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Immunology and Infection

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

doi: 10.3791/55206 Published: April 19, 2017

Summary

Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Alternative für die nackten Plasmid-DNA in Mäusehaut exprimiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist immunbezogenen Gene in Hautgewebe liefern die funktionelle Rolle eines spezifischen Gens in Hautentzündung zu beschreiben.

Abstract

Dysregulation der Immunantwort in der Haut ist mit zahlreichen menschlichen Hauterkrankungen in Verbindung gebracht. Ein direkte Übertragung von immunbezogenen Genen in Hautgewebe ist ein faszinierender Ansatz Immunmodulation von Hautentzündung in Mausmodellen menschlicher Krankheiten zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein kostengünstiges Protokoll, die nackte DNA in Mäusehaut geliefert und führt zu einem Transgen-Expression. Das Verfahren wird geprägt „acufection“, bezeichnet ACU Punktur-vermittelter DNA trans fektion. Zur Durchführung acufection, Mäusehaut wurde zuerst mit DNA in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und anschließend gespitzt leicht mit einem Bündel von Akupunkturnadeln infundiert die Aufnahme von DNA und Transfektion in Zellen zu erleichtern. Der Plasmid-DNA wird vermutlich durch die Keratinozyten und dendritischen Zellen (DCs) in der Haut und in dem Protein exprimiert aufgenommen. Mechanische Stich mit der Nadel per se nicht Hautschäden verursachen oder Keratinozyten - Aktivierung induzieren. Der Ausdruckdie transfizierten Gene wurde sowohl für 2 Tage nach acufection Transkriptions- und Translationsniveau in der Haut detektiert und gehalten bis 7 Tage. Das primäre Ziel für die Entwicklung dieser acufection Methode war eine zuvor nicht definiert Isoform von IL-15 zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahren wird eine alternativ gespleißte IL-15-Isoform mit teilweise deletierten Exon 7 (IL-15ΔE7) wurde in der Haut exprimiert und anschließend mit einem Toll-like-Rezeptor 7 (TLR7) -Agonisten, Imiquimod (IMQ) behandelt, um Entzündung zu induzieren. Acufection-lieferte IL-15ΔE7 in der Haut unterdrückt Keratinozytenproliferation, epidermale Dicke und neutrophile Rekrutierung in IMQ-induzierte Hautentzündung. Mit zunehmendem Interesse der Regulationsmechanismen der Hautentzündung bei der Identifizierung beschriebenes Protokoll hier bietet eine kostengünstige und vielseitige Alternative zu dem Genkanone System oder Microseeding zur DNA - Verabreichung in vivo. Es kann möglicherweise Entdeckung der Funktion eines neuen erlaubenGene in der Haut oder für neue Behandlung für Hautkrankheiten zu untersuchen.

Introduction

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Die Haut ist die erste Linie der Verteidigung des Wirts. Keratinozyten (KCS) ist der Hauptzelltyp in der Haut von Menschen und Mäusen. Als Reaktion auf Umweltreize (zB Sonnenlicht, Sauerstoff, Chemikalien und pathogene invasion) wird KCs aktiviert , und eine Vielzahl von proinflammatorischen Zytokine und Chemokine, wie IL-8 produzieren, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α und GM-CSF - 1. Gemeinsam lösen sie die Rekrutierung von Immunzellen auf der Haut. VERSCHLIMMERT kutanen Entzündung ist oft mit zahlreichen menschlichen Erkrankungen , einschließlich akut ectopic Kontaktdermatitis und chronischen T - Zell-vermittelte Entzündung (zB allergische Kontaktdermatitis und Psoriasis) 2 verbunden. proinflammatorischen Reaktionen in der Haut modulierenden durch KC Aktivierung Hemmung ist ein plausibler Ansatz Hautentzündung zu behandeln. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz zur transient ein Zytokin-Gen in den Epidermis, um auszudrücken Immun res zu studierenponse Folge einer solchen Behandlung in der Haut.

