Abstract
Zebrafish भ्रूण पहुंच और ऑप्टिकल पारदर्शिता के अपने आसानी के कारण जटिल morphogenetic प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रायोगिक प्रणाली की पेशकश करते हैं। विशेष रूप से, पीछे शरीर बढ़ाव भ्रूण विकास है जिसके द्वारा कई ऊतक विकृतियों एक साथ कार्य शरीर धुरी के एक बड़े हिस्से के गठन को निर्देशित करने में एक आवश्यक प्रक्रिया है। आदेश में लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग द्वारा इस प्रक्रिया का पालन करने के लिए यह एक बढ़ते तकनीक है कि पर्याप्त समर्थन माइक्रोस्कोप और अधिग्रहण करने के लिए स्थानांतरण के दौरान सही ओरिएंटेशन में नमूने बनाए रखने के लिए अनुमति देता है का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, बढ़ते भी अपनी सामान्य विकास को प्रभावित किए बिना पीछे शरीर क्षेत्र के परिणाम के लिए आंदोलन की पर्याप्त स्वतंत्रता प्रदान करनी चाहिए। अंत में, वहाँ विविध इमेजिंग सेट-अप पर इमेजिंग अनुमति देने के लिए बढ़ते विधि की चंचलता में एक निश्चित डिग्री होना चाहिए। यहाँ, हम पीछे शरीर elongatio के विकास इमेजिंग के लिए एक बढ़ते तकनीक मौजूद हैn zebrafish डी rerio में। इस तकनीक को भ्रूण ऐसी है कि सिर और जर्दी थैली क्षेत्रों लगभग पूरी तरह से agarose में शामिल किए गए हैं बढ़ते, जबकि पीछे शरीर क्षेत्र से बाहर जा रही बढ़ाना और सामान्य रूप से विकसित करने के लिए शामिल है। हम दिखा देंगे कि यह कैसे, ईमानदार औंधा और ऊर्ध्वाधर प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी सेट-अप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के पीछे शरीर के लिए इमेजिंग के लिए भ्रूण बढ़ते पर केंद्रित है, यह आसानी से zebrafish विकास के कई पहलुओं का जीना इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
पोस्टीरियर शरीर बढ़ाव जिसके द्वारा भ्रूण शरीर धुरी के एक बड़े हिस्से के रूप में फैली भ्रूण के विकास में एक अनिवार्य प्रक्रिया है। यह एक जटिल प्रक्रिया है जिसके द्वारा मॉर्फ़ोजेनेटिक कई सेल व्यवहार coordinately कार्य व्यक्ति के ऊतकों के स्तर पर morphogenesis उत्पन्न करने का एक उदाहरण है। ये अंतर ऊतक विकृतियों फिर एक साथ कार्य पूरे ढांचे के स्तर पर पीछे शरीर के बढ़ाव उत्पन्न करते हैं। समझ कैसे इन प्रक्रियाओं को नियंत्रित और विकास के दौरान समन्वय कर रहे हैं, हम (अणु, कोशिकाओं, सेल आबादी और ऊतकों के स्तर पर यानी) कई पैमानों पर इन प्रक्रियाओं का पालन करने में सक्षम होना चाहिए और पूरे ढांचे के morphogenesis के लिए सीधे इस से संबद्ध करने की ।
Zebrafish भ्रूण अच्छी तरह से लिव लिए अनुकूल दृष्टिकोण के रूप में उनके ऑप्टिकल पारदर्शिता और छोटे आकार के न्यूनतम इनवेसिव इमेजिंग प्रकाश के आवेदन के लिए अनुमति देता है इमेजिंग पीछे शरीर बढ़ाव के लिए आदर्श होते हैंई इमेजिंग। 1 इस हाल के प्रकाशनों की एक श्रृंखला है कि अणुओं के स्तर पर पीछे शरीर के विकास पर प्रकाश डाला है इसका सबूत दिया गया है, 2 एकल कक्षों, 3 और अंतर-ऊतक व्यवहार, 4 के रूप में अच्छी तरह से सेल की आबादी और पूरे अंग के स्तर पर। 5
