBS a 1:10 e aggiungere 2% di siero fetale bovino (FBS) (soluzione diluente).
- Macchiare una sezione serie nello stesso ciclo con la stessa soluzione omettendo l'anticorpo primario per controllare per il legame non specifico dell'anticorpo secondario.
8. fotografia e analisi di macchiato sezione di tessuto
- Visualizza H & E macchiato e IHC sezioni di tessuto sotto un microscopio a campo luminoso. catturare immagini utilizzando Charge Coupled Device (CCD) collegata al microscopio. per qanalisi QUANTITATIVA, software di imaging può essere utilizzato
- Scandire l'intera sezioni colorate usando uno ScanScope con un obiettivo 20X.
- Misurare lo spessore epidermico all'interno di un segmento 1 mm dell'epidermide e contare il numero di cellule Ki67-immunoreattive all'interno del segmento.
NOTA: quantitativa analisi viene eseguita utilizzando la microscopia automazione e immagine software di analisi. spessore epidermico è definito dalla distanza tra lo strato basale e lo strato più esterno dell'epidermide. - Contare il numero di cellule Ly6G-immunoreattive nella zona cutanea (230 x 270 um 2 rettangolo) immediatamente sotto topica cutanea IMQ-trattata.
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Representative Results
Mentre alcuni rossore era evidente entro la prima ora dopo puntura con aghi di agopuntura, la pelle liberata il giorno 2 ed è stata osservata alcuna reazione avversa cutanea fino al giorno 7 dopo puntura (Figura 2A). Ago che pungono indotto molto basso livello di epidermico orthokeratosis e infiltrazione dermica minima da H & E analisi comparata con la pelle non trattata (Figura 2B). Lo spessore epidermico (Figura 2C) ed il numero di cellule Ki67 + (Figura 2D) erano confrontabili tra la pelle ago dritte e non trattati, dimostrando che la pelle agopuntura aghi dritte non ha causato frammentazione del tessuto visibile o proliferazione cellulare nell'epidermide. Rispetto al l'ago della siringa (1.067 mm di diametro), 12 pizzicore con aghi di agopuntura indotti livelli ridotti delle espressioni della chemochina CXCLCitochina proinfiammatoria -1 e IL-6 al giorno 2 che ha continuato a diminuire il giorno 5 (Figura 3A). Per convalidare l'espressione del transgene acufected in pelle del mouse, un plasmide che esprime IL-15 cDNA è stato acufected nella pelle di topi C57BL / 6 IL-15-deficienti (IL-15 KO). Nonostante i bassi livelli di trascrizione dal plasmide acufected DNA sono state osservate in pelle depilata, oscillazione con aghi di agopuntura migliorato il livello di trascrizione del gene (Figura 3B). IL-15 produzione è stato rilevato il giorno 2 ed è rimasto stabile fino al giorno 7 (Figura 3C). Questi risultati dimostrano che infonde acufection efficacemente il DNA plasmidico e consente l'espressione della proteina codificata nella pelle senza indurre attivazione cheratinociti eccessivo.
topi WT stati acufected con un plasmide codificante IL-15ΔE7. Topi ha espresso IL-15ΔE7 mRNA e la proteina fino al 3giorni dopo la transfezione (Figura 4A). I topi sono stati poi trattati topicamente con crema IMQ il giorno 3. Mentre il trattamento IMQ indotte scaglie argentee in topi WT controllo, scaglie argentee IMQ-indotti sono stati ridotti in IL-15ΔE7 acufected topi WT (Figura 4B). È interessante notare che l'espressione di IL-acufected 15ΔE7 significativamente inibito Ly6G + infiltrazione di neutrofili nella pelle IMQ trattati rispetto unacufected pelle WT (Figura 4C) 12. Da acufection, abbiamo dimostrato la nuova funzione di IL-15ΔE7 nella pelle. IL-15ΔE7 modula IMQ che inducono infiltrazione di neutrofili.
