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해양 박테리아와 생태 독성 학적 방법 Published: May 26, 2017 doi: 10.3791/55211
Automatic Translation
1,2, 1,3, 2, 1, 1, 2
1Institute for Environmental Protection and Research (ISPRA), Rome (Italy), 2Department of Biology, Tor Vergata University, Rome (Italy), 3Department of Biology and Evolution of Marine Organisms, Stazione Zoologica, Anton Dohrn, Naples (Italy)

Summary

이 연구는 해양 박테리아 인 Vibrio anguillarum을 사용하여 나노 물질과 같은 새로운 오염 물질을 포함하여 오염 물질의 생태 독성을 평가하는 새로운 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 6 시간 노출 후에 박테리아 배양 가능성을 50 % 감소시키는 농도 인 LC 50 또는 사망률을 결정합니다.

Abstract

박테리아는 생태계의 중요한 구성 요소이며, 미생물 군집 변화는 생 지질 화학 순환 및 푸드 웹에 중요한 영향을 줄 수 있습니다. 미생물에 근거한 독성 시험은 비교적 빠르고 재현성 있고 저렴하며 윤리적 문제와 관련이 없기 때문에 널리 사용됩니다. 여기에서는 해양 세균 Vibrio anguillarum 의 생물학적 반응을 평가하는 생태 독성 학적 방법에 대해 설명합니다 . 이 방법은 환경 시료뿐만 아니라 나노 입자와 같은 새로운 오염 물질을 포함한 화학 물질의 급성 독성을 평가합니다. 종말점은 독성 물질에 노출되어 박테리아 배양 가능성 ( 즉, 복제 및 형성 능력)이 감소한 것입니다. 이러한 감소는 일반적으로 사망률이라고 할 수 있습니다. 이 시험을 통해 LC 50을 결정할 수 있습니다. 농도는 50 %의 박테리아가 활발히 복제되고 콜로니를 형성하게하는 농도입니다.6 시간 노출. 배양 가능한 박테리아를 식민지 형성 단위 (CFU)로 계산하고 "사망률"을 평가하고 대조군과 비교합니다. 이 연구에서는 구리 황산염 (CuSO 4 )의 독성을 평가했다. 명확한 용량 - 반응 관계가 관찰되었으며, 3 회의 독립적 인 시험 후에 평균 LC 50 은 1.13 mg / L였다. 이 프로토콜은 미생물과 기존의 방법에 비해, 광범위한 염분 범위에 적용 할 수 있으며 색깔 / 혼탁 샘플에 대한 제한이 없습니다. 그것은 노출 매체로 생리 식염수를 사용하여 조사 된 오염물과 함께 성장 매체의 가능한 간섭을 피합니다. LC 50 계산은 해양 환경의 생태 독성 평가에 일반적으로 적용되는 다른 생물 검정과의 비교를 용이하게합니다.

Introduction

생태 독성 시험은 생태계에 미치는 물리적, 화학적, 생물학적 스트레스 요인의 영향을 통합하여 표준 생물학적 모델로 화학 물질 또는 환경 시료의 독성을 평가합니다. 생태계의 복잡성으로 인해 생태 독성 위험 평가는 다른 영양 수준의 유기체를 포함하는 일련의 생물 검정을 고려해야합니다. 실험실 동물에 대한 독성 시험은 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리고 윤리적으로 문제가 될 수 있습니다. 동물 실험을 제한하고 대안적인 접근 방법 ( 예 : 박테리아 및 비 척추 동물)을 개발하려는 노력은 현재 EU 동물 보호 지침 (European Animal Protection Directive)을 포함한 현재의 유럽 법률의 틀에서보고 된 바와 같이 중추적 인 문제입니다. EU 화장품 지침 및 REACH를 준수합니다.

갑각류, 물고기 및 조류는 해양 환경에서 독성 측정에 주로 사용됩니다 1 . 박테리아는 중요한 성분입니다.생태계의 변화, 미생물 군집의 변화는 생물 지 화학 사이클과 기타 중요한 생태계 서비스에 중대한 영향을 줄 수있다. 미생물에 근거한 독성 시험은 상대적으로 빠르고, 재현성 있고 저렴하며 윤리적 문제를 제기하지 않기 때문에 인기를 얻고 있습니다 2 . 이 연구의 목적은 환경 오염 물질에 노출되었을 때 해양 박테리아 Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae)의 반응을 평가하기위한 생태 독성 프로토콜을 기술하는 데있다.

