Summary
इस काम में प्रदूषण की ecotoxicity का आकलन करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जिसमें समुद्री जीवाणु विब्रियो एंगुइल्लारम का इस्तेमाल करते हुए उभरते प्रदूषकों जैसे नैनोमिटेरियल्स शामिल हैं यह विधि एलसी 50 , या मृत्यु दर के निर्धारण के लिए अनुमति देता है, जो 6 घंटे के प्रदर्शन के बाद बैक्टीरिया सांस्कृतिकता में 50% कमी का कारण बनता है।
Abstract
बैक्टीरिया पारिस्थितिकी तंत्र का एक महत्वपूर्ण घटक है, और माइक्रोबियल समुदाय के परिवर्तनों को बायोगेकेमिकल साइक्लिंग और खाद्य जाले पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। सूक्ष्मजीवों पर आधारित विषाक्तता परीक्षण का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि वे अपेक्षाकृत शीघ्र, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सस्ते होते हैं और नैतिक मुद्दों से जुड़े नहीं होते हैं। यहां, हम समुद्री जीवाणु विब्रियो एंगुइल्लारम की जैविक प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एक इकोटोक्सिकोलॉजिकल विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि रासायनिक संयुग्मों की तीव्र विषाक्तता का मूल्यांकन करती है, जिसमें नैनोकैण्ट जैसे नए संदूषक शामिल हैं, साथ ही पर्यावरण के नमूने भी हैं। विषाक्त पदार्थों के संपर्क के कारण अंत बिंदु बैक्टीरिया की सांस्कृतिकता ( यानी, दोहरीकरण और कालोनियों को बनाने की क्षमता) में कमी है। इस कमी को आम तौर पर मृत्यु दर के रूप में संदर्भित किया जा सकता है परीक्षण एलसी 50 के निर्धारण के लिए अनुमति देता है, एकाग्रता जिसके कारण बैक्टीरिया की 50% कमी से सक्रिय रूप से प्रतिकृति और कालोनियों का गठन होता हैएक 6 एच एक्सपोजर सांस्कृतिक बैक्टीरिया को कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) के रूप में गिना जाता है, और "मृत्यु" का मूल्यांकन किया जाता है और नियंत्रण की तुलना में। इस काम में, कॉपर सल्फेट (कूसो 4 ) की विषाक्तता का मूल्यांकन किया गया था। तीन स्वतंत्र परीक्षणों के बाद 1.13 मिलीग्राम / एल के एक औसत एलसी 50 के साथ स्पष्ट खुराक-प्रतिक्रिया संबंध देखा गया। सूक्ष्मजीवों के साथ मौजूदा तरीकों की तुलना में यह प्रोटोकॉल, लवणता के व्यापक रेंज में लागू होता है और इसमें रंग / टरबाइड नमूनों की कोई सीमा नहीं होती है। यह जोखिम के माध्यम के रूप में खारा समाधान का उपयोग करता है, जांच किए गए दूषित पदार्थों के साथ विकास माध्यम के किसी भी संभावित अंतर से बचने। एलसी 50 गणना समुद्री बायोसास के साथ तुलना करती है जो सामान्यतः समुद्री पर्यावरण के इकोटोक्सिकोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए लागू होती है।
Introduction
पारिस्थितिक तंत्रों पर शारीरिक, रासायनिक और जैविक तनाव के प्रभावों को एकीकृत करने, इकोटॉक्सिकोलॉजिकल बायोसास, मानक जैविक मॉडल के साथ रसायनों या पर्यावरणीय नमूनों की विषाक्तता का मूल्यांकन करते हैं। पारिस्थितिक तंत्र की जटिलता के कारण, इकोटॉक्सिकोलॉजिकल जोखिम आकलन में बायोसास की बैटरी पर विचार करना चाहिए, जिसमें विभिन्न ट्राफिक स्तरों से जीव शामिल हैं। प्रयोगशाला के जानवरों पर विषाक्तता का एहसास महंगा हो सकता है, समय लगता है, और नैतिक रूप से संदिग्ध। जानवरों के परीक्षण को सीमित करने और वैकल्पिक दृष्टिकोण विकसित करने का अभियान ( जैसे, बैक्टीरिया और गैर-कशेरुक जानवरों पर) अब एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, जैसा कि यूरोपीय संघ के पशु संरक्षण निर्देशक, वर्तमान में यूरोपीय कानून के ढांचे में बताया गया है, 7 वीं संशोधन यूरोपीय संघ प्रसाधन सामग्री निर्देशक, और पहुंच