Figura 1. Illustrazione di aghi di agopuntura. (A) L'ago di agopuntura (36 G x 0.5" ) è composta da unagestire ed un'estremità dell'ago. (B) Dieci aghi di agopuntura sono legati in un fascio utilizzando nastri adesivi. La lunghezza del fascio è di circa 4 cm misurate dal righello (pannello inferiore). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Pricking da aghi per agopuntura non causa danni alla pelle o Notevole cheratinociti attivazione. (A) siti triple segnate in quadrati grigi sulla pelle rasata del fianco e depilate del mouse è stato dritte 100 volte ciascuno da aghi di agopuntura. Fotografie sono state prese sulla prima ora e fino a 7 giorni dopo puntura per monitorare i danni alla pelle. Rasata e la pelle depilata senza ago puntura è stato utilizzato come controllo. <strong> (B) H & E analisi fissate in formalina, incluse in paraffina sezioni della pelle dalla pelle trattata o ago-dritte mouse. barra della scala: 100 micron. (C) Un millimetro segmenti di sezioni H & E marcate da pelle trattata o ago-pricked topo è stato selezionato per misurare lo spessore epidermico (la distanza dal basale allo strato più esterno). Ogni barra rappresenta la media dello spessore epidermico misurata da 3 sezioni di pelle. barra di errore rappresenta l'errore standard della media (SEM). Il significato della differenza tra i gruppi è stata testata con il test t di Student spaiato. (D) Sezioni seriali degli stessi campioni sono stati colorati con anti-Ki67 per l'analisi immunoistochimica. Ogni barra rappresenta la media di + cellule Ki67 localizzate in ogni 150 um-epidermide in lunghezza per segmento 1 mm. barra di errore rappresenta l'errore standard della media (SEM). Il significato della differenza tra i gruppi è stato testato da ANOVA a due vie folldovuto dai test post hoc di Bonferroni. (ns: non significativo). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Acufection esprime efficacemente la proteina di interesse senza causare Notevole cheratinociti di attivazione. (A) rasata e pelle depilata fianco è stata lasciata non trattata (NTC), abrasione con 1,067 millimetri di diametro (19 G) siringa (Syr.) O pungendo 100 volte da aghi (Acu.). I livelli trascrizionali di CXCL-1 e IL-6 il giorno 2 e al giorno 5 sono stati misurati mediante qRT-PCR (n = 3). (B) rasata e pelle depilata di topo IL-15-deficienti stato applicato topicamente con una goccia di un DNA plasmide che esprime IL-15 without (depilazione) oppure con punture di agopuntura (depilazione + prick). Trascrizione di IL-15 in ogni gruppo il giorno 2 è stata misurata mediante TaqMan qRT-PCR. Trascrizione di IL-15 non era rilevabile nel controllo PBS (NTC) di topi IL-15-carenti. (C) di IL-15 produzione dalla pelle IL-15-carente topo che era greggia o IL-15-acufected per diversi giorni (un tessuto per ogni giorno) sono stati misurati con IL-15 ELISA. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Dimostrazione di IL-15ΔE7 Attenua IMQ-indotta pelle Silvery a fiocchi e inibisce infiltrazione di neutrofili. (A) Il livello e la produzione di proteine trascrizionale di IL-15ΔE7-acufected (WT / pil-15 [6; E7) o cutanea controllo vettoriale vuoto (WT / pEmpty) sono state misurate mediante qRT-PCR ed ELISA (n = 2, ogni punto di tempo), rispettivamente. (B) da vettori vuoto o pelle fianco IL-15ΔE7-acufected al giorno 3 è stato topicamente trattato con crema IMQ (60 mg). Fotografie di WT / pEmpty e WT / Pil-15ΔE7 fianco del mouse al giorno 6 dopo il trattamento IMQ. (C) sezioni pelle da WT / pEmpty o topi WT / Pil-15ΔE7 dopo il trattamento IMQ nei giorni 3 e 6 sono state colorate con anticorpi anti-Ly6G ed enumerati. Ogni barra rappresenta la media di cellule Ly6G + da 4 topi IMQ-trattata. barra di errore rappresenta l'errore standard della media (SEM). Il significato della differenza tra i gruppi è stato testato da ANOVA a due vie seguita da test post hoc di Bonferroni. Pannelli A e C sono modificati con il permesso del Journal of Investigative Dermatology, Licenza Numero 3901890227597. Cliccatequi per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La fase più critica per garantire l'espressione del DNA plasmidico è acufected ad oscillare in modo uniforme e allentare lo strato corneo della pelle. Spingendo gli aghi delicatamente senza tagliare la pelle, la forza dovrebbe essere abbastanza duro per deprimere la superficie. Per facilitare l'assorbimento del DNA in 10 microlitri soluzione su un 1 cm x 1 cm di superficie, gli aghi devono oscillare su e giù per circa 100 volte in 30 s. Si può determinare la forza che deve pungere la pelle e notando il numero di volte che è necessario per ottenere il miglior livello di espressione del gene acufected.
