Summary
Este trabalho descreve um novo protocolo para avaliar a ecotoxicidade de poluentes, incluindo contaminantes emergentes como nanomateriais, utilizando a bactéria marinha Vibrio anguillarum . Este método permite a determinação da CL 50 , ou mortalidade, da concentração que provoca uma diminuição de 50% na cultura das bactérias, após uma exposição de 6 horas.
Abstract
As bactérias são um componente importante do ecossistema, e as alterações da comunidade microbiana podem ter um efeito significativo sobre o ciclo biogeoquímico e as redes alimentares. Os testes de toxicidade baseados em microorganismos são amplamente utilizados porque são relativamente rápidos, reprodutíveis, baratos e não estão associados a questões éticas. Aqui, descrevemos um método ecotoxicológico para avaliar a resposta biológica da bactéria marinha Vibrio anguillarum. Este método avalia a toxicidade aguda de compostos químicos, incluindo novos contaminantes, tais como nanopartículas, bem como amostras ambientais. O ponto final é a redução da culturabilidade bacteriana ( ou seja, a capacidade de replicar e formar colónias) devido à exposição a um tóxico. Esta redução pode ser geralmente referida como mortalidade. O teste permite a determinação da LC 50 , a concentração que provoca uma diminuição de 50% das bactérias activamente replicando e formando colónias, apósUma exposição de 6 h. As bactérias cultiváveis são contadas em termos de unidades formadoras de colónias (CFU), e a "mortalidade" é avaliada e comparada com o controlo. Neste trabalho, avaliou-se a toxicidade do sulfato de cobre (CuSO 4 ). Observou-se uma clara relação dose-resposta, com CL 50 média de 1,13 mg / L, após três testes independentes. Este protocolo, comparado com os métodos existentes com microrganismos, é aplicável numa gama mais alargada de salinidade e não tem limitações para amostras coloridas / turvas. Utiliza solução salina como meio de exposição, evitando possíveis interferências do meio de crescimento com os contaminantes investigados. O cálculo LC 50 facilita comparações com outros bioensaios comumente aplicados a avaliações ecotoxicológicas do ambiente marinho.
Introduction
Os bioensaios ecotoxicológicos avaliam a toxicidade de produtos químicos ou amostras ambientais com modelos biológicos padrão, integrando os efeitos dos estressores físicos, químicos e biológicos nos ecossistemas. Devido à complexidade dos ecossistemas, as avaliações de risco ecotoxicológico devem considerar uma bateria de bioensaios que envolvem organismos de diferentes níveis tróficos. Os ensaios de toxicidade em animais de laboratório podem ser dispendiosos, morosos e éticamente duvidosos. O desafio de limitar os ensaios em animais e de desenvolver abordagens alternativas ( por exemplo, sobre bactérias e animais não vertebrados) é actualmente uma questão central, tal como referido no quadro da actual legislação europeia, incluindo a Directiva da UE relativa à protecção dos animais, UE, e REACH.
Crustáceos, peixes e algas são amplamente utilizados para medições de toxicidade no ambiente marinho 1 . As bactérias são um componente importanteT do ecossistema e as alterações nas comunidades microbianas podem ter efeitos significativos sobre o ciclo biogeoquímico e outros serviços críticos do ecossistema. Testes de toxicidade baseados em microorganismos estão ganhando popularidade porque são relativamente rápidos, reprodutíveis e baratos e não levantam questões éticas 2 . O objetivo deste trabalho é descrever um protocolo ecotoxicológico para avaliar a resposta da bactéria marinha Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) quando exposta a contaminantes ambientais.
V. anguillarum é uma bactéria Gram-negativa, curta, em forma de curva (0,5 x 1,5 μm) com flagelo polar. Tipicamente encontrado em água salobra ou salgada, é halotolerante, com uma salinidade ideal de cerca de 20 e uma temperatura ideal entre 25 e 30 ° C 3 . Ele foi escolhido como um modelo de organismo devido à sua ubiqüidade e seus importantes papéis ecológicos em oceEm todo o mundo 4 . Alguns serótipos de V. anguillarum são conhecidos por causar vibriose em uma variedade de espécies de peixes marinhos ou salobres 5 , 6 . Para isso, algumas etapas do experimento requerem práticas microbiológicas padrão, mas não são necessários equipamentos especiais de segurança ou precauções. O protocolo de teste de toxicidade proposto utiliza a culturabilidade bacteriana ( isto é, a capacidade de replicar e formar colónias) como ponto final e permite a determinação da CL 50 , a concentração que causa uma redução de 50% de bactérias activamente replicando e formando colónias, após Uma exposição de 6 h. Em Vibrio , como em outros micróbios, esta redução, que geralmente indicamos como mortalidade, pode ser parcialmente devida a indivíduos na fase viável mas não cultivável (VBNC) 7 . Neste estudo, aplicamos este método para medir os efeitos tóxicos do sulfato de cobre (CuSO 4), Um tóxico de referência.
