Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול חדש להערכת אקוטוקסיטי של מזהמים, כולל מזהמים מתעוררים כגון ננו, באמצעות חיידקים ימיים Vibrio anguillarum . שיטה זו מאפשרת לקבוע את LC 50 , או תמותה, הריכוז שגורם לירידה של 50% בתרבית החיידק, לאחר חשיפה של 6 שעות.
Abstract
חיידקים הם מרכיב חשוב של המערכת האקולוגית, ושינויים בקהילה מיקרוביאלית יכולה להיות השפעה משמעותית על אופניים ביוגיוכימיים וקווי מזון. בדיקות רעילות המבוססות על מיקרואורגניזמים נמצאים בשימוש נרחב כי הם יחסית מהירה, לשחזור, זול, אינם קשורים עם בעיות אתיות. כאן, אנו מתארים שיטה אקוטוקסיקולוגית כדי להעריך את התגובה הביולוגית של החיידק הימי Vibrio anguillarum. שיטה זו מעריכה את הרעילות החריפה של תרכובות כימיות, כולל מזהמים חדשים כגון חלקיקים, כמו גם דגימות סביבתיות. נקודת הקצה היא הפחתת תרבותיות חיידקית ( כלומר, היכולת לשכפל וליצור מושבות) עקב חשיפה לרעלים. הפחתה זו יכולה להיות מכונה תמותה. המבחן מאפשר לקבוע את ה- LC 50 , הריכוז שגורם לירידה של 50% בחיידקים שמשכפלים באופן פעיל ויוצרים מושבות, לאחרחשיפה 6 שעות. חיידקים culturable נספרים במונחים של יחידות להרכיב מושבה (CFU), ואת "תמותה" מוערכת לעומת שליטה. בעבודה זו, רעילות של סולפט נחושת (CuSO 4 ) הוערך. החוקרים מצאו קשר ברור בין מינון התגובה, עם ממוצע LC 50 של 1.13 מ"ג / ליטר, לאחר שלוש בדיקות עצמאיות. פרוטוקול זה, בהשוואה לשיטות הקיימות עם מיקרואורגניזמים, מיושם בטווח רחב יותר של מליחות ואין לו מגבלות על דגימות צבעוניות / עכירות. היא משתמשת תמיסת מלח כמו מדיום חשיפה, הימנעות כל הפרעות אפשריות של המדיום הצמיחה עם זיהום מזהמים. חישוב LC 50 מאפשר השוואות עם bioassays אחרים נפוץ להחיל הערכות אקוטוקסיקולוגיות של הסביבה הימית.
Introduction
ביו-אסואוקסיקולוגים מעריכים את הרעילות של כימיקלים או דגימות סביבתיות עם מודלים ביולוגיים סטנדרטיים, המשלבים את ההשפעות של לחץ פיזי, כימי וביולוגי על מערכות אקולוגיות. בשל המורכבות של מערכות אקולוגיות, הערכות סיכון אקוטוקסיקולוגיות צריכות לשקול סוללה של bioassays הכוללות אורגניזמים מ רמות שונות. מבחני רעילות על חיות מעבדה עשוי להיות יקר, זמן רב, ואתית בספק. הדחף להגביל את הבדיקות בבעלי חיים ולפתח גישות חלופיות ( למשל, על חיידקים וחיות שאינן חוליות) הוא כעת נושא מרכזי, כפי שדווח במסגרת החקיקה האירופית הנוכחית, כולל הנחיות האיחוד האירופי להגנת בעלי חיים, התיקון השביעי לחוקה האיחוד האירופי קוסמטיקה Directive, ו REACH.
סרטנים, דגים, אצות משמשים בעיקר למדידות רעילות בסביבה ימית 1 . חיידקים הם מרכיב חשובT של המערכת האקולוגית, ושינויים לקהילות חיידקים יכולות להיות השפעות משמעותיות על רכיבה ביוגיוכימית ושירותים אקולוגיים קריטיים אחרים. בדיקות רעילות המבוססות על מיקרואורגניזמים הם צובר פופולריות כי הם יחסית מהירה, לשחזור, וזול ולא להעלות אתית נושאים 2 . מטרת עבודה זו היא לתאר פרוטוקול ecotoxicological להעריך את התגובה של החיידק הימי Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) כאשר נחשף מזהמים סביבתיים.