Die Epidermis bildet die oberflächliche Schicht der Haut. Es dient als physikalische Barriere zu halten externe Substanzen, wie Nukleinsäuren und Pathogenen aus den tieferen Schichten der Haut eintritt. Mehrere nadelfreie Techniken wurden für DNA - Transfer epidermalen 3, 4 aufgebaut. DNA in Lösung oder in Verbindung mit kationischen Liposomen oder Adenovirusvektoren wurde an die Epidermis mit Techniken modifiziert wie die Entfernung des Stratum corneum oder die Behandlung mit depilating Reagenz direkt angewendet. Die Entfernung des Epithels verhornten erleichtert DNA die epidermalen Barriere und Interaktion mit Keratinozyten und Langerhans'schen Zellen kreuzen 5 - Immunantworten zu induzieren. Während eine große Oberfläche für die DNA-Transfer zur Verfügung steht und dieser Ansatz ist nicht mit Nadeln, gibt es einschließlich Nachteile der Anforderungfür die großen Mengen an DNA (10-100 ug), harter Behandlung auf der Haut durch Strippen und die inkonsistenten Ergebnisse der Immunantwort in den immunisierten Tieren ohne DNA - Abgabe Booster 6 induziert wird . Mikroteilchen-vermittelte intrazelluläre Abgabe nackten DNA auf die Haut wurde zum Induzieren von Immunantwort , 7, 8 sehr leistungsfähig und reproduzierbar erwiesen. Tragbares Genkanone verwendet worden ist, die Haut Zielstelle mit Plasmid - DNA-beschichteten Goldteilchen 2 & mgr; m-Durchmesser in der Größe mit Hilfe von Druckluft Heliumstrom 9 zu bombardieren. Der Plasmid - DNA wird vermutlich durch KCsand dendritische Zellen (DCs) in der Haut und das Protein aufgenommen wird lokal ausgedrückt , oder 10 bis ableitenden Lymphknoten von DCs transportiert wird. Obwohl die Gen - Kanone System ist einfach und erfordert begrenzte technische Erfahrung, die Kosten für die Herstellung und Lieferung des "DNA - bullassen "(dh Goldpulver, Heliumgas) und für die Gen - Kanone selbst seine allgemeine Geltung hat beschränkt. Darüber hinaus die Leichtigkeit des Genkanone Transports die Forderung nach einem Heliumgas - Abgabesystem begrenzt , wenn die Experimente an verschiedenen Orten durchgeführt werden. Microseeding ist 11 eine höhere Effizienz des Gentransfers als Einzelinjektion und Teilchenbeschuss gezeigt zu erreichen. Microseeding eine Tätowierung Pistole verwendet , ohne die Verwendung von Partikeln Wülste 11. Oszillieren der Mikronadel auf der Haut ist mit diesem Ansatz DNA auf die Haut zu liefern wahrscheinlich direkt die Zellmembran schaben und so DNA zu mehreren Zellen gleichzeitig übertragen. jedoch mit der großen Anzahl von Injektionen verbundenen Schmerzen mit 0,254 mm Durchmesser Nadeln ein Nachteil ist.

Hier bieten wir einen alternativen Ansatz zur DNA - Verabreichung in vivo. Die „acufection“ 12. Während acufection beweist eine einfache und weniger dema seinnden Verfahren zur DNA - Verabreichung in vivo, hat sie die optimale Menge an DNA für verschiedene Gene und die Zeiten , um die Haut stechen sorgfältig optimiert werden , um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

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Protocol

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Weibliche Mäuse in 8 bis 12 Wochen alt wurden für diese Studie verwendet. C57 / BL6 - Wildtyp (WT) und IL-15 defiziente (IL - 15 - / -) Mäuse wurden von National Laboratory Animal Center (NLAC) erworben, Taiwan und Taconic Farm, respectively. IL-15-defiziente (IL - 15 - / -) und IL-15-dominant (IL - 15 IL - 15 und +/- + / +) zeigten ein Verhältnis 1: 3 in der zweiten Generation aus der Kreuzung von IL - 15 +/- Heterozygoten. Der Genotyp von IL - 15 - / - Mäuse wurden durch PCR - Analyse bestätigt. Die Mäuse wurden in der Spezifische pathogenfreie (SPF) Anlage im Labor Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine gehalten. Alle Tierverfahren einschließlich der Betäubung Materialien und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Tier Protokoll, das von der National Taiwan University College of Medicine und der Hochschule für Public Health Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) (Affidavit der Genehmigung des Tier Protokolls 20130225) genehmigt durchgeführt.

<p class = "jove_title"> 1. Herstellung von Akupunkturnadeln

HINWEIS: Akupunkturnadeln sind Medizinprodukte, bestehend aus einem Handgriff und einem Nadelende (1A). Die Durchmesser der Akupunkturnadel lag im Bereich von 0,2 mm (36 G) bis 0,35 mm (28 G). Wir wählen den besten Punkt der Nadel während Einstechen in die Haut mögliche übermäßige Zellschäden zu vermeiden. Es gibt 4 verschiedene Längen der 0,2-mm-Nadel einschließlich 13 mm (0,5 Zoll), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 Zoll) und 50 mm (2,0 in) in der Länge. Ein Bündel aus 10 Nadeln mit 13 mm Länge bereitgestellt, um den besten bequemen Griff während des Nadel Oszillieren auf C57BL / 6-Mäusehaut. Die Parameter können geändert werden, wenn das Verfahren auf die Haut von größeren Tieren angewandt wird oder von den Forschern mit größeren Händen durchgeführt.