ऐसे confocal, बहु photon माइक्रोस्कोपी और चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) के रूप में उन्नत इमेजिंग तकनीक के विकास की प्रक्रिया के दीर्घकालिक इमेजिंग में कमी आई प्रकाश विषाक्तता और तस्वीर विरंजन के प्रभाव के साथ सक्षम कर रहे हैं। लाइव नमूनों की बढ़ते के लिए मजबूत तकनीक तीन लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं: 1) पर्याप्त समर्थन माइक्रोस्कोप के लिए और अधिग्रहण के दौरान स्थानांतरण के दौरान सही ओरिएंटेशन में नमूने बनाए रखने के लिए, 2) नमूना के आंदोलन की पर्याप्त स्वतंत्रता के परिणाम के लिए अनुमति देने के लिए अपनी सामान्य गतिविधियों को प्रभावित किए बिना पीछे शरीर क्षेत्रopment, और अंत में 3) बढ़ते विधि की चंचलता में एक निश्चित डिग्री विविध इमेजिंग सेट-अप पर इमेजिंग की अनुमति है।
इस प्रोटोकॉल zebrafish डी rerio के विकास इमेजिंग के लिए एक बढ़ते तकनीक का परिचय। इस तकनीक के बढ़ते भ्रूण ऐसी है कि सिर और जर्दी थैली क्षेत्रों लगभग पूरी तरह से, agarose में शामिल किए गए हैं, जबकि बढ़ाना और सामान्य रूप से विकसित करने के पीछे शरीर क्षेत्र छोड़ने शामिल है। जैसे, यह भी विकासशील शरीर के अन्य क्षेत्रों के लिए लंबी अवधि के इमेजिंग agarose मानक प्रकाश इमेजिंग तकनीक के द्वारा इमेजिंग सक्षम बनाता है के लिए एक उपयुक्त तरीका है। इस प्रोटोकॉल, एक पार्श्व अभिविन्यास में भ्रूण के बढ़ते दर्शाता है, हालांकि यह भी वैकल्पिक झुकाव में भ्रूण माउंट करने के लिए संभव है। यह आगे, ईमानदार औंधा और ऊर्ध्वाधर प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी व्यवस्था के लिए विधि अनुकूल करने के लिए कैसे दिखाई देंगे।
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Protocol
1. समाधान की तैयारी और खींच लिया गिलास सुई
- 20 मिमी Tris पीएच 8.8 में 4 मिलीग्राम / एमएल Tricaine (3 अमीनो benzoic एसिड एथिल एस्टर, यह भी कहा जाता एथिल 3-aminobenzoate) के एक 25x शेयर समाधान करें और लाने कि समाधान पीएच पर है 7. 4 एमएल और दुकान से अशेष पर -20 डिग्री सेल्सियस।
नोट: संवेदनाहारी Tricaine तंत्रिका वोल्टेज gated सोडियम जिससे मांसपेशियों में ऐंठन और आंदोलन 6 अवरुद्ध चैनलों पर रियायत के तौर पर काम करता है। - E3 भ्रूण मध्यम में 0.17 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में Tricaine का काम कर समाधान करें। 7
नोट: extemporaneously काम कर समाधान के रूप में इस समाधान का पीएच drifts Tricaine बनाओ। - एक माइक्रोवेव में समाधान हीटिंग द्वारा एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में E3 भ्रूण माध्यम में 1.5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कम पिघलने बिंदु agarose भंग। या तो एक पानी के स्नान या पीठ टॉप इनक्यूबेटर में 45 डिग्री सेल्सियस - इस समाधान 42 को संतुलित करते हैं। अगर ऊर्ध्वाधर के लिए बड़े व्यंजन तैयारप्रकाश-शीट इमेजिंग (चरण 4), E3 भ्रूण माध्यम में agarose 1% मानक पिघलने की एक अतिरिक्त 25 एमएल बनाते हैं।
- आयुध डिपो 1.20 मिमी, आईडी 0.69 मिमी, लंबाई 10 मिमी के आयामों के साथ रेशा केशिकाओं के साथ borosilicate ग्लास का प्रयोग करें।
- हीट 600, 120 खींचो, वेग 50, टाइम 225, दबाव 500 तेज संदंश की एक जोड़ी के साथ, तोड़: केशिकाओं हीटिंग रेशा सुई खींचने के प्रकार के उपकरण और अभिकर्मकों, निम्न सेटिंग्स का उपयोग की तालिका में वर्णित पर खींच रहे हैं सुई सिर्फ बात पिछले जिस पर यह भ्रूण orientating और अतिरिक्त agarose हटाने के लिए एक स्वच्छ और तेज सुई बनाने के लिए flexes। एक माइक्रो-छुरी भी अतिरिक्त agarose दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