V. anguillarum הוא גראם שלילי, קצר, עקומת מוט חיידק (0.5 x 1.5 מיקרומטר) עם דגלום הקוטב. בדרך כלל נמצא במים מליחים או מלוחים, הוא halotolerant, עם מליחות אופטימלית של כ 20 וטמפרטורה אופטימלית בין 25 ל 30 מעלות צלזיוס. היא נבחרה כמודל אורגניזם בשל נוכחותה בכל מקום ואת תפקידיה האקולוגיים החשובים בעולםא. כמה סרוטיפים של V. anguillarum ידועים לגרום ויבריוזיה במגוון של מיני דגים ימיים או מליחים 5 , 6 . לשם כך, כמה צעדים של הניסוי דורשים שיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטיות, אך לא נדרשים ציוד בטיחות או אמצעי זהירות מיוחדים. פרוטוקול בדיקת הרעילות המוצעת משתמש בתרבית הבקטריות ( כלומר, היכולת לשכפל וליצור מושבות) כנקודת הקצה ומאפשר את קביעת ה- LC 50 , הריכוז שגורם לצמצום של 50% בחיידקים שמשכפלים באופן פעיל ויוצרים מושבות, לאחר חשיפה 6 שעות. ב Vibrio , כמו חיידקים אחרים, הפחתה זו, אשר אנו בדרך כלל מצביעים על תמותה, יכול באופן חלקי להיות בשל אנשים בשלב קיימא אבל לא מתורבת (VBNC) שלב 7 . במחקר זה, השתמשנו בשיטה זו כדי למדוד את ההשפעות הרעילות של סולפט נחושת (CuSO 4)), רעיל התייחסות.
שיטה זו פותחה על מנת לספק בדיקה מתאימה המבוססת על מיקרואורגניזם לצורך הערכה אקוטוקסית של מזהמים / חומרים כימיים, כולל זיהום מזהמים כגון ננו-חומרים. החידוש של פרוטוקול זה בהשוואה לשיטות הקיימות המשמש מיקרואורגניזמים קשורה בעיקר בינוני החשיפה ואת נקודת הקצה. למעשה, החשיפה מתבצעת ב תמיסת מלח, הימנעות כל הפרעה אפשרית של המדיום הצמיחה עם זיהום מזהמים, אשר עשוי להשפיע על התגובה הביולוגית 8 . נקודת הקצה היא הפחתת התרבותיות החיידקית, אשר ניתן להשוותה בקלות לנקודות קצה חריפות אחרות המשמשות להקרנה אקוטוקסיקולוגית בסביבות ימיות / מליריות, בהתבסס על הישרדות / תמותה. יתר על כן, הפרוטוקול משתמש בטכניקה של נוזל צלחת מיקרו סעיפים, כבר בשימוש ב E. coli 9 , הפחתת כרכים ובכך effOrt (ראה שלבים 3.3 ו -3.4 לפרוטוקול לפרטים).
Protocol
1. הכנה של חומרים כימיים / חומרים
- הכן (כ 300) סטרילי 1.5 מ"ל צינורות לדילול סדרתי של המתלים חיידקים, כמו גם 15 צינורות סטרילי מ"ל כמו מכולות בדיקה שכותרתו עם ריכוזי הבדיקה.
- הכן 2% פתרון NaCl כאמצעי החשיפה לעקר אותו. לחלופין, השתמש מי ים סינתטיים או טבעיים מעוקרים, עם מליחות הנעים בין 5 ל 40.
- הכן אגר סויה tryptic (TSA) בינוני צמיחה עם NaCl 2% על פי הנחיות התווית בהתחשב בכמות NaCl כבר נוכח במדיום.
- יוצקים את TSA (מגניב אבל עדיין נוזלי) לתוך 90 מ"מ צלחות פטרי בעבר שכותרתו עם ריכוז הבדיקה זמן חשיפה, מספר לשכפל, גורם דילול; 19 מ"ל הוא נפח מתאים.
- הכן מרק סויה טריפטית (TSB) צמיחה בינוני בהתאם להוראות התווית. הוסף את הכמות המתאימה של NaCl כדי לקבל את מליחות אותו כמו המדיום חשיפה.
- הכןפתרון CuSO 4 מלאי עם מים מזוקקים פעמיים לעקר (aliquot הצורך) באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר מזרק. במקרה של דגימות סביבתיות, להכין מרווח מתאים של דילולים המדגם לעקר אותם באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר מזרק.