क्रस्टेशियंस, मछली और शैवाल का उपयोग समुद्री पर्यावरण 1 में विषाक्तता माप के लिए किया जाता है। बैक्टीरिया एक महत्वपूर्ण componen हैंटी, पारिस्थितिकी तंत्र का, और माइक्रोबियल समुदायों के परिवर्तनों को जैव-रासायनिक साइक्लिंग और अन्य महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी तंत्र सेवाओं पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। सूक्ष्मजीवों पर आधारित विषाक्तता का परीक्षण लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है क्योंकि वे अपेक्षाकृत जल्दी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और सस्ते हैं और नैतिक मुद्दों को दो नहीं बढ़ाते हैं। इस काम का उद्देश्य पर्यावरणीय संदूषकों के संपर्क में होने पर समुद्री जीवाणु विब्रियो एंजुइल्लारम ( लिलेसेनला एंजुइलरम, व्हाइब्रोनैसीए) की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए इकोटोक्सिकोलॉजिकल प्रोटोकॉल का वर्णन करना है।
वी। एंजुइलरम एक ग्राम- नकारात्मक , लघु, वक्र-आकार वाली रॉड जीवाणु (0.5 x 1.5 माइक्रोग्राम) है, जिसमें ध्रुवीय ध्वजवाही है। आमतौर पर खारा या नमक पानी में पाया जाता है, यह हेलोटोलरेंट होता है, जिसके बारे में 20 का एक उपयुक्त लवणता और 25 और 30 डिग्री सेल्सियस 3 के बीच एक इष्टतम तापमान होता है। ओस में इसकी सर्वव्यापी और इसकी महत्वपूर्ण पारिस्थितिक भूमिकाओं के कारण यह एक जीव मॉडल के रूप में चुना गया हैAns दुनिया भर में 4 वी। एंजुइलरम के कुछ सीरोटाइप प्रजातियों के समुद्री या खारे मछली की प्रजातियों में vibriosis पैदा करने के लिए जाना जाता है 5 , 6 । इसके लिए, प्रयोग के कुछ चरणों में मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानात्मक प्रथाओं की आवश्यकता होती है, लेकिन कोई विशेष सुरक्षा उपकरण या सावधानी बरतने की ज़रूरत नहीं है। प्रस्तावित विषाक्तता परीक्षण प्रोटोकॉल जीवाणु सांस्कृतिकता का उपयोग करता है ( यानी, कोपोनियों को दोहराने की क्षमता और फार्म का समापन बिंदु) और एलसी 50 के निर्धारण के लिए अनुमति देता है, यह एकाग्रता जिसके कारण बैक्टीरिया की 50% की कमी सक्रिय रूप से प्रतिकृति और कालोनियों का गठन होता है एक 6-एच एक्सपोजर विब्रियो में , अन्य रोगाणुओं के रूप में, यह कमी, जिसे हम सामान्यतः मृत्यु दर के रूप में दर्शाते हैं, संभवतः व्यवहार्य लेकिन गैर-सांस्कृतिक (वीबीएनसी) चरण 7 में व्यक्तियों के कारण आंशिक रूप से हो सकते हैं। इस अध्ययन में, हमने कॉपर सल्फेट के विषाक्त प्रभावों को मापने के लिए इस विधि को लागू किया है (कूसो 4), एक संदर्भ विषैला