  1. Entfernen Sie Akupunkturnadeln aus dem sterilen, pyrogenfreien Paket. Legen Sie die Nadeln auf einem sterilen Tuch.
  2. Verwenden Klebeetikettenband 10 Nadeln zusammenzubinden ina Bündel (1B).
    HINWEIS: Die Nadeln 10 sind geometrisch angeordnet, um eine Zylinderform zu bilden. Der Einfachheit halber wird ein Stück Paraffinfilm verwenden, um die Anordnung zu stabilisieren, bevor das Klebeband aufgebracht wird. Stellen Sie sicher, dass alle Nadelspitzen auf der gleichen Ebene liegen. ein Bündel anstelle einer einzelnen Nadel erleichtert maximale DNA Infusion durch den Kontaktbereich zwischen den Nadeln und der Haut zu erhöhen.

2. Herstellung einer großen Menge und Endotoxin-freie Plasmid-DNA

  1. Verwandeln chemisch kompetente Bakterienzellen mit dem Plasmid DNA.
  2. Auswählen und inokulieren eine einzelne Bakterienkolonie in 3 ml LB - Medium , das Antibiotika und inkubieren bei 37 ° C in einem Schüttler über Nacht.
  3. Scale - up die Kultur durch die Bakterienkultur in 1 verdünnt: 100 in 250 ml LB - Medium mit Antibiotika und Schütteln über Nacht bei 37 ° C.
  4. Bereiten Sie eine große Menge an DNA, die durch eine hohe qualit Verwendungy, Endotoxin frei Plasmidpräparation Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Acufection Protokoll erfordert eine hohe Reinheit und eine große Menge an Plasmid-DNA. Verwendung einer hohen Qualität, frei von Endotoxin und column-gereinigter Plasmid-DNA wird empfohlen.
  5. Eluieren der DNA in sterilem Wasser. Shop DNA in kleinen Portionen bei -20 ° C bis zu seiner acufection.
    HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-und-Tau von DNA konsistent Plasmid-DNA-Expression zu gewährleisten.
  6. Verdünnte Plasmid-DNA zu 1 mg / ml in sterilem PBS für acufection.

3. Verfahren für die Acufection

HINWEIS: Die optimale Menge an DNA und der Bereich der Zielhautoberfläche kann für verschiedene Gene variieren und müssen weiter optimiert werden. Die Einstichkraft und die Anzahl der Male, die Hornschicht der Haut zu lösen, auch in Abhängigkeit von der Hautdicke variieren. Diese Bedingungen müssen sorgfältig bestimmt werden, nachdem das Expressionsniveau von acufected Gen transcri Bewertungpts durch qRT-PCR.

  1. Wiegen der Mäuse und verabreichen Tribromethanol (400 ug pro g Körpergewicht) durch peritoneale Injektion.
    HINWEIS: 2,2,2-Tribromethanol ist ein injizierbares Narkosemittel, das bei Mäusen häufig verwendet wurde. Lösungen werden durch Lösen eines nicht pharmazeutischem Grad 2,2,2-Tribromethanol (2,5 g) in destilliertem Wasser (200 ml), enthaltend 2,5% 2-Methyl-2-butanol hergestellt.
  2. Verwenden vet ophthalmologischen Salbe auf die Augen zur Trockene unter Narkose zu verhindern.
    HINWEIS: - 2 min betäubende Wirkung wird in 1 induziert werden. Schauen Sie sich die Zehe Prise Reflex vor dem Betrieb eine ausreichende Narkosetiefe zu gewährleisten.
  3. Shave die dorsale Flanke und die Haut anwenden Enthaarungscreme Keratinproteinen in der Haarschaft zu lösen.
    HINWEIS: Die Verwendung von Enthaarungscreme Haare entfernen wird die Infusion von DNA in die Haut erleichtern.
  4. Verwenden Sie Wasser getränkte Wattebäusche die Enthaarungscreme abzuwischen.
    HINWEIS: Die Enthaarungscreme in Wasser löslich sind. Die vollständige Entfernung der Creme will eine schmierige Oberfläche verhindern und eine bessere stech Ergebnis zu gewährleisten.
  5. Verwenden ein steriles Wattestäbchen in 70% Ethanol getränkt, um die Hautoberfläche zu desinfizieren.
  6. Markierung des Zielbereich (1 cm x 1 cm) auf der enthaarten Haut mit einer vorgemessenen Schablone. HINWEIS: Um die Zielstelle Kennzeichnung wird dazu beitragen, das Nadelbündel nach oben und nach unten innerhalb eines definierten Bereichs anzuwenden. Dies ist wichtig, Lieferung der gleichen Menge an DNA zu einer spezifischen Oberfläche, um sicherzustellen, Experiment zu Experiment Variation zu minimieren.
  7. Legen Sie eine 10 uL Tropfen von Plasmid-DNA (10 ug) auf die markierte Haut.
    HINWEIS: Die Menge an DNA für acufection variiert mit verschiedenen Genen und dem Typ des Expressionsvektors. Die Menge an DNA verwendet wird, sollte sorgfältig titriert werden, bevor das Experiment von Interesse durch. Die 10 & mgr; L ist ein kleiner Flüssigkeitstropfen und es sitzt gut auf dem rasiert und enthaart Haut ohne rollten während Einstechen. Umfassen eine Kontrollgruppe von Mäusen, die mit 10 & mgr; l leeren Vektor DNA behandelten Mäusen mit einem zum Vergleichmit der Studie Gen cufected.
  8. Halten Sie die Akupunkturnadel Bündel (1B) und stechen die markierte Oberfläche mit einer Auf- und Abbewegung zu 100 - mal oder bis die Feuchtigkeit von DNA in PBS auf die Haut verschwindet. HINWEIS: Einige Rötung der Hautoberfläche auftreten kann. Vermeiden Sie tiefe Schnitte zu machen, die bluten. Die Anzahl der Auf- und Abbewegungen auf der Hautoberfläche Einstechen ist funktionsfähig bestimmt, wenn die Feuchtigkeit von DNA in PBS (10 ul) verschwindet auf der Haut. Wir entschieden uns 100 mal in 30 s, weil es die meisten konsistente Ergebnisse aus acufection-gelieferten Gene gegeben hat. Gegebenenfalls können die Nadeln bis zu 6 Zielhaut pricks (1 cm x 1 cm je) wiederverwendet werden. Spülen Sie die Nadeln in 70% Ethanol und PBS zwischen acufection. Wechseln Sie in neue Nadeln, wenn sie stumpf oder für verschiedene Plasmid-DNA sind eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
  9. Platzieren acufected Mäuse auf einem Heizkissen, die Körpertemperatur, bis wach zu halten.
  10. Rück Mäuse in ihren Käfig, wenn siewieder genügend Bewusstsein. Hinweis: Halten Sie acufected Mäuse in separaten Käfig (weniger als 5 Tiere pro Käfig) aus dem Käfig von un-acufected Mäuse.
  11. Setzen Sie Wasserflasche an Ort und Stelle und gibt den Käfig mit dem IVC (einzeln belüfteten Käfig) Rack.