- הכן את פתרונות הבדיקה של צינורות 15 מ"ל מסומן בריכוז הבדיקה. ממלאים את השליטה השלילית עם 5 מ"ל של המדיום חשיפה (2% NaCl). ממלאים את צינורות אחרים עם כמות מתאימה של בינוני חשיפה CuSO 4 פתרון המניות כדי להשיג את ריכוזי הבדיקה בנפח 5 מ"ל הסופי.
2. הכנה חיידקית בקטריאלית
- 12-18 שעות לפני הבדיקה, להכין תרבות רעננה נוזלית של Vibrio anguillarum . באמצעות לולאה סטרילית, בחר מושבה אחת, מבודדת היטב מתרבות לילה על בינוני מוצק (TSA). לחסן צינור מלא 10 מ"ל של TSB ו דגירה התרבות החיידקית על 25 מעלות צלזיוס במשך 12-18 שעות. לאחר 12-18 שעות, להעריך את הריכוז החיידקי של inoculum spectrophotometrically. וורטקס inoculum ולמדוד את הצפיפות האופטית באורך גל 600 ננומטר, באמצעות TSB כמו ריק.
- כדי להשיג ריכוז חיידקי ידוע, לדלל 2 מ"ל של inoculum vortexed על ידי הוספת כמות TSB מחושב על ידי נוסחה זו:
TSB mL = [(OD / 0.14) * 2] - 2. - ודא כי הצפיפות האופטית של inoculum מדולל הוא 0.140 (± 0.005), אשר תואם את נקודת 0.5 על תקן מקפארלנד nephelometric.
- צנטריפוגה inoculum מדולל במשך 10 דקות ב 3000 גרם . לחסל את supernatant מחדש להשעות את גלולה מיקרוביאלית 1 מ"ל של פתרון NaCl 2% (בינוני חשיפה).
3. בדיקת חשיפה
- הוסף 150 μL של מחדש מושעה inoculum חיידקי לכל צינור, כולל שליטה. דגירה השעונים V. anguillarum עבור 6 שעות ב 25 ° C בחושך ב continuouS רועד כדי למנוע שקיעה.
- בהתחלה (T 0 ) ואת הקצה (T 6 ) של זמן החשיפה, לבצע ספירה חיידקית בכל המתלים חיידקי חשוף באמצעות המושבה להרכיב יחידות יחידה (CFU) שיטות.
- הכנת דילולים סדרתי של כל ההשעיה חיידקי חשוף בשלושה עותקים, החלת גורם דילול פי עשרה (עד 10 -5 ). הוסף 100 μL של כל ההשעיה חיידקי לצינור המתאים כבר מלא 900 μL של מדיום חשיפה (NaCl 2%). המשך דילול סדרתי, vortexing בכל צעד כדי להשעות מחדש את החיידקים.
- צלחת 10 μL של 10 -4 ו -10 דילולים על מנות פטרי TSA במקטע המתאים. הנח במהירות טיפות לגלוש במעגל קטן על ידי סיבוב הצלחת. דגירה צלחות על 25 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
4. ספירת CFU
- לאחר 48 שעות, לספור את המושבות גדל על צלחות פטרי; לוחות5 ו 50 מושבות הם אופטימליים לספירה מדויקת.
- חישוב מספר חיידקים קיימא לכל מ"ל של כל ההשעיה חיידקי חשוף על ידי החלת הנוסחאות הבאות:
10 -4 → CFU / mL = n ° CFU x 100 x 10,000
10 -5 → CFU / mL = n ° CFU x 100 x 100,000 - השתמש ממוצע של ספירות שהתקבלו משכפל מקביל להעריך את התמותה לעומת שליטה. חישוב התמותה כאחוז עם הנוסחה הבאה:
M% = 100 - [(N / C) * 100]
הערה: כאשר N = מספר CFU / מ"ל גדל לאחר החשיפה לרעלים; C = מספר CFU גדל במדיום הבקרה. - לחשב את LC 50 ( כלומר, ריכוז toxicant כי מקטין את מספר החיידקים לשכפל פעיל על ידי 50% לכל מ"ל, CFU / מ"ל) עם ניתוח רגרסיה לא ליניארית באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה (ראה טבלה של חומרים). הפעל ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) follהמבוצעות על ידי בדיקות פוסט-הוקיות להערכת הבדלים משמעותיים בין הטיפולים.