प्रदूषण / रासायनिक यौगिकों के इकोोटॉक्सिक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त, सूक्ष्मजीव-आधारित परीक्षण प्रदान करने के लिए इस पद्धति का विकास किया गया था, जैसे कि नैनोमिटेरियल्स जैसे उभरते प्रदूषक। सूक्ष्मजीवों के लिए इस्तेमाल की जाने वाली मौजूदा विधियों की तुलना में इस प्रोटोकॉल की नवीनता मुख्य रूप से एक्सपोजर मिडियम और समापन बिंदु से जुड़ी हुई है। वास्तव में, खारा समाधान में किया जाता है, जांच किए गए दूषित पदार्थों के साथ विकास माध्यम के किसी भी संभावित हस्तक्षेप से बचने, जो जैविक प्रतिक्रिया 8 को प्रभावित कर सकता है। समापन बिंदु बैक्टीरिया की सांस्कृतिकता में कमी है, जिसे आसानी से अन्य तीव्र अंतपिताओं के साथ तुलना में किया जा सकता है जो जीवित रहने / मृत्यु दर पर आधारित समुद्री / खारा वातावरण में इकोटॉक्सिकोलॉजिकल स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल तरल-टू-प्लेट सूक्ष्म-गणना की तकनीक का उपयोग करता है, जो पहले से ही ई। कोलाई 9 पर प्रयोग किया जाता है, मात्रा को कम करने और इस प्रकार प्रयोगात्मक effOrt (विवरण के लिए प्रोटोकॉल 3.3 और 3.4 देखें)।
Protocol
1. अभिकर्मकों / सामग्री की तैयारी
- बैक्टीरियल निलंबन के सीरियल कमजोर पड़ने के लिए बायरिल 1.5 एमएल ट्यूबों के साथ-साथ 15 एमएल बाँझ ट्यूबों को टेस्ट कंटेनर के रूप में तैयार करें, जो कि परीक्षण सांद्रता के साथ लेबल किए जाते हैं।
- जोखिम के माध्यम के रूप में 2% NaCl समाधान तैयार करें और इसे बाँझें। वैकल्पिक रूप से, सं कृत्रिम या प्राकृतिक समुद्री जल का उपयोग करें, जिसमें लवणता 5 से 40 तक होती है।
- लेबल निर्देशों के अनुसार ट्रिपेटिक सोया अगर (टीएसए) की वृद्धि माध्यम 2% NaCl के साथ तैयार करें और पहले से ही माध्यम में उपस्थित NaCl की मात्रा पर विचार करें।
- पहले से टेस्ट एकाग्रता और एक्सपोज़र समय, दोहराने संख्या, और कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ लेबल किए गए 90 मिमी पेट्री डिश में टीएसए (शांत लेकिन अभी भी तरल) डालें; 1 9 एमएल एक उपयुक्त मात्रा है।
- लेबल दिशाओं के अनुसार ट्रिपेटिक सोया शोरबा (टीएसबी) की विकास माध्यम तैयार करें। एक्सपोजर मीडिया के रूप में समान लवणता प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा में NaCl जोड़ें।
- तैयार करनाएक कूसो 4 स्टॉक दोहरे आसुत जल के साथ समाधान और एक 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर (आवश्यक) विभाज्य बाँझ। पर्यावरण के नमूनों के मामले में, नमूने के dilutions का एक उपयुक्त अंतराल तैयार करें और 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके उन्हें बाँझें।
- परीक्षण सांद्रता के साथ लेबल किए गए 15 एमएल ट्यूबों में परीक्षण समाधान तैयार करें। जोखिम के माध्यम के 5 एमएल (2% NaCl) के साथ नकारात्मक नियंत्रण भरें। 5 एमएल अंतिम मात्रा में परीक्षण सांद्रता प्राप्त करने के लिए अन्य ट्यूबों को एक्सपोज़र मध्यम और कूसो 4 स्टॉक समाधान से उचित मात्रा में भरें।
2. बैक्टीरियल इनोकुल्कम तैयारी