Este método foi desenvolvido para fornecer um teste adequado baseado em microrganismos para a avaliação ecotóxica de poluentes / compostos químicos, incluindo contaminantes emergentes como nanomateriais. A novidade deste protocolo em comparação com os métodos existentes utilizados para microorganismos está principalmente relacionada com o meio de exposição eo ponto final. De fato, a exposição é realizada em solução salina, evitando qualquer possível interferência do meio de crescimento com os contaminantes investigados, o que pode influenciar a resposta biológica 8 . O ponto final é a redução da culturabilidade bacteriana, que pode ser facilmente comparada com outros parâmetros de avaliação aguda utilizados para o rastreio ecotoxicológico em ambientes marinhos / salubres, com base na sobrevivência / mortalidade. Além disso, o protocolo utiliza a técnica de micro-contagem de líquido para placa, já utilizada em E. coli 9 , reduzindo volumes e, portanto, o ef experimental(Consulte os passos 3.3 e 3.4 do protocolo para mais detalhes).
Protocol
1. Preparação de Reagentes / Materiais
- Preparar (cerca de 300) tubos estéreis de 1,5 mL para a diluição em série de suspensões bacterianas, bem como tubos estéril de 15 mL como recipientes de teste marcados com as concentrações de teste.
- Preparar solução de NaCl a 2% como meio de exposição e esterilizar. Alternativamente, use água do mar sintética ou natural esterilizada, com salinidade variando de 5 a 40.
- Preparar o meio de cultura de agar de soja tryptic (TSA) com NaCl a 2% de acordo com as direcções do rótulo e considerando a quantidade de NaCl já presente no meio.
- Despeje o TSA (fresco, mas ainda líquido) nas placas de Petri de 90 mm previamente marcadas com a concentração do ensaio eo tempo de exposição, número de repetição e factor de diluição; 19 mL é um volume apropriado.
- Preparar caldo de soja tryptic (TSB) meio de crescimento de acordo com as instruções do rótulo. Adicionar a quantidade adequada de NaCl para obter a mesma salinidade que o meio de exposição.
- PrepararUma solução de reserva de CuSO4 com água duplamente destilada e esterilizar a alíquota (necessária) utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm. No caso de amostras ambientais, preparar um intervalo adequado de diluições da amostra e esterilizá-las utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm.
- Preparar as soluções de teste nos tubos de 15 mL marcados com as concentrações de teste. Preencher o controlo negativo com 5 mL do meio de exposição (NaCl a 2%). Encher os outros tubos com a quantidade apropriada de meio de exposição e solução de reserva de CuSO4 para obter as concentrações de teste num volume final de 5 mL.
2. Preparação do Inoculo Bacteriano
- 12-18 h antes do teste, preparar uma cultura líquida fresca de Vibrio anguillarum . Utilizando um ciclo estéril, seleccione uma única colónia bem isolada de uma cultura durante a noite num meio sólido (TSA). Inocular um tubo cheio com 10 mL de TSB e incubar a cultura bacteriana a 25 ° C durante 12-18 h. Após 12-18 h, estimar a concentração bacteriana do inóculo por espectrofotometria. Vortex o inóculo e medir a densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda, usando TSB como branco.
- Para se obter uma concentração bacteriana conhecida, diluir 2 mL do inoculo em vortex adicionando a quantidade de TSB calculada por esta fórmula:
TSB mL = [(OD / 0,14) * 2] - 2. - Verificar se a densidade óptica do inóculo diluído é de 0,140 (± 0,005), o que corresponde ao ponto 0,5 do padrão nefelométrico de McFarland.
- Centrifugar o inóculo diluído durante 10 min a 3.000 g . Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender a pastilha microbiana em 1 mL de solução de NaCl a 2% (meio de exposição).
3. Testando a Exposição
- Adicionar 150 μL do inóculo bacteriano ressuspenso a cada tubo, incluindo o controlo. Incubar as suspensões de V. anguillarum por 6 h a 25 ° C sob escuridão e em continuouAgitando para evitar a sedimentação.
- No início (T 0 ) e no fim (T 6 ) do tempo de exposição, efectuar contagem bacteriana em todas as suspensões bacterianas expostas utilizando métodos de contagem de unidades formadoras de colónias (CFU).