4. postoperative Pflege

  1. Für die ersten 48 Stunden nach dem Eingriff, genau überwachen Mäuse für irgendwelche Beschwerden einschließlich Verhaltensänderungen (Unruhe, Erregung oder Essstörung) oder Auffälligkeiten (grobe Behaarung oder gekrümmte Haltung).

5. Imiquimod (IMQ) Behandlung von IL-15ΔE7-acufected Haut

HINWEIS: Transkriptions-Expression und Proteinproduktion von acufected Genen nachweisbar ist am 3. Tag Mäusen acufected mit dem Plasmid von Interesse kann mit verschiedenen Arten von Stimulanzien 3 Tage nach der Transfektion behandelt werden. Wir zeigen hier durch die IL-15ΔE7-acufected Mäusehaut mit IMQ Creme behandeln. IMQ ist ein imidazoquinolin Amin zugelassen foder Behandlung von externen Genitalwarzen und perinatale 13. Topische IMQ Behandlung wird gezeigt mit der Manifestation der schuppigen Haut, epidermale Proliferation und dermalen Neutrophileninfiltration 12, 14, 15 Human Psoriasis-ähnlichen Hauterkrankungen bei Mäusen zu induzieren.

HINWEIS: Der Plasmidvektor enthalten Volllängen-Maus-IL-15-cDNA unter der Regulation der Elongationsfaktor-1 α (PEF), flankiert mit einer IL-2-Signalpeptid und ein FLAG-Tag am C-Terminus (pEF-IL- 15, 5859 Basenpaare), die von Bamford et al , wie beschrieben konstruiert. 16. Das Plasmid wird als ein IL-15-Vorlage verwendet, um die ersten 16 Aminosäuren an den Resten 33 zu löschen - 48 in Exon 7 des IL-15-Gen für IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 Basenpaare) durch SOE (Synthese durch Overlap - Extension) PCR - Verfahren 17. Bakterienkolonien, die waren erfolgreichtransformiert mit IL-15ΔE7 wurden durch Restriktionsenzymverdau und DNA - Sequenzieren , gefolgt von 12, 18 überprüft. Eine große Menge von Endotoxin-freien Plasmid-DNA wurde in dem Protokoll Schritt 2 beschrieben, hergestellt.

  1. Anesthetize acufected Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Tribromethanol (400 ug pro g Körpergewicht) und gelten vet ophthalmologischen Salbe auf die Augen zur Trockene unter Narkose zu verhindern. Schauen Sie sich die Zehe Prise Reflex auf eine ausreichende Tiefe der Anästhesie vor dem Beginn der operativen Verfahren zu gewährleisten. Hinweis: Da eine 2 cm x 2 cm der Haut wird für IMQ behandelt werden, 2 Dosen von pIL-15ΔE7 Plasmid-DNA (10 ug in 10 ul PBS pro Dosis) auf 2 Zielstellen acufected (1 cm x 1 cm pro Stück).
  2. Mark Flankenhaut (2 cm x 2 cm), die den acufected Bereich.
  3. Verwenden Q-tip Applikator topisch IMQ Creme auf der markierten Oberfläche anzuwenden. Hinweis: Schritt 5.1 wird nur für die erste Dosis durchgeführt (60 mg / Dosis).Die nächsten aufeinanderfolgenden Dosen werden nicht-narkotisierten Mäusen angewandt.
  4. Dokumentieren Sie die Änderungen von IMQ behandelten Rückenhaut täglich mit einem High-Definition-Camcorder. Hinweis: Eine Person hält die Maus, während ein anderes aufnimmt. Standbilder werden geschossen und zu einem späteren Zeitpunkt bearbeitet werden.
  5. Euthanize Mäuse durch eine Überdosis von Tribromethanol (800 & mgr; g pro Gramm Körpergewicht) Injektion, gefolgt von Genickbruch am Tag 4 oder Tag 7 nach IMQ Behandlung. Die Haut wird ausgeschnitten und verarbeitet (Schritte 4,1-4,5).