- परीक्षण से 12-18 घंटे पहले, विब्रियो एंजुइलारम की एक तरल ताजा संस्कृति तैयार करें। एक बाँझ लूप का प्रयोग करके, एक ठोस माध्यम (टीएसए) पर एक रात भर की संस्कृति से एक एकल, अच्छी तरह से पृथक कॉलोनी का चयन करें। टीएसबी के 10 एमएल से भरी हुई एक ट्यूब टीका डालें और बैक्टीरियल संस्कृति से 12-18 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेवन करें। 12-18 घंटे के बाद, इनोक्यूलम स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से बैक्टीरिया का एकाग्रता का अनुमान लगाया गया है। भंवर में inoculum और 600 एनएम तरंग दैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व उपाय, टीएसबी का उपयोग रिक्त के रूप में
- एक ज्ञात बैक्टीरियल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, इस फार्मूले द्वारा गणना की गई टीएसबी की मात्रा को जोड़कर भंवरयुक्त इनोकुल्म के 2 एमएल को पतला करता है:
टीएसबी एमएल = [(ओडी / 0.14) * 2] - 2 - सत्यापित करें कि पतला इनोकुल्कम का ऑप्टिकल घनत्व 0.140 (± 0.005) है, जो मैकफारलैंड नेपेलमेट्रिक मानक पर 0.5 अंक से मेल खाती है।
- 3,000 ग्राम में 10 मिनट के लिए पतला इनोकुल्कम अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 2% NaCl समाधान (एक्सपोज़र मध्यम) के 1 एमएल में माइक्रोबियल गोली पुनः निलंबित करें।
3. परीक्षण एक्सपोजर
- नियंत्रण सहित, प्रत्येक ट्यूब के लिए 150 μL फिर से निलंबित बैक्टीरियल inoculum जोड़ें। अंधेरे में और लगातार में 25 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए वी। एंजुइलारम निलंबन सेते हैंअवसादन से बचने के लिए मिलाते हुए
- एक्सपोज़र समय की शुरुआत (टी 0 ) और अंत (टी 6 ) में, कॉलोनी फॉर्मिंग यूनिट (सीएफयू) गिनती विधियों का उपयोग करते हुए सभी खुले बैक्टीरियल निलंबन में बैक्टीरिया की गणना करना।
- प्रति दस गुना कमजोर पड़ने वाले कारक (10 से -5 ) तक आवेदन करते हुए, प्रत्येक प्रति बैक्टीरिया निलंबन के सीरियल बेलनेस तैयार करें। पहले से ही एक्सपोज़र माध्यम के 900 μL (2% NaCl) से भरा हुआ इसी ट्यूब में प्रत्येक बैक्टीरिया निलंबन के 100 μL जोड़ें। सीरियल कमजोर पड़ने के साथ आगे बढ़ें, बैक्टीरिया को दोबारा स्थगित करने के लिए प्रत्येक चरण पर भंवर।
- संबंधित सेगमेंट में टीएसए पेट्री डिश पर 10 -4 और 10 -5 डायल्यूशंस के प्लेट 10 μL प्लेट को घूर्णन करके एक छोटी सी सर्कल में बूंदों को चक्कर आना चाहिए। 48 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
4. CFU गिनती
- 48 घंटे के बाद, पेट्री डिश पर उगने वाले कालोनियों की गणना करें; प्लेटों को आश्रय करना बीसटीक गणना के लिए 5 और 50 कॉलोनियों में इष्टतम हैं
- निम्न फ़ार्मुलों को लागू करके प्रत्येक खुला बैक्टीरिया निलंबन के प्रति एमएल के व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या की गणना करें:
10 -4 → सीएफयू / एमएल = एन ° CFU x 100 x 10,000
10 -5 → सीएफयू / एमएल = एन ° सीएफयू एक्स 100 एक्स 100, 000 - नियंत्रण के मुकाबले मृत्यु दर का मूल्यांकन करने के लिए समानांतर प्रतिकृतियों में प्राप्त की जाने वाली गणना के औसत का उपयोग करें। निम्न सूत्र के साथ एक प्रतिशत के रूप में मृत्यु दर की गणना करें:
एम% = 100 - [(एन / सी) * 100]