Representative Results
תוצאות של שלושה ניסויים עצמאיים בחשיפת V. anguillarum לארבעה ריכוזים של CuSO 4 מראים קשר ברור בין מינון לבין ירידה משמעותית של החיידקים שמשכפלים באופן פעיל ויוצרים מושבות עם ריכוז הולך וגדל של רעילות הייחוס ( איור 1 ; ANOVA, F = 20.28, p <0.001). מספר CFU / mL הוא מופחת באופן משמעותי על 1.25 מ"ג / L (פוסט הוק של מבחן Tukey, p <0.05) לעומת שליטה (CNTR). כל חיידקים מתורבתות זוהו בריכוז הגבוה ביותר שנבדק. לא נמצאו הבדלים ברעילות CuSO 4 לאורך טווח המליחות הרחב של מדיום החשיפה ( כלומר, 5, 20 או 35 גרם / L NaCl, נתונים שאינם מוצגים). פלט נציג של ניתוח סטטיסטי מראה את רגרסיה לא ליניארית הוא דיווח ב איור 1 משלים . ערכי LC 50 חושבו עבור שלושת הניסויים העצמאיים (< חזק> טבלה 1) להדגיש את הכדאיות ואת reproducibility של שיטה זו.
איור 1: Vibrio anguillarum שנחשף ל- CuSO 4. המספר הממוצע של CFU / mL (CFU = יחידת להרכיב יחידה) שנחשף לריכוז שונה של CuSO 4 עבור 6 שעות. הערכים מייצגים את הממוצע (± SD) של שלושה ניסויים עצמאיים. ההפחתה של חיידקים פעיל לשכפל ויוצרים מושבות ביחס שליטה (CNTR) מדווחים בתיבות צהוב (כאחוזים). הבדלים משמעותיים עם שליטה, המבוססים על בדיקה של הוקי פוסט, מסומנים בכוכביות (* = p <0.05; ** = p <0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
N-page = "1"> 
טבלה 1: ערכי ריכוז קטלני (LC 50 ) עבור ויבריו אנגילארום שנחשף ל- CuSO 4 . תוצאות של שלושה ניסויים עצמאיים ואמצעים (± SD) מדווחים.
איור 1: ניתוח רגרסיה לא ליניארית. פלט נציג של ניתוח רגרסיה לא ליניארית (מודל Logit-Hill) שבוצעה על תוצאות הבדיקה. לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
Discussion
עבודה זו מתארת bioassay חדש עם החיידק הימי V. anguillarum כי הוחל בהצלחה להעריך את ההשפעות הרעילות של CuSO 4 , רעיל הפניה, הוכחת קשר ברור תגובה מינון. החיידק הימי V. anguillarum נבחר כאורגניזם מודל כי הוא halotolerant, בכל מקום, וכן נציג של מערכות אקולוגיות ימיות.
הבדיקה יכולה להתבצע במגוון רחב של ערכי מליחות (5-40), והיא יכולה להשתמש בפתוח מלוחים ובמים סינתטיים או טבעיים כמו מדיום החשיפה, כל עוד מיקרואורגניזמים יכולים לשרוד בקלות למשך כל הבדיקה. זה מאפשר ניתוח של סוגים שונים של דגימות, כולל סביבות מליחים וים.
אין צורך במדיום צמיחה במהלך שלב החשיפה, תוך הימנעות מהפרעות של מזהמים 8 והשפעתה האפשרית על התגובה הביולוגית. תפרוטוקול e הוא אמין, מהיר, חסכוני, וקל יחסית. הנוהל של מיקרו-ספירת נוזלים 9 נותן את היתרון של שימוש קטן (מדגם) כרכים, אם כי זה מרמז על רמה גבוהה של דיוק וחוסן. התוצאות של שלושה ניסויים עצמאיים משכפלים עבור כל טיפול להראות את הדירות גבוהה של שיטה זו. השימוש בחיידק כמודל ביולוגי, כמו גם את ההסתגלות של הטכניקה, לטובת הרלוונטיות האקולוגית וסביבתית של הליך זה. בעיות טכניות קריטיות אחרות הן דיוק בהכנת inoculum חיידקי ואת העיקשות הנדרשת בכמה שלבים של ההליך.