V. anguillarum 은 그람 음성, 짧은 곡선 형 막대 박테리아 (0.5 x 1.5 μm)로 극모를 가지고 있습니다. 일반적으로 염수 또는 염수에서 발견되는이 약은 최적 염분도가 약 20이고 최적 온도가 25 ~ 30 ° C 인 황 내성이다. 그것의 편재와 그 중요한 생태 학적 역할로 인해 유기체 모델로 선택되었습니다전 세계적으로 4 . V. anguillarum의 일부 혈청 형 은 다양한 해양 또는 소금기있는 어종 5,6에서 vibriosis를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 이를 위해 실험의 일부 단계에는 표준 미생물 학적 관행이 필요하지만 특별한 안전 장비 나 예방 조치가 필요하지 않습니다. 제안 된 독성 시험 프로토콜은 박테리아 배양 ( 즉, 복제 능력과 콜로니 형성 능력)을 종점으로 사용하고 LC 50을 결정할 수 있습니다. LC 50 은 박테리아의 50 % 감소를 일으키는 농도입니다. 6 시간 노출. Vibrio 에서와 마찬가지로 다른 미생물과 마찬가지로 우리가 일반적으로 사망으로 표시 한이 감소는 부분적으로 생존 가능하지만 VBNC (non-culturable) 단계의 개체 때문일 수 있습니다 7 . 본 연구에서는 구리 황산염 (CuSO 4) 의 독성 영향을 측정하기 위해이 방법을 적용했다.), 참조 독성 물질.

이 방법은 나노 물질과 같은 오염 물질을 비롯한 오염 물질 / 화학 물질의 생태 독성 평가에 적합한 미생물 기반 시험을 제공하기 위해 개발되었습니다. 미생물에 사용되는 기존 방법과 비교하여이 프로토콜의 신규성은 주로 노출 매체 및 종점과 관련이있다. 실제로, 노출은 생물 반응에 영향을 미칠 수있는 조사 된 오염 물질로 성장 매체가 간섭하지 않도록 식염수에서 수행됩니다 8 . 종말점은 생존 / 사망률에 근거한 해양 / 소금기있는 환경에서 생태 독성 스크리닝에 사용되는 다른 급성 종말점과 쉽게 비교 될 수있는 세균 배양 가능성 감소입니다. 또한이 프로토콜은 이미 대장균 9 에서 사용 된 액체 대 플레이트 마이크로 카운트 기술을 사용하여 용적을 줄이고 실험적 eff를 감소시킵니다ort (자세한 내용은 프로토콜의 3.3 및 3.4 단계 참조).

Protocol

1. 시약 / 재료의 준비

  1. 세균 현탁액의 순차 희석을위한 (약 300) 멸균 1.5 ML 튜브뿐만 아니라 시험 농도로 분류 테스트 용기로 15 ML 멸균 튜브를 준비합니다.
  2. 노출 매체로 2 % NaCl 용액을 준비하고 멸균한다. 또는 염분이 5에서 40 사이 인 멸균 된 합성 또는 천연 해수를 사용하십시오.
  3. 레이블 방향에 따라 2 % NaCl로 트립신 간장 한천 (TSA) 성장 매체를 준비하고 매체에 이미 존재하는 NaCl의 양을 고려하십시오.
  4. 이전에 시험 농도와 노출 시간, 복제 번호 및 희석 인자로 라벨이 붙은 90-mm 페트리 접시에 TSA (차갑지 만 액체)를 붓습니다. 19 mL가 적당합니다.
  5. 레이블 방향에 따라 tryptic soy broth (TSB) 성장 배지를 준비하십시오. 노출 매체와 동일한 염분을 얻기 위해 적절한 양의 NaCl을 첨가하십시오.
  6. 준비하다이중 증류수로 CuSO 4 저장 용액을 만들고 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 (필요한) 분취 량을 멸균하십시오. 환경 시료의 경우 적절한 희석 간격을 마련하고 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 시료를 멸균하십시오.
  7. 시험 농도로 표시된 15 mL 튜브에서 시험 용액을 준비한다. 네거티브 컨트롤을 5 mL의 노출 매질 (2 % NaCl)으로 채 웁니다. 다른 튜브에 적정량의 노출 매체와 CuSO 4 저장 용액을 채워 5 mL 최종 부피의 시험 농도를 얻으십시오.