नोट: जहां एन = विषाक्त के जोखिम के बाद बढ़े हुए सीएफयू / एमएल की संख्या; सी = सीएफयू की संख्या नियंत्रण माध्यम में उगाई गई। - एलसी 50 की गणना ( अर्थात्, विषाक्त पदार्थों की एकाग्रता जो एक उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर (सामग्रियों की तालिका देखें) के उपयोग से गैर-रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण के साथ 50% प्रति एमएल द्वारा सीपीयू / एमएल सक्रिय रूप से प्रतिकृति बैक्टीरिया को कम करता है। विचरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण चलाएं (एएनओवीए) follउपचार के बीच महत्वपूर्ण अंतरों का मूल्यांकन करने के लिए पोस्ट-हॉक जोड़ीदार टी- टेस्ट द्वारा बकाया
Representative Results
क्यूसओ 4 के चार घनत्व के लिए वी। एंजुल्लारम को उजागर करने के तीन स्वतंत्र परीक्षणों के परिणाम, एक स्पष्ट खुराक-प्रतिक्रिया संबंध दिखाते हैं और बैक्टीरिया की एक महत्वपूर्ण कमी को सक्रिय रूप से संदर्भित करता है और संदर्भों के विषाक्त पदार्थों की बढ़ती एकाग्रता ( चित्रा 1 ; एनोवा, एफ = 20.28, पी <0.001)। सीएफयू / एमएल की संख्या नियंत्रण (सीएएनटीआर) के मुकाबले 1.25 मिलीग्राम / एल (पोस्ट-हॉक ट्यूके के परीक्षण, पी <0.05) में काफी कम हो गई है। किसी भी सांस्कृतिक बैक्टीरिया को उच्चतम एकाग्रता पर परीक्षण किया गया। क्यूसओ 4 विषाक्तता में कोई मतभेद एक्सपोज़र माध्यम की व्यापक लवणता सीमा ( यानी, 5, 20, या 35 ग्राम / एल NaCl, डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ पाए गए। गैर-रेखीय प्रतिगमन को दर्शाते हुए सांख्यिकीय विश्लेषण का एक प्रतिनिधि आउटपुट, पूरक चित्रा 1 में रिपोर्ट किया गया है। एलसी 50 मूल्यों को तीन स्वतंत्र परीक्षणों (<मजबूत> तालिका 1) इस विधि की व्यवहार्यता और पुनरुत्पादन पर प्रकाश डालें।
चित्रा 1: क्यूओएसओ के सामने विब्रियो एंज्युल्लारम 4. सीएफयू / एमएल (सीएफयू = कॉलोनी फॉर्मिंग यूनिट) की औसत संख्या 6 घ के लिए कूसो 4 की अलग-अलग एकाग्रता के संपर्क में है। मान तीन स्वतंत्र परीक्षणों का मतलब (± एसडी) दर्शाते हैं। नियंत्रण के संबंध में सक्रिय रूप से प्रतिकृति और बनावट वाले बैक्टीरिया की कटौती (सीएनटीआर) पीले बक्से (प्रतिशत के रूप में) में दर्ज की जाती है। तदनुसार तके के परीक्षण के आधार पर नियंत्रण के साथ महत्वपूर्ण अंतर, तारांकन (* = p <0.05; ** = p <0.01) के साथ दर्शाए गए हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
तालिका 1: क्यूएसओ 4 के संपर्क में विब्रियो एंगुइल्लारम के लिए घातक एकाग्रता (एलसी 50 ) मूल्य तीन स्वतंत्र परीक्षण और साधन (± एसडी) के परिणाम सूचित किए जाते हैं।
पूरक चित्रा 1: गैर-रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण। परीक्षण के परिणामों पर निष्पादित गैर-रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण (लेटिट-हिल मॉडल) के प्रतिनिधि आउटपुट कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
यह काम समुद्री जीवाणु वी। एन्गुइलरम के साथ एक नया जैवसैस का वर्णन करता है जो कूसो 4 के विषाक्त प्रभावों का आकलन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था, एक संदर्भ विषाक्त, एक स्पष्ट खुराक प्रतिक्रिया संबंध का प्रदर्शन। समुद्री जीवाणु वी। एंजुइलरम को एक मॉडल जीव के रूप में चुना गया था क्योंकि यह हेलोटोलरेंट, सर्वव्यापी और समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों के प्रतिनिधि है।
यह परीक्षण लवणता मूल्यों (5-40) की एक विस्तृत श्रृंखला पर किया जा सकता है और जोखिम समाधान और सिंथेटिक या प्राकृतिक समुद्री जल को एक्सपोज़र मिडिया के रूप में इस्तेमाल कर सकते हैं, जब तक सूक्ष्मजीव पूरे परीक्षण की अवधि के लिए आसानी से जीवित रह सकते हैं। यह खारा और समुद्री वातावरण सहित विभिन्न नमूनों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।
एक्सपोज़र चरण के दौरान कोई विकास माध्यम की आवश्यकता नहीं है, इसके द्वारा प्रदूषक 8 के साथ इसकी हस्तक्षेप से बचने और जैविक प्रतिक्रिया पर इसका संभावित प्रभाव नहीं है। गुई प्रोटोकॉल विश्वसनीय, तेजी से, लागत प्रभावी है, और अपेक्षाकृत आसान है। तरल-टू-प्लेट सूक्ष्म-गणना 9 की प्रक्रिया छोटे (नमूना) संस्करणों का उपयोग करने का लाभ देती है, यद्यपि यह सटीकता और मजबूती की उच्च डिग्री दर्शाती है तीन स्वतंत्र परीक्षणों के परिणाम और प्रत्येक उपचार के लिए प्रतिकृति इस पद्धति की उच्च दोहराव दिखाते हैं। एक जैविक मॉडल के रूप में जीवाणु के उपयोग के साथ-साथ तकनीक की अनुकूलन क्षमता भी इस प्रक्रिया के पारिस्थितिक और पर्यावरणीय प्रासंगिकता के पक्ष में है। अन्य महत्वपूर्ण तकनीकी मुद्दे बैक्टीरिया के इनोकुल्म की तैयारी में सटीकता और प्रक्रिया के कुछ चरणों में जरूरी बाँझपन हैं।
प्रस्तावित परीक्षण अन्य समुद्री पारिस्थितिकीय एनालिस (24-9 6 एच) की तुलना में अधिक तेज़ (6 घंटे) है और उच्च जीवों के उपयोग से आने वाली नैतिक समस्याओं को नहीं बढ़ाता है। इसके अलावा, विषाक्त पदार्थों के डेटा को एसी टी से प्राप्त लोगों के साथ एलसी 50 मूल्यों की तुलना में दिखाया गया है अन्य समुद्री प्रजातियों 10 , 11 , पर एक अच्छी संवेदनशीलता का प्रदर्शन। बैक्टीरियल बायोसास के बीच, वी। फिशरी लुमिनेसेंस डिसिबिशन टेस्ट सबसे सामान्य और अच्छी तरह से मानकीकृत 12 है । यह जैवसाइड बहुत तेजी से (15-30 मिनट) है और ठोस चरण के नमूनों के परीक्षण के लिए मान्य है, लेकिन यह रंगीन और टर्बिड नमूनों से प्रभावित हो सकता है, जो लुमिनेसिसेंस मापन में हस्तक्षेप करते हैं। लवणता उपर्युक्त परीक्षा के उपयोग में एक सीमित कारक है, जिसमें 2% NaCl की आवश्यकता 13 है इसके विपरीत, वी। एंजुइलरम के साथ प्रस्तावित परीक्षण में लवणता मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में सस्ती परिणाम मिलते हैं, टरबाइड या रंग के नमूनों के संबंध में कोई सीमा नहीं है, और लुमिनेसिसेंस इंस्ट्रुअर्स की तुलना में कम महंगे उपकरण की आवश्यकता होती है। हमारे अध्ययन और वी। फिशर 14 के लिए साहित्य में उपलब्ध के परिणामों के बीच एक तुलना ,Ss = "xref"> 15 , 16 तुलनीय ईसी 50 मूल्यों को दिखाता है, इस बायोसाय की प्रभावशीलता का समर्थन करता है।
यह बायोसाए बैक्टीरिया की सांस्कृतिकता की कमी का आकलन करता है, जिसे आम तौर पर जनसंख्या वृद्धि दर या एंजाइमेटिक गतिविधि अवरोध के बजाय मृत्यु दर के रूप में संदर्भित किया जाता है, जो वर्तमान में सूक्ष्मजीवों के लिए उपलब्ध परीक्षणों में उपयोग किया जाता है। एलसी 50 गणना अन्य जैवसैप्स के साथ तुलना करने की अनुमति देती है जो आम तौर पर समुद्री वातावरणों के इकोटॉक्सिकोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए लागू होती है, जो अक्सर अस्तित्व / मृत्यु दर को समापन बिंदु के रूप में दर्शाती है। इस परीक्षण की विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन का मूल्यांकन / पुष्टि करने और उसके मानकीकरण और विनियामक प्रोटोकॉल में इसका उपयोग करने के लिए एक अन्तरालीकरण कार्य आवश्यक है।
नैनोमिटेरियल्स का बढ़ता उपयोग और पर्यावरण में उनकी संभावित रिहाई जोखिम मूल्यांकन 17 की आवश्यकता का मतलब है हालांकि, clasइन उभरते प्रदूषकों के लिए सैनिक (इको) के विषाक्तता संबंधी दृष्टिकोण सस्ती परिणाम नहीं देते हैं और कुछ अनुकूलन 18 की आवश्यकता हो सकती है। नैनोकणों की विषाक्तता के आकलन के लिए इस नए जैवसैपास की विशेषताओं के अपने आसान और उपयोगी अनुप्रयोग की अनुमति है। वास्तव में, विभिन्न नम्रता पर परख करने की संभावना विभिन्न आयनिक शक्तियों के तहत नैनोपैतिक व्यवहार के खातों को प्रदान करेगी, पर्यावरण पैरामीटर चर जो कि विषाक्तता को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, विकास माध्यम और पोषक तत्वों का कोई भी उपयोग नैनोकणों के ecotoxicity मूल्यांकन में विशेष रूप से सिफारिश नहीं किया जाता है क्योंकि जैविक पदार्थों को विषैले प्रभावों को बढ़ाकर उनके अवशोषण की सुविधा मिल सकती है 20 या एकत्रीकरण पैदा कर सकता है, जैव-अनुपलब्ध अंश को कम कर सकता है और इसलिए उनकी विषाक्तता 21 ।
अंत में, विब्रियो एंगुइल्लारम पर बायोसाय एपी हैशास्त्रीय और उभरती हुई प्रदूषकों के जोखिम मूल्यांकन के लिए, साथ ही साथ समुद्री और खारा वातावरण की स्थिति के आकलन के लिए उपकरण को रोमिंग करना।
Disclosures
लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है
Acknowledgments
यह काम अनुसंधान परियोजना द्वारा वित्त पोषित किया गया था: "नैनोबियोटेक परिवेश और सलामी। प्रोजेक्ट 2: एम्बिएंट। मॉनिटागजिओ इकोोटोसियोलॉजिको डेले नैनोपैर्टिकेल" ( "नैनो-बायोटेक्नोलोजी: पर्यावरण और स्वास्थ्य। परियोजना 2: पर्यावरण। ईकोटॉक्सिकोलॉजिकल के लिए उपकरण और तरीके नैनोकणों की निगरानी " ) एलएएम को क्षेत्रीय लेज़ियो-कन्सरिजियो हाइपैया से दी गई एआर को पहले उद्धृत परियोजना के ढांचे के तहत टोर वर्गाटा / क्षेत्रीय लेज़ियो-कन्सरिजियो हाइपियास विश्वविद्यालय से पोस्टडॉक्टरल अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। ISPRA-Tor Vergata University (N. 2015/52857) के साथ एक समझौते ने सुविधाओं के परस्पर उपयोग और शोधकर्ताओं के आदान-प्रदान की अनुमति दी।
लेखक माइक्रोबियल दुनिया में दिलचस्पी बढ़ाने और इस मुद्दे पर हमारे शोध को बेहतर बनाने में मदद करने के लिए, सभी माइक्रोबियल गतिविधियों के लिए हमारे संरक्षक दूत प्रो। मारिया क्रिस्टीना थल्लर के लिए ऋणी हैं। लेखकों ने आंद्रेया टोर्नंबे और एरी को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार कियाका मैग्लेट्टी फाइटोपैंकटन पारिस्थितिकी और इकोटोक्सिकोलॉजी के आईएसपीआरए लैब के साथ कीमती सहयोग के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
- Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information (2008).
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , Azur Environmental. 20 (1995).
- Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