6. Homogenat von Mäusehaut

  1. Verwenden, um eine chirurgische Schere einen horizontalen Schnitt von der Basis des Schwanzes zu machen. Verfahren bilateral an die Basis der hinteren Gliedmaße und weiterhin vertikal entlang der Flanke mit der Basis des Vorderbeins schneiden.
  2. Vorsichtig die Haut von dem darunterliegenden Gewebe von posterior zum anterioren. Verwenden Sie die Schere die dorsale Haut abzuschneiden. Legen Sie die Haut auf einer sterilen Petrischale.
  3. Verwenden Sie ein Skalpell Ziel auszuschneidenHaut und in flüssigem Stickstoff sofort einzufrieren. Anmerkung: Die gleiche Größe acufected Haut ohne (1 cm x 1 cm) oder mit IMQ Behandlung (2 cm x 2 cm) wird für jede Maus befestigt zu minimieren Experiment zu Experiment Variationen.
  4. Das tiefgefrorene Hautgewebe in der Mitte eines vorgekühlten 2-Kammer-Mörtel mit Griffen und einem Stößel. Verwenden Sie einen Bleihammer auf dem Mörtel um das Gewebe zu pulverisieren.
  5. Schnell platzieren das pulverisierte Gewebe in ein neues Röhrchen 500 ul Zelllysereagenz zur RNA-Extraktion oder in ein Röhrchen, das 50 ul PBS und 1x-Protease-Inhibitor-Cocktail enthält Proteinlysat zu erhalten.

7. H & E und immunhistochemische Färbung von Haut Section

  1. Platzieren Sie die Hautgewebe in einer Kassette und tauche sie in 4% Paraformaldehyd über Nacht.
  2. Einbetten und Gewebeschnitt, die in unserem Fall durch das Pathologie-Labor an der LAC, NTU durchgeführt wurden. Hinweis: Der Abschnitt in einer Dicke von 5 um geschnitten. Platz Gewebe Abschnitons auf positiv geladene Objektträger.
  3. Wärme , um die Objektträger bei 65 ° C für 15 min.
  4. Legen Sie die Folien in einer Färbebank. Tauchen Sie die Zahnstange in der entsprechenden Behältern enthalten Xylolersatz zweimal für 5 min, gefolgt von aufeinanderfolgenden Eintauchen in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% und 50% Ethanol (jeweils 5 min) zur Rehydratisierung. Tauchen Sie die Objektträger in Leitungswasser für 3 Minuten vor der Färbung.
  5. Führen Sie Hämatoxylin und Eosin-Färbung. Hinweis: H & E-Färbung wurde an der LAC, NTU auf Anfrage bei Pathology Laboratory durchgeführt.
  6. Für immunhistochemische Färbung, blockieren den Abschnitt mit Blocklösung bei Raumtemperatur für 5 min nicht spezifische Hintergrundfärbung zu reduzieren. Hinweis: Die Blocklösung wird im Handel mit Immunfärbungstechniken entwickelt. Kein Tierserum ist in diesem Produkt enthalten sind.
  7. Tauchen Sie die Objektträger in PBS die Blocklösung auszuspülen.
  8. Verdünne die Blocklösung in PBS bei 1:10 und fügen 2% fötalen Rinderserum (FBS) (Verdünnungslösung).
  9. Befleckt einen seriellen Abschnitt im gleichen Durchlauf mit der gleichen Lösung des primären Antikörper verzichtet wird, um nicht-spezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu steuern.
  • Wasch gleitet dreimal in TBS plus 0,1% Tween-20 (TBST-Lösung) für jeweils 5 Minuten. Ändern Lösung zwischen Wäschen.
  • Pipette einen Tropfen von markierten Polymeren zu jedem Abschnitt und inkubiere bei Raumtemperatur für 40 min. Hinweis: Das markierte Polymer durch Kombination von kommerziell Aminosäurepolymere mit Peroxidase und sekundärem Antikörper hergestellt wird, die zu einem Fab'-Fragmente reduziert wird. Das Reagenz ist bereit für die Verwendungimmunhistochemische Färbung von Maus-Gewebeschnitten.
  • Wash gleitet dreimal in TBST für jeweils 5 Minuten. Ändern Lösung zwischen Wäschen.
  • Pipette 3,3'-diaminobenzindine tetrahydrochlorid (DAB) Lösung auf Gewebeschnitt und läßt bei Raumtemperatur stehen, bis ein brauner Niederschlag unter einer Hellfeldmikroskopie sichtbar ist. Hinweis: Die Zeit für DAB in Gegenwart von Peroxidase zu fällen ist etwa 30 min.
  • Tauchen Sie gleitet in Wasser zu Peroxidase-Aktivität zu stoppen. Dip Slides in Methyl grüne Lösung für die Kernfärbung. Wash gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten.
  • Platzieren ein Deckglas über den gefärbten Abschnitt, der mit permanentem Befestigungsmedium (8 & mgr; l pro Abschnitt) abgedeckt ist.
  • 8. Foto und Analyse von gefärbten Gewebeschnitten