Modifica per la quantità di DNA plasmidico applicato per raggiungere un soddisfacente livello di espressione dopo acufection può essere necessaria perché può variare per diversi geni. esperimenti di titolazione devono essere eseguiti per determinare la quantità ottimale di DNA plasmidico da applicare prima dell'esperimento pure. I risultati di analisi RT-PCR quantitativa contribuiranno a determinare l'oquantità ptimal di DNA plasmidico e la condizione migliore per ottenere risultati riproducibili.
L'esatto meccanismo di processo acufection rimane da chiarire. Mentre trascrizione da topicamente consegnato plasmide DNA verificato in pelle rasata e depilate a livello basso, il trapianto da aghi potenziate efficienza di trasfezione (Figura 3B). Per analogia di protocollo microseeding in cui perforazioni multiple con la pistola del tatuaggio 11, DNA plasmidico acufection consegnate è probabile facilitata attraverso la raschiatura della membrana cellulare dei cheratinociti e follicoli piliferi 19, 20. Stimolazioni dell'epidermide di epilazione, depilazione reagente e l'ago oscillazione possono indurre attivazione cheratinociti in qualche misura e migliorare ulteriormente l'assorbimento di DNA da Langerhans e DC 6. Una limitazione di questo protocollo è che la quantità di DNA plasmidico ripresoda cellule non può essere accuratamente controllata. Noi non consigliamo di utilizzare questo metodo per il trattamento di una vasta area di pelle. Per ridurre al minimo le variazioni nei livelli di espressione del gene espresso tra esperimenti, il volume della soluzione di DNA e la dimensione di superficie cutanea bersaglio opportuno fissare la stessa serie di esperimenti. Per generare risultati riproducibili, è consigliabile che gli esperimenti replicati devono essere eseguite dallo stesso individuo.
Per quanto riguarda il dispositivo di pistola genica e microseeding, l'uso di un fascio di aghi per fornire DNA nudo è poco costoso. Le procedure sono anche semplice. Si richiede pochissima esperienza tecnica per seguire il protocollo acufection. Acufection provoca il minimo trauma per gli animali e non la perdita di peso si trova dopo l'operazione. Il livello di dolore è basso come giudicato dalla assenza di significativo cambiamento comportamentale dopo operazione acufection.
In sintesi, utilizzando aghi di agopuntura per allentare lastrato corneo della pelle per l'assorbimento di DNA da cellule ospiti fornisce un metodo alternativo economico per esprimere una proteina di pelle di topo. Un ampio spettro di geni immuno-correlati devono ancora essere funzionalmente caratterizzato nella pelle 21, e questo mette in evidenza la necessità di un rapido studio di un nuovo gene sulla pelle. Impiegando questo metodo, si può facilmente determinare se il prodotto del gene di interesse ha alcuna funzione romanzo. Questo protocollo acufection fornisce uno strumento pratico e fattibile per le nuove scoperte nel modulare la risposta immunitaria per curare la malattia cutanea.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione da parte del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Ringraziamo Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee al NTU, Leigh Zerboni presso la Stanford University e il dottor Peter Hoffmann presso l'Università delle Hawaii per la lettura del manoscritto, Yun Chien a NTU per l'assistenza tecnica, e il dottor Wen Wei-Chi in agricoltura biotecnologie Centro di ricerca presso Academia Sinica per un parere tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
References
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