2. 박테리아 접종 물 준비

  1. 시험 전 12-18 시간에 Vibrio anguillarum 의 액체 신선한 배양 물을 준비 하십시오 . 멸균 루프를 사용하여 고체 배지 (TSA)에서 밤새 문화에서 잘 격리 단일 식민지를 선택합니다. TSB 10 ML로 가득 튜브를 접종하고 12-18 H 위해 25 ° C에서 박테리아 문화를 품어. 12-18 시간 후, 접종 물의 박테리아 농도를 분광 광도계로 측정하십시오. TSB를 공시 료로 사용하여 600 nm 파장에서 광학 밀도를 측정합니다.
  2. 알려진 세균 농도를 얻으려면 다음 공식으로 계산 된 TSB의 양을 더하여 vortexed 접종 물 2 mL를 희석하십시오 :
    TSB mL = [(OD / 0.14) * 2] - 2.
  3. 희석 된 접종 물의 광학 밀도가 0.140 (± 0.005)인지 확인하십시오. 이는 McFarland 비 탁 표준의 0.5 포인트에 해당합니다.
  4. 희석 접종 물을 3,000g에서 10 분간 원심 분리하십시오. 상등액을 제거하고 2 % NaCl 용액 (노출 매체) 1 ML에 미생물 펠렛을 다시 정지.

3. 노출 검사

  1. 컨트롤을 포함한 각 튜브에 다시 중단 세균 접종의 150 μL를 추가합니다. V. anguillarum 현탁액을 25 ° C에서 6 시간 동안 어둠과 지속적인 반응침전을 피하기 위해 떨고있다.
  2. 노출 시간의 시작 (T0)과 종료 (T6)에 콜로니 형성 장치 (CFU) 계산 방법을 사용하여 노출 된 모든 세균 현탁액에서 세균 계수를 수행합니다.
  3. 노출 된 세균 현탁액의 연속 희석액을 세 배 희석하여 10 배 희석 배수 ( 10-5 배까지)를 적용합니다. 노출 배지 (2 % NaCl) 900 μL로 이미 채워진 해당 튜브에 각 박테리아 현탁액 100 μL를 추가합니다. 일련의 희석을 계속하고 각 단계마다 볼 텍싱을하여 박테리아를 다시 정지시킵니다.
  4. 해당 세그먼트의 TSA 페트리 접시에 10 -4 및 10 -5 희석액 10 μL를 플레이트하십시오. 접시를 회전하여 작은 원을 신속하게 활주시킵니다. 플레이트를 25 ° C에서 48 시간 동안 배양한다.

4. CFU 계산

  1. 48 시간 후, 페트리 접시에서 성장한 식민지를 센다. b를 모으는 판정확한 집계를 위해서는 5 ~ 50 콜로니가 최적입니다.
  2. 다음 식을 적용하여 노출 된 세균 현탁액 1 mL 당 생균 수를 계산하십시오 :
    10 -4 → CFU / mL = n ° CFU x 100 x 10,000
    10 -5 → CFU / mL = n ° CFU × 100 × 100,000
  3. 평행 복제에서 얻은 계수의 평균을 사용하여 대조군과 비교하여 사망률을 평가하십시오. 다음 공식을 사용하여 사망률을 백분율로 계산합니다.
    M % = 100 - [(N / C) * 100]
    주 : N = 독성 물질에 노출 된 후에 성장한 CFU / mL의 수; C = 대조군 배지에서 성장한 CFU의 수.
  4. 적절한 통계 소프트웨어 (물질 표 참조)를 사용하여 비선형 회귀 분석으로 LC 50 ( 즉, mL 당 50 %로 활발하게 복제하는 박테리아의 수를 감소시키는 독성 물질의 농도; CFU / mL)를 계산합니다. 편도 분산 분석 실행 (ANOVA)post-hoc pairwise t- test를 통해 치료 간의 유의 한 차이를 평가했습니다.

Representative Results

V. anguillarum 을 4 가지 농도의 CuSO 4 에 노출시키는 세 가지 독립적 인 시험의 결과는 명확한 용량 - 반응 관계와 대조 독성 물질의 농도가 증가하는 콜로니를 적극적으로 복제하고 형성하는 박테리아의 현저한 감소를 보여줍니다 ( 그림 1 ; ANOVA, F = 20.28, p <0.001). CFU / mL의 수는 대조군 (CNTR)에 비해 1.25 mg / L (post-hoc Tukey 's test, p <0.05)에서 유의하게 감소했다. 모든 배양 가능한 박테리아는 시험 된 최고 농도에서 검출되었습니다. 노출 매체의 넓은 염분 범위 ( 즉, 5, 20 또는 35 g / L NaCl, 데이터는 표시되지 않음)에서 CuSO 4 독성의 차이는 발견되지 않았다. 비선형 회귀를 보여주는 통계 분석의 대표 결과는 보충 그림 1에보 고되어있다. 세 가지 독립적 인 시험 (<strong> 표 1)은이 방법의 실행 가능성과 재현성을 강조합니다.