उल्टे या सीधा माइक्रोस्कोपी के लिए भ्रूण की 2. एम्बेडिंग
- E3 भ्रूण माध्यम में उचित मंच पर भ्रूण ऊपर उठाएँ। 7
- अपेक्षित स्तर पर, एक दूरबीन dissec के नीचे तेज संदंश की एक जोड़ी के साथ dechorionate भ्रूणटिंग माइक्रोस्कोप।
- Tricaine काम समाधान में कम से कम 5 मिनट के लिए dechorionated भ्रूण सेते हैं।
- एक बार जब पिघल agarose समाधान 45 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया गया है, E3 के माध्यम से कम से कम हस्तांतरण के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब में सीधे dechorionated भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करें।
- बढ़ते मध्यम के लगभग 1 मिलीलीटर के साथ मिलकर भ्रूण निकालें और लगभग जोड़ें। एक 10 मिमी microwell के साथ एक 35 मिमी गिलास तली पेट्री डिश के केंद्रीय सर्कल के लिए भ्रूण के साथ एक साथ बढ़ते मध्यम के 100 μl।
- के रूप में बढ़ते मध्यम स्थापित कर रहा है, पूंछ बाहर (चित्रा 1 ए) का सामना करना पड़ के साथ agarose के चक्र के किनारे करने के लिए भ्रूण चलते हैं। वांछित पार्श्व अभिविन्यास में भ्रूण बनाए रखने के लिए जब तक जेल पूरी तरह से सेट किया गया है केशिका सुई का प्रयोग करें। छवि के पीछे शरीर के विकास के लिए, संभव के रूप में पार्श्व एक अभिविन्यास में भ्रूण बोध कराता है ख्याल रखना। इसलिए, सावधान adjustmen द्वारा इस स्थिति में भ्रूण को बनाए रखने केकेशिका सुई के साथ TS।
नोट: कई भ्रूण यदि आवश्यक हो, इस बिंदु पर बढ़ते डिश के लिए जोड़ा जा सकता है। यदि यह मामला है, हस्तांतरण पहले डिश में agarose कम पिघल और agarose बूंद के केंद्र के लिए भ्रूण जोड़ें। फिर, भ्रूण कांच की अंगूठी के किनारों को बाहर धक्का और वांछित स्थिति में बोध। छह भ्रूण अप करने के लिए इस तरह से पहले agarose जम जाता रखा जा सकता है।
लगभग पोस्टीरियर शरीर अतिरिक्त agarose की 3. निकालना
नोट: इस खंड की प्रक्रिया है जिसके द्वारा agarose पीछे शरीर के आसपास के क्षेत्र से हटा दिया जाता है वर्णन करता है। पीछे शरीर बढ़ाव के मामले में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूंछ बढ़ने-आउट कर सकते हैं सामान्य रूप से महत्वपूर्ण है। agarose हटाने के बाद भ्रूण पूरी तरह से agarose द्वारा शामिल किया गया है द्वारा, भ्रूण सिर क्षेत्र और जर्दी थैली के लगभग आधे से घिरा छोड़ दिया है।
- एक बार agarose ड्रॉप का गठन किया है, पेट्री di बाढ़Tricaine काम कर समाधान के साथ एसएच।
- एक प्रेषित प्रकाश आधार के साथ एक विदारक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप के तहत, दर्पण की स्थिति और घटना प्रकाश के कोण कि इस तरह के मजबूत विपरीत ऑपरेशन के माध्यम से स्पष्ट रूप से देखा जा करने के लिए agarose में कटौती के लिए अनुमति देता है समायोजित करें।
- कट प्रदर्शन करने के लिए 1 (चित्रा 1), केशिका सुई या सूक्ष्म छुरी का प्रयोग कर एक स्थिति से जर्दी साथ agarose मध्य मार्ग में कटौती करने के लिए सिर्फ विखंड 5 (5 वीं की स्थिति के गठन के दिल क्षेत्र के लिए पीछे पूर्वकाल विखंड)।
- प्रारंभिक रूप में दिखाया गठन दिल से सटे कटौती, और कांच के लिए agarose के माध्यम से पूर्ण तरीके से शुरू।
- Agarose के भीतर गहरे केशिका या सूक्ष्म छुरी रखें, और धीरे धीरे ऊपर देखा और थोड़ी देर के रूप में दिखाया चित्रा 1 भ्रूण के ऊपर एक लंबी कटौती बनाने के लिए शुरुआत नीचे। भ्रूण या जर्दी puncturing के बिना संभव के रूप में भ्रूण के करीब के रूप में काट लें।