המבחן המוצע הוא מהיר יותר (6 שעות) מאשר מבחנים אקוטוקסיקולוגיים ימיים אחרים (24-96 שעות) ואינו מעלה את הבעיות האתיות הנובעות משימוש באורגניזמים גבוהים יותר. יתר על כן, נתונים על התייחסות הפניה רעילים LC 50 ערכים להשוות עם אלה שהושגו עם אקוטי t Ests על מינים ימיים אחרים 10 , 11 , מפגין רגישות טובה. בין bioassays חיידקי, V. fischeri הארה מבחן עיכוב הוא הנפוץ ביותר 12 סטנדרטית. זה bioassay הוא מהיר מאוד (15-30 דקות) תקף לבדיקת דגימות שלב מוצק, אבל זה יכול להיות מושפע על ידי דגימות צבעוניים עכורים, אשר להפריע מדידות הארה. מליחות היא גורם מגביל בשימוש במבחן הנ"ל, עם 2% NaCl נדרש 13 . להיפך, המבחן המוצע כאן עם V. anguillarum נותן תוצאות סבירות על מגוון רחב של ערכי מליחות, אין מגבלות לגבי דגימות עכירות או צבעוניים, ודורש ציוד פחות יקר לעומת מנתחי הארה. השוואה בין תוצאות המחקר שלנו לבין אלה הזמינים בספרות עבור V. Fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 , משווה את EC 50 ערכים, עוד תמיכה האפקטיביות של bioassay זה.
ביו-אסאי זה מעריך את הפחתת התרבותיות החיידקית, הנקראת בדרך כלל תמותה, במקום קצב גידול האוכלוסייה או עיכוב פעילות אנזימטית, המשמשים במבחנים הקיימים כיום עבור מיקרואורגניזמים. חישוב LC 50 מאפשר השוואה עם bioassays אחרים מוחל בדרך כלל הערכה אקוטוקסיקולוגית של סביבות ימיות, אשר לעתים קרובות יש הישרדות / תמותה כנקודת הסיום. תרגיל intercalibration נחוץ בדחיפות כדי להעריך / לאשר את האמינות ואת reproducibility של מבחן זה ולתמוך סטנדרטיזציה שלה להשתמש בפרוטוקולים רגולטוריים.
השימוש הגובר של ננו ואת הפוטנציאל שלהם לשחרר את הסביבה מרמזת על הצורך הערכת סיכונים 17 . עם זאת, clasSical (אקולוגי) toxicological גישות אלה מתעוררים מתעוררים נראה לא לתת תוצאות סבירים עשויים לדרוש כמה הסתגלות 18 . המאפיינים של bioassay חדש זה מאפשר יישום קל ושימושי שלה להערכת הרעילות של חלקיקים. למעשה, האפשרות לבצע את assay ב salinities שונים ייתן חשבונות של התנהגות nanoparticle תחת חוזק יוניים שונים, משתנה פרמטר סביבתי שיכול להשפיע באופן משמעותי על רעילות 19 . יתר על כן, אין צורך להשתמש בינוני צמיחה וחומרים מזינים מומלץ במיוחד בהערכות ecotoxicity של חלקיקים כי חומרים אורגניים יכולים להקל על הקליטה שלהם על ידי הגדלת תופעות רעילות 20 או יכול לגרום צבירה, הקטנת החלק bioavailable ולכן הרעילות שלהם 21 .
לסיכום, ביואסאי על Vibrio anguillarum הוא apכלי רומנטי להערכת סיכונים של מזהמים קלאסיים ומתעוררים, וכן להערכת מצב של סביבות ימיות ומלאיות.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי פרויקט המחקר: "NanoBioTech אמביינטה e ההצדעה. Progetto 2: Ambiente. Stumenti e metodi לכל ilagagio אקולוגי", "ננו ביוטכנולוגיה: סביבה ובריאות" פרויקט 2: איכות הסביבה ושיטות אקוטוקסיקולוגיות ניטור של חלקיקים " ) שהוענקו LM מ אזור לאציו- Consorzio Hypatia. AR מומן על ידי מענק פוסט-דוקטורט מאוניברסיטת Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia במסגרת הפרויקט שצוטט לעיל. הסכם עם ISPRA-Tor Vergata University (N. 2015/52857) מותר שימוש הדדי של מתקנים חילופי חוקרים.
המחברים מודים לפרופ 'מריה כריסטינה ת'אלר, המלאכית השומרת על כל הפעילויות המיקרוביאליות, להעלאת העניין בעולם החיידקים ולסיוע רב לשיפור המחקר שלנו בנושא. המחברים מודים בהכרת תודה אנדריאה Tornambè ו EriKa Magaletti על שיתוף הפעולה היקר עם מעבדת ISPRA של אקולוגיה Phytoplankton ו ecotoxicology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
- Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information (2008).
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , Azur Environmental. 20 (1995).
- Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