    1. Visualisieren H & E gefärbt und IHC Gewebeschnitte unter einem Hellfeld-Mikroskop. Erfassen von Bildern unter Verwendung von ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) Kamera an das Mikroskop angebracht ist. für qengenAnalyse können Bildverarbeitungssoftware verwendet werden,
      1. Scannen Sie die ganzen gefärbten Schnitten eine Scanscope mit einem 20x-Objektiv verwendet wird.
      2. Messen Sie die epidermale Dicke im 1-mm-Segment der Epidermis und die Anzahl der Ki67-immunoreaktive Zellen innerhalb des Segments zählen.
        HINWEIS: Die quantitative Analyse wird unter Verwendung von Mikroskopie Automatisierung und Bildanalyse-Software durchgeführt. Epidermisdicke wird durch den Abstand zwischen der Basalschicht und der äußersten Schicht der Epidermis definiert.
      3. Zähle die Anzahl der Ly6G-immunoreaktive Zellen in der dermalen Bereich (230 x 270 um2 Rechteck) unmittelbar unter topischer IMQ behandelten Haut.

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    Representative Results

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    Während einige Rötung innerhalb der ersten Stunde nach dem Einstechen mit Akupunkturnadeln evident war, die Haut am Tag 2 und kein nachteiliger Hautreaktionen 7 bis Tag gelöscht wurde nach Einstechen (2A) beobachtet. Nadeleinstich sehr niedriges Niveau von epidermalen Orthokeratose und minimaler dermalen Infiltration von H & E - Analyse im Vergleich zu unbehandelter Haut (2B) induziert. Die Dicke der Epidermis (2C) und die Anzahl der Ki67 + Zellen (2D) waren vergleichbar zwischen nadel gespitzt und unbehandelter Haut, dass Akupunkturnadel-gespitzten Haut zeigen nicht bemerkbar Gewebezerstörung oder die zelluläre Proliferation in der Epidermis verursacht haben. Im Vergleich zu der Spritzennadel (1,067 mm Durchmesser) 12, Stechen mit Akupunkturnadeln induzierten verringerte Niveau der Ausdrücke der Chemokin CXCL-1 und proinflammatorische Cytokin IL-6 am Tag 2 , das am Tag 5 (3A) verringern fortgesetzt. Um die Expression des Transgens in acufected Mäusehaut zu validieren, wurde ein Plasmid exprimieren IL-15-cDNA wurde in der Haut von IL-15-defizienten C57BL / 6 (IL-15 KO) -Mäusen acufected. Obwohl geringe Mengen an Transkription aus acufected Plasmid - DNA in enthaarte Haut beobachtet wurden, Oszillation mit Akupunkturnadeln verstärkt das Niveau der Gentranskription (3B). IL-15 - Produktion wurde am Tag 2 detektiert und blieb stabil bis zum Tag 7 (3C). Diese Ergebnisse zeigen, dass acufection infuses effektiv den Plasmid-DNA und ermöglicht die Expression des codierten Proteins in der Haut, ohne übermäßige Keratinozyten-Aktivierung zu induzieren.

    WT-Mäuse wurden mit einem Plasmid Codierung IL-15ΔE7 acufected. Mäuse exprimiert IL-15ΔE7 mRNA und das Protein bis 3Tage nach der Transfektion (4A). Die Mäuse wurden dann mit IMQ Creme am Tag topisch behandelt 3. Während IMQ Behandlung induzierte silbrige Schuppen in Steuer WT - Mäusen, IMQ induzierte silbrige Schuppen in IL-15ΔE7 reduziert acufected WT - Mäuse (4B). Interessanterweise ist die Expression von IL-acufected 15ΔE7 deutlich hemmte Ly6G + Neutrophilen - Infiltration in IMQ behandelten Haut im Vergleich zu WT unacufected Haut (4C) 12. Durch acufection haben wir gezeigt, die neue Funktion von IL-15ΔE7 in der Haut. IL-15ΔE7 moduliert IMQ-induzierende neutrophile Infiltration.