- Preparar diluições em série de cada suspensão bacteriana exposta em triplicado, aplicando um factor de diluição de dez vezes (até 10 -5 ). Adicionar 100 μL de cada suspensão bacteriana ao tubo correspondente já cheio com 900 μL de meio de exposição (NaCl a 2%). Proceder com a diluição em série, vortexing em cada etapa para voltar a suspender as bactérias.
- Placa 10 μL das diluições 10 -4 e 10 -5 em placas de Petri TSA no segmento correspondente. Rapidamente deixe as gotas deslizarem em um pequeno círculo girando a placa. Incubar as placas a 25 ° C durante 48 h.
4. Contagem de CFU
- Após 48 h, contar as colónias cultivadas nas placas de Petri; Pratos abrigando bE entre 5 e 50 colónias são óptimas para contagem exacta.
- Calcular o número de bactérias viáveis por mL de cada suspensão bacteriana exposta aplicando as seguintes fórmulas:
10 -4 @ CFU / mL = n ° CFU x 100 x 10 000
10 -5 → CFU / mL = n ° CFU x 100 x 100 000 - Utilizar a média das contagens obtidas em repetições paralelas para avaliar a mortalidade em relação ao controlo. Calcular a mortalidade como uma percentagem com a seguinte fórmula:
M% = 100 - [(N / C) * 100]
NOTA: Onde N = número de CFU / mL crescido após a exposição ao tóxico; C = número de UFC cultivadas no meio de controlo. - Calcule a CL 50 ( ou seja, a concentração de tóxico que reduz o número de bactérias que se replicam ativamente em 50% por mL, CFU / mL) com análise de regressão não-linear usando um software estatístico apropriado (ver tabela de materiais). Executar uma análise unidirecional de variância (ANOVA) follDevido a testes pós-hoc pairwise para avaliar diferenças significativas entre os tratamentos.
Representative Results
Os resultados de três ensaios independentes de exposição de V. anguillarum a quatro concentrações de CuSO4 mostram uma relação dose-resposta clara e uma diminuição significativa de bactérias activamente replicando e formando colónias com uma concentração crescente do tóxico de referência ( Figura 1 ; ANOVA, F = 20,28, p @ 0,001). O número de CFU / mL é significativamente reduzido a 1,25 mg / L (teste de Tukey pós-hoc, p <0,05) em comparação com o controlo (CNTR). Todas as bactérias cultiváveis foram detectadas na concentração mais alta testada. Não foram encontradas diferenças na toxicidade de CuSO 4 ao longo da vasta gama de salinidade do meio de exposição ( isto é, NaCl 5, 20 ou 35 g / L, dados não apresentados). Uma saída representativa da análise estatística mostrando a regressão não linear é relatada na Figura 1 Suplementar . Os valores de CL50 calculados para os três ensaios independentes (<Forte> Tabela 1) destacam a viabilidade e reprodutibilidade deste método.
Figura 1: Vibrio anguillarum exposto a CuSO 4. O número médio de CFU / mL (CFU = unidade formadora de colónia) exposto a diferentes concentrações de CuSO 4 durante 6 h. Os valores representam a média (± DP) de três ensaios independentes. As reduções de bactérias activamente replicando e formando colónias em relação ao controlo (CNTR) são reportadas nas caixas amarelas (como percentagens). Diferenças significativas com o controle, com base em um teste de Tukey pós-hoc, são indicadas com asteriscos (* = p <0,05; ** = p <0,01). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Valores de concentração letal (LC50) para Vibrio anguillarum exposto a CuSO 4 . Os resultados de três ensaios independentes e médias (± DP) são relatados.
Figura 1: Análise de regressão não-linear. Resultado representativo de uma análise de regressão não linear (modelo Logit-Hill) realizada sobre os resultados do teste. Clique aqui para fazer o download desta figura.
Discussion
Este trabalho descreve um novo bioensaio com a bactéria marinha V. anguillarum que foi aplicada com sucesso para avaliar os efeitos tóxicos de CuSO 4 , um tóxico de referência, demonstrando uma clara relação dose-resposta. A bactéria marinha V. anguillarum foi escolhida como organismo modelo porque é halotolerante, ubíqua e representativa dos ecossistemas marinhos.
O teste pode ser realizado com uma ampla gama de valores de salinidade (5-40) e pode usar soluções salinas e água do mar sintética ou natural como meio de exposição, desde que microorganismos possam sobreviver facilmente durante todo o teste. Isto permite a análise de diferentes tipos de amostras, incluindo ambientes salobre e marinho.