- इसके बाद, कर में कटौती 2 और 3 (चित्रा 1 नोट: कांच सर्कल के किनारे जब तक agarose काटना एक पूरा ब्लॉक (3.6 कदम) के रूप में agarose हटाने में एड्स (चित्र 1 में दिखाया गया है)। बहरहाल, यह आवश्यक नहीं है।
- कटौती 1 और 3 के चौराहे पर शुरू, जबकि धीरे-धीरे आदेश पीछे शरीर आसपास agarose के वर्ग को बेदखल करने के लिए ऊपर की ओर उठाने कटौती 2 के अंत की दिशा में एक धीमी गति से विकर्ण काट कर।
नोट: कुछ मामलों में, यह एक ब्लॉक में जारी किया जाएगा और ऑपरेशन एक ही बार में पूरा हो गया है। अन्य लोगों में, यह सब भ्रूण आसपास agarose जिले दर्ज करने के लिए कई प्रयास लग सकता है। - तेज संदंश की एक जोड़ी के साथ, हटाने उखाड़ फेंकना खभ्रूण माध्यम से agarose के ताले। इस प्रक्रिया में सहायता, पकवान के पक्ष में agarose टुकड़े चाल और agarose टुकड़े बाहर उठाने whilst समर्थन के रूप में पेट्री डिश की दीवार का उपयोग करने के लिए।
चित्रा 1: बढ़ते सेट-अप के चित्र। (ए) आरेख एक पेट्री डिश के केंद्र कांच रिंग के भीतर घुड़सवार भ्रूण की स्थिति से पता चलता। सही पर agarose dottted लाल लाइनों के साथ दिखाया आसपास के माध्यम से एक के बाद एक कटौती के साथ भ्रूण के एक ज़ूम है। (बी) घुड़सवार भ्रूण दोनों उल्टे और ईमानदार उद्देश्यों के लिए उपयोग में आसानी प्रदर्शित पार्श्व दृश्य में diagrammed है। (सी) एक समान digram दिखा भ्रूण खड़ी प्रकाश शीट इमेजिंग सेट-अप के लिए रखा जा सकता है कि कैसे। सीएल कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ Ick।
- मांसपेशी हिल पूरी तरह से उस बिंदु पर अवरुद्ध नहीं है, तो 4 मिलीग्राम / एमएल, पीएच 7 के शेयर समाधान से Tricaine की बूँदें जोड़ें।
4. ऊर्ध्वाधर प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए भ्रूण के बढ़ते
नोट: यह तरीका है कि ऊपर उल्लिखित पर एक बदलाव खड़ी केंद्रित SPIM द्वारा नमूनों की इमेजिंग के लिए कई उद्देश्यों के लिए उपयोग के लिए अनुमति देता है। इस बदलाव के पीछे विचार यह नमूना डिश के तल की तुलना में थोड़ा अधिक उठाने के लिए, दो इमेजिंग उद्देश्यों की आसान पहुँच के लिए अनुमति देने के लिए है।
- बढ़ते नमूना करने से पहले, कोट और 5 मिमी की ऊंचाई तक E3 के माध्यम में 1% agarose के साथ एक 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं।
- 1 मिलीलीटर कम पिघलने बिंदु agarose की एक बूंद पकवान के केंद्र के लिए जगह है और स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं।
- खंड 2. हालांकि के रूप में कम पिघलने बिंदु agarose में एम्बेड भ्रूण, इस बार, 50 मिलीलीटर ट्यूब से हटाने भ्रूणका समाधान (0.5 एमएल) के एक छोटे गिरावट के साथ agarose और 1 के शीर्ष पर इस छोटी सी बूंद जगह डिश के केंद्र में छोड़ मिलीलीटर।
- छोटी सी बूंद के केंद्र में भ्रूण जगह है और इसका सही ओरिएंटेशन बनाए रखने के लिए जब तक जेल सेट है केशिका सुई का प्रयोग करें।
- Tricaine काम कर समाधान के साथ पकवान बाढ़ और धारा 3 के रूप लेकिन 1% मानक agarose की गद्दी के माध्यम से काटने के बिना अतिरिक्त agarose हटा दें।
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Representative Results
प्रोटोकॉल ऊपर उल्लिखित लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग के लिए zebrafish भ्रूण के बढ़ते के लिए एक बहुमुखी तकनीक का विवरण। इस का एक उदाहरण चित्रा 2A में और एनिमेटेड / वीडियो चित्र 1 में दिखाया गया है। भ्रूण mRNA photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन kikumeGR एन्कोडिंग के साथ 1 सेल चरण में इंजेक्ट किया गया। 15 विखंड चरण में वे ऊपर के रूप में एक 10x उद्देश्य के साथ एक औंधा confocal खुर्दबीन पर वर्णित है और 12 घंटे के लिए imaged घुड़सवार थे। जिसके परिणामस्वरूप confocal ढेर ज़्यादा से ज़्यादा के रूप में दिखाया प्रदर्शित करने के लिए पेश किया गया। इस फिल्म में स्पष्ट रूप से पता चलता है कि पीछे शरीर फिल्म की अवधि के दौरान स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए अनुमति दी है और भ्रूण है कि सामान्य संस्कृति की स्थिति में उनकी जरायु की स्वतंत्र रूप से विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है के रूप में देखा आकृति विज्ञान में इसी प्रकार के परिवर्तन से पता चलता है।
एक अतिरिक्त उदाहरण एफ igure 2 बी में दिखाया गया हैऔर एनिमेटेड / वीडियो चित्रा 2। इधर, भ्रूण एन्कोडिंग हिस्टोन 2 बी-mCherry प्रोटीन (कि नाभिक लेबल) और EGFP mRNAs का एक संयोजन के साथ 16 सेल चरण में इंजेक्ट किया गया: CAAX बॉक्स (कि झिल्ली लेबल; 5 जानकारी के संदर्भ देखें)। वे तो के रूप में चित्रा 1 बी में diagrammed एक पानी विसर्जन 25X उद्देश्य के साथ एक ईमानदार multiphoton खुर्दबीन पर imaged थे। छवियाँ आदेश tailbud गठन के दौरान सेलुलर व्यवहार की कल्पना करने में 10 विखंड मंच से 3 घंटे के लिए ले जाया गया। प्रकोष्ठों सक्रिय उभार और tailbud रूपों सामान्य रूप दिशात्मक आंदोलनों पैदा करने के लिए देखा जा सकता है।
चित्रा 2: 10 x बढ़ाई पोस्टीरियर शरीर बढ़ाव के समय चूक इमेजिंग के उदाहरण हैं। (ए) लगातार फ्रेमअक्षीय बढ़ाव की प्रक्रिया को कवर एक प्रतिनिधि फिल्म की। भ्रूण छवि के दाईं ओर करने के लिए पीछे के साथ पार्श्व दृश्य में दिखाया जाता है। (बी) के एक उच्च बढ़ाई फिल्म tailbud गठन के दौरान अलग-अलग सेल व्यवहार दिखाने का लगातार फ्रेम। भ्रूण सही करने के लिए पीछे के साथ पार्श्व दृश्य में दिखाया जाता है। बिंदीदार लाइनों के गठन की रूपरेखा तैयार tailbud। छोटा सा रंग लाइनों के नाभिक की पटरियों अलग-अलग सेल आंदोलनों का पालन करने के लिए दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एनिमेटेड / वीडियो चित्रा 1: एक KikumeGR mRNA के पीछे शारीरिक बढ़ाव की फिल्म समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा zebrafish भ्रूण इंजेक्शन। भ्रूण छोड़ दिया और पोस्टर के लिए पूर्वकाल के साथ दिखाया गया हैआईओआर सही करने के लिए। छवियाँ 10X बढ़ाई पर 10 मिनट के अंतराल पर ले जाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एनिमेटेड / वीडियो चित्रा 2: एक परमाणु mCherry और झिल्ली-GFP लेबल zebrafish भ्रूण दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged के पीछे शारीरिक बढ़ाव की फिल्म समय चूक। भ्रूण दाएं और बाएं के पीछे करने के लिए पूर्वकाल के साथ दिखाया गया है। छवियाँ 25X बढ़ाई पर 2 मिनट के अंतराल पर ले जाया गया। रंग की लाइनों प्रत्येक पर नज़र रखी सेल के लिए पिछले दस समय-चरणों के लिए कोशिकाओं की पटरियों प्रदर्शित करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस बढ़ते तकनीक के लिए सक्षम बनाता भ्रूण माइक्रोस्कोप और अधिक से अधिक लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग प्रयोगों कई लंबाई पैमाने पर पीछे शरीर बढ़ाव निम्नलिखित के उद्देश्य के लिए स्थानांतरण के दौरान अभी भी रखा जा सकता है। इसके अलावा, यह बहुमुखी है कि यह दोनों ईमानदार और उल्टे माइक्रोस्कोपी सेट-अप पर इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, और एक सुझाव है कि यह कैसे आगे खड़ी केंद्रित SPIM लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए बनाया गया है।
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम पीछे शरीर है कि इस संरचना के सामान्य विकास की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है आसपास के अतिरिक्त agarose से सावधान हटाने है। यह ख्याल खासकर जब जर्दी के ऊपर चारों ओर agarose हटाने, भ्रूण को नुकसान पहुँचाए नहीं में यहाँ लेने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, ध्यान जब भ्रूण के चारों ओर से कटौती agarose ब्लॉक हटाने के रूप में कभी कभी यह इस प्रक्रिया के दौरान मोल्ड से भ्रूण कम करने के लिए संभव है लिया जाना चाहिए। इन कारणों के लिए, यह एक कम throughput विधि Tha हैटी विपरीत में पहले से ही प्रकाशित करने के लिए 3 डी मुद्रित प्लास्टिक molds के उपयोग के तरीकों, कई zebrafish भ्रूण के बढ़ते एक साथ के लिए उपयुक्त नहीं है। 8, 9 हालांकि, भ्रूण अत्यधिक स्थिर इस बढ़ते विधि से कर रहे हैं और इसलिए माइक्रोस्कोप बहुत आसान करने के लिए ले जाया जा सकता है, और पीछे शरीर बढ़ाव भर में अपने 3 डी उन्मुखीकरण बरकरार रहती है।
एक और महत्वपूर्ण कदम भ्रूण के प्रारंभिक पार्श्व उन्मुखीकरण की सटीकता, किसी भी Antero पीछे या dorso उदर झुकाव से परहेज है। या तो झुकाव पीछे शरीर विस्तार है, जो आगे के विश्लेषण के लिए देखने के लिए सबसे सुविधाजनक कोण है के पार्श्व दृष्टि रोकना होगा। Antero पीछे झुकाव होगा क्षैतिज विमान है, जो Z में उच्च के ढेर और एक कम समय संकल्प के साथ इस प्रकार समय-खामियों के अधिग्रहण का मतलब होगा करने के लिए सम्मान के साथ नीचे आगे बढ़ रही है या पीछे शरीर में इसके परिणाम में।
इस विधि ve हैrsatile और Fucci लाइन 5, 10 के उपयोग के रूप में अच्छी तरह से बहु-अदिश morphometric विश्लेषण के रूप में साथ कोशिका विभाजन दरों की इमेजिंग के लिए अनुमति दी गई है। 5 हालांकि, पीछे शरीर धुरी के बढ़ाव के दौरान tailbud के नाटकीय समग्र विस्थापन दिया, केवल अपेक्षाकृत कम बढ़ाई उद्देश्यों को पूरी प्रक्रिया इस तरह कब्जा करने के रूप में चित्रा 2 में दिखाया इस्तेमाल किया जा सकता है। अधिग्रहण के 4 घंटा (वीडियो चित्रा 1) - यह इसलिए है क्योंकि ब्याज के क्षेत्र में उच्च वृद्धि के परिणाम 3 के भीतर देखने के क्षेत्र छोड़ने है। इसलिए, एक तरह से आगे tailbud की इमेजिंग में सुधार करने के लिए एक स्वचालित ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म है कि tailbud के समग्र आंदोलन को ट्रैक और अधिग्रहण के दौरान एक्स, वाई, जेड खुर्दबीन मंच की स्थिति को समायोजित कर सकते है। यहाँ वर्णित बढ़ते विधि के साथ सभी अक्षीय आयामों में भ्रूण की वृद्धि की स्थिरता को देखते हुए यह करने के लिए उत्तरदायी होना चाहिएइस तरह का एक दृष्टिकोण।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
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