    Abbildung 1
    Abbildung 1. Illustration von Akupunkturnadeln. (A) Der Akupunkturnadel (36 G x 0,5" ) aus einem zusammengesetztHandgriff und ein Nadelende. (B) Zehn Akupunkturnadeln werden in einem Bündel unter Verwendung von Klebebändern gebunden. Die Länge des Bündels ist etwa 4 cm, wie durch das Lineal (untere Tafel) gemessen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 2
    Abbildung 2. Von Akupunkturnadeln Einstechen verursacht keine Auffällige Hautschäden oder Keratinozyten - Aktivierung. (A) gekennzeichneten Drei Seiten in grauen Quadrate auf die rasierte Flanke und enthaart Haut der Maus gespitzt wurde 100mal jeweils durch Akupunkturnadeln. Fotografien wurden auf der ersten Stunde genommen und bis zu 7 Tage nach Einstechen in die Haut Schaden zu überwachen. Rasiert und enthaart Haut ohne stechende Nadel wurde als Kontrolle verwendet. <strong> (B) H & E - Analyse von Formalin-fixierte, in Paraffin eingebetteten Hautschnitte von unbehandelter oder nadel gespitzt Mäusehaut. Maßstabsbalken: 100 & mgr; m. (C) Ein Millimeter-Segment von H & E gefärbten Schnitten von unbehandelter oder nadel gestochenen Mäusehaut wurde zur Messung der Dicke der Epidermis (der Abstand von basal auf die äußerste Schicht) ausgewählt. Jeder Balken stellt den Mittelwert der epidermalen Dicke gemessen von 3 Hautabschnitten. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Die Bedeutung des Unterschiedes zwischen den Gruppen wurde durch ungepaarten Student t - Test getestet. (D) Serielle Schnitte der gleichen Proben wurden für die immunhistochemische Analyse mit anti-Ki67 gefärbt. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert von Ki67 + in jeder 150 & mgr; m-Epidermis in der Länge pro 1 mm Segment lokalisierten Zellen. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Die Bedeutung des Unterschiedes zwischen den Gruppen wurde durch Zwei-Wege-ANOVA folg getestetvon Bonferroni post hoc Test geschuldet. (Ns: nicht signifikant). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 3
    Abbildung 3. Acufection äußert effektiv das Protein von Interesse , ohne dass Spürbare Keratinozyten - Aktivierung. (A) rasiert und enthaart Flankenhaut wurde unbehandelt gelassen (NTC), Abschleifen mit 1,067 mm Durchmesser (19 G) Spritzennadel (Syr.) Oder Prickeln 100mal von Akupunkturnadeln (ACU.). Die Transkriptionsniveaus CXCL-1 und IL-6 am Tag 2 und Tag 5 wurden gemessen, indem qRT-PCR (n = 3). (B) rasiert und enthaart Haut von IL-15-defizienten Maus wurde topisch mit einem Tropfen einer Plasmid - DNA exprimieren , IL-15 angewendet without (Depilation) bzw. mit Akupunkturnadel Einstich (Depilation Prick +). Die Transkription von IL-15 in jeder Gruppe am Tag 2 wurde von TaqMan qRT-PCR gemessen. Die Transkription von IL-15 war in PBS-Kontrolle (NTC) von IL-15-defizienten Mäusen nicht nachweisbar. (C) IL-15 Produktion von IL-15-defizienten Mäusehaut , die unbehandelt war oder IL-15-acufected für verschiedene Tage (ein Gewebe je Tag) von IL-15 - ELISA gemessen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    Abbildung 4. Demonstration von IL-15ΔE7 Dämpft IMQ-induzierte silbrige schuppige Haut und hemmt Neutrophileninfiltration. (A) die Transkriptionsebene und Proteinproduktion von IL-15ΔE7-acufected (WT / pIL-15 [6; E7) oder leere Vektor-Kontrolle (WT / pEmpty) Haut wurden durch qRT-PCR und ELISA (n = 2 ist, jedes Mal Punkt) gemessen. (B) Leer vector- oder IL-15ΔE7-acufected Flankenhaut am Tag 3 wurde topisch mit IMQ Creme (60 mg) behandelt. Fotografien von WT / pEmpty und WT / Pil-15ΔE7 Maus Flanke am Tag 6 nach IMQ Behandlung. (C) Hautschnitte von WT / WT oder pEmpty / pIL-15ΔE7 Mäusen nach IMQ Behandlung an den Tagen 3 und 6 wurden mit anti-Ly6G Antikörper gefärbt und gezählt. Jeder Balken stellt den Mittelwert aus Ly6G + Zellen aus 4 IMQ-behandelten Mäusen. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Die Bedeutung des Unterschiedes zwischen den Gruppen wurde durch Zwei-Wege getestet ANOVA durch Bonferroni-Post - hoc - Test folgte. Die Tafeln A und C sind mit freundlicher Genehmigung aus dem Journal of Investigative Dermatology geändert, Lizenznummer 3901890227597. Bitte klickenhier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Discussion