그림 1
그림 1 : CuSO에 노출 된 Vibrio anguillarum 4. 6 시간 동안 CuSO 4 의 다른 농도에 노출 된 CFU / mL (CFU = 콜로니 형성 단위)의 평균 수. 값은 세 번의 독립적 인 임상 시험의 평균 (± 표준 편차)을 나타냅니다. 대조구 (CNTR)와 관련하여 적극적으로 복제 및 형성하는 박테리아의 감소는 노란색 상자에 백분율로보고됩니다. post-hoc Tukey 's test에 근거한 대조군과의 유의 한 차이는 별표 (* = p <0.05; ** = p <0.01)로 표시 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


표 1 : CuSO 4에 노출 된 Vibrio anguillarum의 치사 농도 (LC 50 ) 값. 세 가지 독립적 인 시도 및 평균 (± SD)의 결과가보고됩니다.


보충 그림 1 : 비선형 회귀 분석. 비선형 회귀 분석의 대표 출력 (Logit-Hill 모델)이 테스트 결과에 대해 수행되었습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 연구는 선충 독성 물질 인 CuSO 4 의 독성 영향을 평가하기 위해 성공적으로 적용된 해양 박테리아 인 V. anguillarum 에 대한 새로운 생물 분석을 기술하여 선량 - 반응 관계를 입증합니다. 해양 박테리아 인 V. anguillarum 은 모델 내성 유기체로 선택되었는데, 이는 해양 생태계의 내성, 유비쿼터스 및 대표성 때문입니다.

이 시험은 염분 값 (5 ~ 40)의 넓은 범위에서 수행 할 수 있으며 미생물이 전체 시험 기간 동안 쉽게 생존 할 수있는 한 생리 식염수 및 합성 또는 천연 해수를 노출 매체로 사용할 수 있습니다. 이것은 기수와 해양 환경을 포함한 다양한 종류의 시료 분석을 가능하게합니다.

노출 단계에서는 오염 물질과의 간섭을 피하고 생물학적 반응에 미치는 영향을 피하기 위해 성장 매체가 필요하지 않습니다. The 프로토콜은 신뢰성 있고, 빠르고, 비용 효율적이며 비교적 쉽습니다. 액체 - 플레이트 마이크로 카운트 9 의 절차는 작은 정확도와 견고 함을 의미하지만 작은 (샘플) 볼륨을 사용하는 이점을 제공합니다. 세 번의 독립적 인 임상 시험과 각 치료법의 결과는이 방법의 높은 반복성을 보여줍니다. 생물학적 모델로서의 세균의 사용과 기술의 적응성은이 과정의 생태 학적 및 환경 적 관련성을 선호한다. 다른 중요한 기술적 인 문제는 박테리아 접종 물의 제조 정확성과 절차의 일부 단계에서 요구되는 무균 성입니다.

제안 된 시험은 다른 해양 생태 독성 시험 (24 ~ 96 시간)보다 더 빠르고 (6 시간) 고등 생물의 사용으로 인한 윤리적 문제를 제기하지 않는다. 또한, 기준 독성 물질에 대한 데이터는 급성 t로 얻은 것과 비교되는 LC 50 값을 보여준다 다른 해양 생물 10 , 11 에 대해 좋은 감수성을 보여줍니다. 박테리아 생물 측정법 중 V. fischeri 발광 억제 시험은 가장 보편적이며 잘 표준화 된 시험이다. 이 바이오 분석법은 매우 빠른 속도 (15-30 분)로 고상 시료의 시험에 적합하지만, 발색 측정을 방해하는 색이 있거나 탁한 시료의 영향을받을 수 있습니다. 염분은 위에서 언급 한 시험의 사용에있어 제한 요소이며, 2 % NaCl이 요구된다. 반대로, V. anguillarum 과 함께 제안 된 시험은 염분 값의 넓은 범위에서 저렴한 결과를 제공하고, 탁한 시료 나 착색 시료에 대해서는 제한이 없으며, 루미넌스 분석기와 비교하여 덜 비싼 장비를 필요로합니다. 우리 연구의 결과와 V. fisheri 14 ,ss = "xref"> 15 , 16 은 비교 가능한 EC 50 값을 보여 주며,이 생물 검정의 효과를 뒷받침합니다.