Nenhum meio de crescimento é necessário durante a fase de exposição, evitando sua interferência com os contaminantes 8 e sua possível influência na resposta biológica. ºO protocolo é confiável, rápido, econômico e relativamente fácil. O procedimento das micro-contagens de líquido para placa 9 dá a vantagem de utilizar pequenos volumes (de amostra), embora isso implique um alto grau de precisão e robustez. Os resultados dos três ensaios independentes e repetições para cada tratamento mostram a elevada repetibilidade deste método. O uso da bactéria como modelo biológico, bem como a adaptabilidade da técnica, favorecem a relevância ambiental e ambiental deste procedimento. Outras questões técnicas críticas são a precisão na preparação do inóculo bacteriano ea esterilidade necessária em algumas etapas do procedimento.
O teste proposto é mais rápido (6 h) do que outros ensaios ecotoxicológicos marinhos (24-96 h) e não levanta os problemas éticos resultantes da utilização de organismos superiores. Além disso, os dados sobre o tóxico de referência mostram valores de CL50 comparáveis aos obtidos com Outras espécies marinhas 10 , 11 , demonstrando uma boa sensibilidade. Entre os bioensaios bacterianos, o teste de inibição de luminescência por V. fischeri é o mais comum e bem padronizado 12 . Este bioensaio é muito rápido (15-30 min) e é válido para o teste de amostras em fase sólida, mas pode ser afetado por amostras coloridas e turvas, que interferem com as medições de luminescência. A salinidade é um fator limitante no uso do teste acima mencionado, sendo necessário 2% de NaCl 13 . Pelo contrário , o teste proposto aqui com V. anguillarum dá resultados acessíveis a uma ampla gama de valores de salinidade, não tem limitações em relação a amostras turvas ou coloridas e requer equipamento menos dispendioso em comparação com os analisadores de luminescência. Uma comparação entre os resultados de nosso estudo e os disponíveis na literatura para V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 mostra valores CE 50 comparáveis, suportando ainda a eficácia deste bioensaio.
Este bioensaio avalia a redução da culturabilidade bacteriana, geralmente referida como mortalidade, em vez de taxa de crescimento populacional ou inibição da atividade enzimática, que são utilizados nos testes atualmente disponíveis para microorganismos. O cálculo LC 50 permite a comparação com outros bioensaios comumente aplicados à avaliação ecotoxicológica de ambientes marinhos, que muitas vezes têm a sobrevida / mortalidade como ponto final. Um exercício de intercalibração é urgentemente necessário para avaliar / confirmar a confiabilidade e reprodutibilidade deste teste e para apoiar sua padronização e uso em protocolos regulatórios.
A utilização crescente de nanomateriais e a sua libertação potencial no ambiente implicam a necessidade de uma avaliação dos riscos 17 . No entanto,(Eco) toxicológicas para estes contaminantes emergentes parecem não dar resultados acessíveis e podem exigir algumas adaptações 18 . As características deste novo bioensaio permitem sua aplicação fácil e útil para a avaliação da toxicidade de nanopartículas. De facto, a possibilidade de realizar o ensaio em diferentes salinidades dará contas do comportamento das nanopartículas sob diferentes forças iónicas, uma variável de parâmetro ambiental que pode afectar significativamente a toxicidade 19 . Além disso, o uso de meio de crescimento e nutrientes é particularmente recomendado nas avaliações de ecotoxicidade das nanopartículas, porque as substâncias orgânicas podem facilitar sua absorção aumentando os efeitos tóxicos 20 ou podem causar agregação, reduzindo a fração biodisponível e, portanto, sua toxicidade 21 .
Em conclusão, o bioensaio sobre Vibrio anguillarum éRomanização para a avaliação de riscos de contaminantes clássicos e emergentes, bem como para a avaliação do estado dos ambientes marinhos e salobra.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo projecto de investigação "NanoBioTech ambiente e salute, Progetto 2: Ambiente, Estudo e metodologia para o monitoramento ecotossicológico da Nanoparticela" ( "Nano-BioTechnology: ambiente e saúde. Monitorização de nanopartículas " ) concedida à LM pela Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR foi financiado por uma bolsa de pós-doutorado da Universidade de Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia no âmbito do projecto anteriormente citado. Um acordo com a Universidade ISPRA-Tor Vergata (N. 2015/52857) permitiu o uso mútuo das instalações eo intercâmbio de investigadores.
Os autores agradecem à Profa. Maria Cristina Thaller, anjo da guarda para todas as atividades microbianas, para despertar o interesse no mundo microbiano e por ajudar fortemente a melhorar nossa pesquisa sobre o assunto. Os autores agradecem a Andrea Tornambè e EriKa Magaletti pela colaboração preciosa com o laboratório de Phytoplankton da ecologia e do ecotoxicology de ISPRA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
- Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information (2008).
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , