Summary
Este trabajo describe un nuevo protocolo para evaluar la ecotoxicidad de contaminantes, incluyendo contaminantes emergentes como nanomateriales, utilizando la bacteria marina Vibrio anguillarum . Este método permite determinar la CL 50 , o mortalidad, la concentración que causa una disminución del 50% en la cultivabilidad de las bacterias, después de una exposición de 6 h.
Abstract
Las bacterias son un componente importante del ecosistema, y las alteraciones de la comunidad microbiana pueden tener un efecto significativo sobre el ciclo biogeoquímico y las redes alimenticias. Las pruebas de toxicidad basadas en microorganismos son ampliamente utilizadas porque son relativamente rápidas, reproducibles, baratas y no están asociadas con problemas éticos. En este trabajo se describe un método ecotoxicológico para evaluar la respuesta biológica de la bacteria marina Vibrio anguillarum. Este método evalúa la toxicidad aguda de los compuestos químicos, incluyendo nuevos contaminantes tales como nanopartículas, así como muestras ambientales. El punto final es la reducción de la cultivabilidad bacteriana ( es decir, la capacidad de replicar y formar colonias) debido a la exposición a un tóxico. Esta reducción puede denominarse generalmente mortalidad. La prueba permite la determinación de la LC 50 , la concentración que provoca una disminución del 50% de las bacterias que se replican activamente y forman colonias, después deUna exposición de 6 h. Las bacterias cultivables se cuentan en términos de unidades formadoras de colonias (CFU), y se evalúa la "mortalidad" y se compara con el control. En este trabajo se evaluó la toxicidad del sulfato de cobre (CuSO 4 ). Se observó una clara relación dosis-respuesta, con una CL 50 media de 1,13 mg / L, después de tres pruebas independientes. Este protocolo, comparado con los métodos existentes con microorganismos, es aplicable en un rango más amplio de salinidad y no tiene limitaciones para muestras coloreadas / turbias. Utiliza solución salina como medio de exposición, evitando posibles interferencias del medio de crecimiento con los contaminantes investigados. El cálculo LC 50 facilita las comparaciones con otros bioensayos comúnmente aplicados a las evaluaciones ecotoxicológicas del medio marino.
Introduction
Los bioensayos ecotoxicológicos evalúan la toxicidad de los productos químicos o muestras ambientales con modelos biológicos estándar, integrando los efectos de los factores de estrés físicos, químicos y biológicos en los ecosistemas. Debido a la complejidad de los ecosistemas, las evaluaciones de riesgo ecotoxicológico deben considerar una batería de bioensayos que involucran organismos de diferentes niveles tróficos. Los ensayos de toxicidad en animales de laboratorio pueden ser costosos, consumir mucho tiempo y ser éticamente cuestionables. La campaña para limitar las pruebas con animales y desarrollar enfoques alternativos ( por ejemplo, sobre bacterias y animales no vertebrados) es ahora un tema central, tal como se ha informado en el marco de la actual legislación europea, incluida la Directiva de protección de los animales de la UE. Directiva sobre cosméticos de la UE y REACH.
Los crustáceos, los peces y las algas se utilizan en gran medida para la medición de la toxicidad en el medio marino 1 . Las bacterias son un componente importanteT del ecosistema y las alteraciones en las comunidades microbianas pueden tener efectos significativos sobre el ciclo biogeoquímico y otros servicios críticos de los ecosistemas. Las pruebas de toxicidad basadas en microorganismos están ganando popularidad porque son relativamente rápidas, reproducibles y baratas y no plantean problemas éticos 2 . El objetivo de este trabajo es describir un protocolo ecotoxicológico para evaluar la respuesta de la bacteria marina Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) cuando se exponen a contaminantes ambientales.
V. anguillarum es una bacteria de vástago Gram-negativa, corta, curva-formada (0.5 x 1.5 μm) con un flagelo polo. Se encuentra típicamente en agua salobre o salada, es halotolerante, con una salinidad óptima de aproximadamente 20 y una temperatura óptima entre 25 y 30 ° C 3 . Se ha elegido como un modelo de organismo debido a su ubicuidad y sus importantes papEn todo el mundo 4 . Se sabe que algunos serotipos de V. anguillarum causan vibriosis en una variedad de especies de peces marinos o salobres 5 , 6 . Para ello, algunas etapas del experimento requieren prácticas microbiológicas estándar, pero no se necesitan equipos especiales de seguridad o precauciones. El protocolo de prueba de toxicidad propuesto utiliza la cultivabilidad bacteriana ( es decir, la capacidad de replicar y formar colonias) como punto final y permite la determinación de la CL 50 , la concentración que provoca una reducción del 50% de bacterias que se replican activamente y forman colonias después de Una exposición de 6 horas. En Vibrio , como en otros microbios, esta reducción, que generalmente indicamos como mortalidad, puede ser parcialmente debida a individuos en la fase viable pero no cultivable (VBNC) 7 . En este estudio, se aplicó este método para medir los efectos tóxicos del sulfato de cobre (CuSO 4), Un tóxico de referencia.
Este método fue desarrollado para proporcionar una prueba adecuada basada en microorganismos para la evaluación ecotóxica de contaminantes / compuestos químicos, incluyendo contaminantes emergentes como nanomateriales. La novedad de este protocolo en comparación con los métodos existentes utilizados para los microorganismos se relaciona principalmente con el medio de exposición y el punto final. De hecho, la exposición se lleva a cabo en solución salina, evitando cualquier posible interferencia del medio de crecimiento con los contaminantes investigados, que pueden influir en la respuesta biológica 8 . El criterio de valoración es la reducción de la cultivabilidad bacteriana, que puede compararse fácilmente con otros criterios de valoración utilizados para el cribado ecotoxicológico en ambientes marinos / salobres, basados en la supervivencia / mortalidad. Por otra parte, el protocolo utiliza la técnica de líquido-a-placa micro-recuentos, ya utilizado en E. coli 9 , reduciendo los volúmenes y, por tanto, el ef experimental(Véanse los pasos 3.3 y 3.4 del protocolo para más detalles).
Protocol
1. Preparación de Reactivos / Materiales
- Preparar (aproximadamente 300) tubos estériles de 1,5 ml para la dilución en serie de suspensiones bacterianas, así como tubos estériles de 15 ml como recipientes de ensayo marcados con las concentraciones de ensayo.
- Preparar una solución de NaCl al 2% como medio de exposición y esterilizarla. Alternativamente, use agua de mar sintética o natural esterilizada, con salinidad que oscila entre 5 y 40.
- Preparar el medio de crecimiento de agar de soja triptico (TSA) con NaCl al 2% de acuerdo con las direcciones de la etiqueta y considerando la cantidad de NaCl ya presente en el medio.
- Verter el TSA (fresco, pero todavía líquido) en las placas de Petri de 90 mm previamente marcadas con la concentración de la prueba y el tiempo de exposición, el número de replicación y el factor de dilución; 19 ml es un volumen apropiado.
- Preparar el medio de crecimiento triptico de caldo de soja (TSB) de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta. Añadir la cantidad apropiada de NaCl para obtener la misma salinidad que el medio de exposición.
- PrepararUna solución madre de CuSO4 con agua destilada y esterilizar la alícuota (necesaria) utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm. En el caso de muestras ambientales, preparar un intervalo apropiado de diluciones de la muestra y esterilizarlas utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm.
- Preparar las soluciones de ensayo en los tubos de 15 ml marcados con las concentraciones de ensayo. Llene el control negativo con 5 ml del medio de exposición (NaCl al 2%). Llenar los otros tubos con la cantidad apropiada de medio de exposición y solución madre de CuSO4 para obtener las concentraciones de ensayo en un volumen final de 5 ml.
2. Preparación del Inoculo Bacteriano
- 12-18 h antes de la prueba, preparar un cultivo líquido fresco de Vibrio anguillarum . Usando un bucle estéril, seleccione una única colonia bien aislada de un cultivo durante la noche en un medio sólido (TSA). Inocular un tubo lleno con 10 ml de TSB e incubar el cultivo bacteriano a 25 ° C durante 12-18 h. Después de 12-18 h, estimar la concentración bacteriana del inóculo espectrofotométricamente. Vortex el inóculo y medir la densidad óptica a 600 nm de longitud de onda, utilizando TSB como blanco.
- Para obtener una concentración bacteriana conocida, diluir 2 ml del inóculo vorticial añadiendo la cantidad de TSB calculada mediante esta fórmula:
TSB ml = [(OD / 0,14) * 2] - 2. - Verificar que la densidad óptica del inóculo diluido es 0.140 (± 0.005), lo que corresponde al punto 0.5 del patrón nefelométrico de McFarland.
- Centrifugar el inóculo diluido durante 10 min a 3.000 g . Elimine el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo microbiano en 1 ml de solución de NaCl al 2% (medio de exposición).
3. Prueba de exposición
- Añadir 150 μl del inóculo bacteriano resuspendido a cada tubo, incluyendo el control. Incubar las suspensiones de V. anguillarum durante 6 h a 25 ° C bajo oscuridad y en continuoS para evitar la sedimentación.
- Al comienzo (T 0 ) y al final (T 6 ) del tiempo de exposición, realizar el recuento bacteriano en todas las suspensiones bacterianas expuestas utilizando métodos de recuento de unidades formadoras de colonias (CFU).
- Preparar diluciones en serie de cada suspensión bacteriana expuesta por triplicado, aplicando un factor de dilución de diez veces (hasta 10 -5 ). Añadir 100 μl de cada suspensión bacteriana al tubo correspondiente ya lleno con 900 μl de medio de exposición (NaCl al 2%). Proceda con la dilución en serie, vortexing en cada paso para volver a suspender las bacterias.
- Plato 10 μ l de la 10 -4 y 10 -5 diluciones en TSA Petri platos en el segmento correspondiente. Rápidamente deje que las gotas se deslizan en un pequeño círculo girando la placa. Incubar las placas a 25 ° C durante 48 h.
4. Cuenta de CFU
- Después de 48 h, cuente las colonias cultivadas en las placas de Petri; Platos que albergan bEntre 5 y 50 colonias son óptimas para contar con precisión.
- Calcular el número de bacterias viables por ml de cada suspensión bacteriana expuesta aplicando las siguientes fórmulas:
10 -4 rightarrow CFU / mL = n ° CFU x 100 x 10.000
10 $ ^ {-} $ → CFU / ml = n ° CFU x 100 x 100,000 - Utilizar el promedio de los recuentos obtenidos en repeticiones paralelas para evaluar la mortalidad en comparación con el control. Calcular la mortalidad como un porcentaje con la siguiente fórmula:
M% = 100 - [(N / C) * 100]
NOTA: Donde N = número de CFU / mL crecido después de la exposición al tóxico; C = número de UFC cultivadas en el medio de control. - Calcule la LC 50 ( es decir, la concentración de tóxico que reduce el número de bacterias que se replican activamente en un 50% por ml, CFU / mL) con un análisis de regresión no lineal usando un software estadístico apropiado. Ejecutar un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) follDebido a post-hoc pairwise t- tests para evaluar diferencias significativas entre los tratamientos.
Representative Results
Los resultados de tres ensayos independientes de exposición de V. anguillarum a cuatro concentraciones de CuSO 4 muestran una clara relación dosis-respuesta y una disminución significativa de bacterias que se replican activamente y forman colonias con una concentración creciente del tóxico de referencia ( Figura 1 ; ANOVA, F = 20,28, p & lt; 0,001). El número de UFC / ml se reduce significativamente a 1,25 mg / L (prueba de Tukey post-hoc, p <0,05) en comparación con el control (CNTR). Se detectaron bacterias cultivables en la concentración más alta ensayada. No se encontraron diferencias en la toxicidad de CuSO 4 a lo largo del amplio rango de salinidad del medio de exposición ( es decir, 5, 20 o 35 g / L de NaCl, datos no mostrados). Un resultado representativo del análisis estadístico que muestra la regresión no lineal se informa en la Figura 1 complementaria . Los valores de CL50 calculados para los tres ensayos independientes (<Fuerte> Tabla 1) destacar la viabilidad y reproducibilidad de este método.
Figura 1: Vibrio anguillarum expuesto a CuSO 4. El número medio de CFU / mL (CFU = unidad formadora de colonias) expuesto a diferentes concentraciones de CuSO 4 durante 6 h. Los valores representan la media (± DE) de tres ensayos independientes. Las reducciones de bacterias que se replican activamente y forman colonias con respecto al control (CNTR) se indican en las casillas amarillas (como porcentajes). Las diferencias significativas con el control, basadas en una prueba post-hoc de Tukey, se indican con asteriscos (* = p <0,05; ** = p <0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Valores de concentración letal (LC 50 ) para Vibrio anguillarum expuestos a CuSO 4 . Se informan los resultados de tres ensayos y medias independientes (± DE).
Figura 1: Análisis de regresión no lineal. Resultado representativo de un análisis de regresión no lineal (modelo Logit-Hill) realizado sobre los resultados de la prueba. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Discussion
Este trabajo describe un nuevo bioensayo con la bacteria marina V. anguillarum que se aplicó con éxito para evaluar los efectos tóxicos de CuSO 4 , un tóxico de referencia, demostrando una clara relación dosis-respuesta. La bacteria marina V. anguillarum fue elegida como organismo modelo porque es halotolerante, omnipresente y representativa de los ecosistemas marinos.
La prueba puede realizarse a una amplia gama de valores de salinidad (5-40) y puede utilizar soluciones salinas y aguas de mar sintéticas o naturales como medio de exposición, siempre y cuando los microorganismos puedan sobrevivir fácilmente durante toda la prueba. Esto permite el análisis de diferentes tipos de muestras, incluyendo ambientes salobres y marinos.
No se requiere ningún medio de crecimiento durante la fase de exposición, evitando su interferencia con los contaminantes 8 y su posible influencia en la respuesta biológica. ThEl protocolo es confiable, rápido, rentable y relativamente fácil. El procedimiento de microcuenta de líquido a placa 9 da la ventaja de utilizar volúmenes pequeños (de muestra), aunque esto implica un alto grado de precisión y robustez. Los resultados de los tres ensayos independientes y repeticiones para cada tratamiento muestran la alta repetibilidad de este método. El uso de la bacteria como modelo biológico, así como la adaptabilidad de la técnica, favorecen la relevancia ecológica y ambiental de este procedimiento. Otros aspectos técnicos críticos son la precisión en la preparación del inóculo bacteriano y la esterilidad requerida en algunas etapas del procedimiento.
La prueba propuesta es más rápida (6 h) que otros ensayos ecotoxicológicos marinos (24-96 h) y no plantea los problemas éticos derivados del uso de organismos superiores. Además, los datos sobre el tóxico de referencia muestran valores de CL50 comparables con los obtenidos con En otras especies marinas 10 , 11 , lo que demuestra una buena sensibilidad. Entre los bioensayos bacterianos, la prueba de inhibición de la luminiscencia de V. fischeri es la más común y bien estandarizada 12 . Este bioensayo es muy rápido (15-30 minutos) y es válido para el análisis de muestras en fase sólida, pero puede verse afectado por muestras de color y turbidez, que interfieren con las mediciones de luminiscencia. La salinidad es un factor limitante en el uso de la prueba mencionada anteriormente, con un 2% de NaCl requerido 13 . Por el contrario , la prueba propuesta aquí con V. anguillarum da resultados asequibles en una amplia gama de valores de salinidad, no tiene limitaciones con respecto a muestras turbias o coloreadas y requiere equipos menos costosos en comparación con los analizadores de luminiscencia. Una comparación entre los resultados de nuestro estudio y los disponibles en la literatura para V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 muestra valores CE50 comparables, lo que apoya aún más la eficacia de este bioensayo.
Este bioensayo evalúa la reducción de la cultivabilidad bacteriana, generalmente referida como mortalidad, en lugar de la tasa de crecimiento poblacional o inhibición de la actividad enzimática, que se utilizan en las pruebas disponibles actualmente para microorganismos. El cálculo LC 50 permite la comparación con otros bioensayos comúnmente aplicados a la evaluación ecotoxicológica de ambientes marinos, que a menudo tienen la supervivencia / mortalidad como punto final. Es urgente realizar un ejercicio de intercalibración para evaluar / confirmar la fiabilidad y reproducibilidad de esta prueba y para apoyar su estandarización y uso en protocolos reguladores.
El uso creciente de nanomateriales y su liberación potencial en el medio ambiente implica la necesidad de una evaluación de riesgos 17 . Sin embargo, clas(Eco) toxicológicos para estos contaminantes emergentes no parecen dar resultados asequibles y pueden requerir algunas adaptaciones 18 . Las características de este nuevo bioensayo permiten su fácil y útil aplicación a la evaluación de la toxicidad de las nanopartículas. De hecho, la posibilidad de llevar a cabo el ensayo a diferentes salinidades dará cuenta del comportamiento de nanopartículas bajo diferentes fuerzas iónicas, un parámetro ambiental variable que puede afectar significativamente la toxicidad 19 . Además, en las evaluaciones de ecotoxicidad de las nanopartículas no se recomienda el uso de medio de crecimiento y nutrientes, ya que las sustancias orgánicas pueden facilitar su absorción aumentando los efectos tóxicos 20 o pueden causar agregación reduciendo la fracción biodisponible y por lo tanto su toxicidad 21 .
En conclusión, el bioensayo sobre Vibrio anguillarum es apRomising para la evaluación del riesgo de los contaminantes clásicos y emergentes, así como para la evaluación del estado de los ambientes marinos y salobres.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el proyecto de investigación "NanoBioTech ambiente e salute Progetto 2: Ambiente y metodología para el monitor ecológico ecotossicológico de la nanopartícula" ( "Nano-BioTechnology: environment and health. Control de nanopartículas " ) otorgado a LM por Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR fue financiado por una beca postdoctoral de la Universidad de Tor Vergata / Regione Lazio-Consorcio Hipatia en el marco del proyecto anteriormente citado. Un acuerdo con la Universidad ISPRA-Tor Vergata (N. 2015/52857) permitió el uso mutuo de las instalaciones y el intercambio de investigadores.
Los autores están en deuda con la Prof. María Cristina Thaller, nuestro ángel de la guarda por todas las actividades microbianas, por despertar el interés en el mundo microbiano y por ayudar fuertemente a mejorar nuestra investigación sobre el tema. Los autores agradecen a Andrea Tornambè y EriKa Magaletti por la preciosa colaboración con el Laboratorio ISPRA de Fitoplancton ecología y ecotoxicología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
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