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    Der kritischste Schritt die Expression des acufected Plasmid-DNA, um sicherzustellen, ist gleichmäßig zu schwingen und die Hornschicht der Haut zu lösen. Während die Nadeln drückt sanft, ohne die Haut zu schneiden, sollte die Kraft stark genug sein, um die Oberfläche zu drücken. Zur Erleichterung der Aufnahme von DNA in 10 & mgr; l Lösung auf einer 1 cm x 1 cm Oberfläche, sollten die Nadeln oszillieren up-and-down für etwa 100-mal in 30 s. Man kann die Kraft bestimmen, die die Haut stechen muss und durch die Anzahl der Feststellung, die erforderlich ist, um das beste Expressionsniveau des acufected Gens zu erhalten.

    Modifikation für die Menge an Plasmid-DNA angelegt, um ein zufriedenstellendes Niveau der Expression zu erreichen, nachdem acufection erforderlich sein kann, weil es für verschiedene Gene variieren kann. Titrationsexperimente durchgeführt werden sollte die optimale Menge von Plasmid-DNA zu bestimmen, als auch vor dem Experiment angewandt werden. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR-Analyse wird helfen, die o, um zu bestimmenptimale Menge von Plasmid-DNA und die beste Voraussetzung reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

    Der genaue Mechanismus des acufection Prozess noch geklärt werden. Während die Transkription von topisch aufgetreten geliefert Plasmid DNA in rasiert und enthaart Haut auf einem niedrigen Pegel, von Akupunkturnadeln verbesserte Transfektionseffizienz (3B) Einstechen. Durch die Analogie des Microseeding Protokolls , bei dem mehrere Perforationen mit der Tätowierung Pistole 11, acufection Auslieferzustand Plasmid DNA wahrscheinlich durch die Scharren von Zellmembran von Keratinozyten und Haarfollikeln 19 erleichtert wird, 20. Stimulationen der Epidermis durch Epilation, depilating Reagenz und Nadel Schwingung kann Keratinozyten Aktivierung in einem gewissen Ausmaß induzieren und weitere DNA - Aufnahme durch Langerhans'schen DCs und 6 verbessern. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die Menge an Plasmid-DNA aufgenommenvon Zellen kann nicht genau gesteuert werden. Wir schlagen vor, diese Methode nicht mit einem großen Hautbereich zu behandeln. Um Variationen in dem Expressionsniveau des Gens unter geliefert Experimenten zu minimieren, das Volumen der DNA-Lösung und die Größe der Zielhautoberfläche sollten für den gleichen Satz von Experimenten festgelegt werden. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzeugen, ist es ratsam, dass Wiederholungsversuchen sind von derselben Person durchgeführt werden.

    In Bezug auf die Pistole Gen Vorrichtung und Microseeding, ist die Verwendung eines Bündels von Akupunkturnadeln zu liefern nackte DNA kostengünstig ist. Die Verfahren sind auch unkompliziert. Es erfordert sehr wenig technische Erfahrung, um das acufection Protokoll zu folgen. Acufection verursacht ein minimales Trauma für Tiere und kein Gewichtsverlust nach der Operation gefunden. Die Höhe des Schmerzes ist gering, da durch das Fehlen von signifikanter Verhaltensänderung nach acufection Betrieb beurteilt.

    Zusammengefasst Akupunkturnadeln mit lockern dieHornschicht der Haut von Wirtszellen die DNA-Aufnahme bietet eine kostengünstige Alternative Verfahren ein Protein in der Haut von Mäusen zu exprimieren. Ein breites Spektrum von immunbezogenen Genen funktionell noch in der Haut 21 gekennzeichnet werden, und dies weist auf die Notwendigkeit für eine schnelle Untersuchung eines neuen Gens auf der Haut. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann man leicht feststellen, ob das Produkt des Gens von Interesse jede neue Funktion hat. Dieses acufection Protokoll bietet ein praktisches und machbares Werkzeug für neue Entdeckungen bei der Modulation der Immunantwort der Haut Krankheit zu heilen.

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    Disclosures

    Die Autoren haben keine finanziellen Interessen offen zu legen.

    Acknowledgments

    Diese Arbeit wurde von Finanzhilfe aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048) unterstützt. Wir danken Drs. Betty Wu-Hsieh und Chien-Kuo Lee an der NTU, Leigh Zerboni an der Stanford University und Dr. Peter Hoffmann an der Universität von Hawaii für das Manuskript zu lesen, Yun Chien an der NTU für die technische Unterstützung und Dr. Wen-Chi Wei in Landwirtschaft Biotechnologie Research Center an der Academia Sinica für technische Beratung.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
    NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
    Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
    Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
    2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
    DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
    Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
    Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
    anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
    Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
    DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
    Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
    Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
    Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
    Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
    Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
    Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
    ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
    Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
    Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy

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    References

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    Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung
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    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).More

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

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