이 생물 검정은 현재 미생물에 대해 가능한 시험에서 사용되는 인구 증가율 또는 효소 활성 저해 대신에 일반적으로 사망률이라고하는 세균 배양 가능성의 감소를 평가합니다. LC 50 계산은 일반적으로 종말점으로 생존 / 사망률을 갖는 해양 환경에 대한 생태 독성 평가에 일반적으로 적용되는 다른 생물 검정과의 비교를 허용합니다. 이 시험의 신뢰성과 재현성을 평가 / 확인하고 규제 프로토콜에서의 표준화 및 사용을 지원하기 위해서는 시험 간 훈련이 시급히 필요하다.

나노 물질의 사용 증가와 환경에서의 잠재적 배출은 위해성 평가의 필요성을 의미한다. 그러나, clas이러한 신흥 오염 물질에 대한 육체 (생태) 독성 학적 접근법은 적절한 결과를 제공하지 않는 것으로 보이며 일부 적응이 필요할 수 있습니다 18 . 이 새로운 생물학적 분석법의 특징은 나노 입자의 독성 평가에 대한 쉽고 유용한 적용을 가능하게합니다. 사실, 서로 다른 염도에서 분석을 수행 할 가능성은 독성에 중대한 영향을 줄 수있는 환경 변수 변수 인 다양한 이온 강도 하에서 나노 입자 거동을 설명 할 것입니다 19 . 또한 유기 물질은 독성 영향을 증가시킴으로써 흡수를 촉진 시키거나 응집을 일으켜 생체 이용률을 감소시켜 독성을 감소시킬 수 있기 때문에 나노 입자의 생태 독성 평가에서 성장 매체와 영양소의 사용을 권장하지 않는다.

결론적으로, Vibrio anguillarum에서의 생물 검정은 ap해양 및 염류 환경의 상태를 평가할뿐만 아니라 고전 및 신흥 오염 물질에 대한 위해성 평가 도구를 제공합니다.

Disclosures

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 연구는 "NanoBioTech ambiente salute"프로젝트 (NanoBioTech ambiente salute. Progetto 2 : Ambiente, Nanoparticelle의 환경 생태학 실험실 환경 측정)에 의해 재정 지원되었다. ( "나노 바이오 테크놀로지 : 환경과 건강, 프로젝트 2 : 환경. 생태 독성을위한 도구와 방법 regione Lazio-Consorzio Hypatia에서 LM에 부여 된 나노 입자 모니터링 " ). AR은 이전에 인용 된 프로젝트의 틀 아래 Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia 대학의 박사후 연구비에 의해 지원되었습니다. ISPRA-Tor Vergata University (N. 2015/52857)와의 협약은 시설의 상호 이용과 연구자 교환을 허용했다.

저자는 미생물 세계에 대한 관심을 높이고이 문제에 대한 연구를 향상시키기 위해 강력하게 도움을 주신 모든 미생물 활동에 대한 수호 천사 Maria Cristina Thaller 교수에게 감사드립니다. 저자는 Andrea Tornambè와 Eri를 감사하게 생각합니다.카 Magaletti는 식물성 플랑크톤 생태학 및 생태 독성학의 ISPRA 연구소와 소중한 협력을했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway)
Tryptic Soy Agar  Liofilchem 610052 Dehydrated Culture Media
Tryptic Soy Broth growth medium Liofilchem 610053 Dehydrated Culture Media
CuSO4·5H2O Sigma-Aldrich 209198
NaCl  Sigma-Aldrich S-3014
Name of Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Biosafety Laminar Flow Hood  ESCO
Incubator  Fratelli Galli Mod. 2100
Name of Software Company Catalog Number Comments/Description
Benchmark Dose Software  US EPA Benchmark Dose 2.4.0  2012

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Rotini, A., Manfra, L., Spanu, F.,… More

Rotini, A., Manfra, L., Spanu, F., Pisapia, M., Cicero, A. M., Migliore, L. Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants. J. Vis. Exp. (123), e55211, doi:10.3791/55211 (2017).

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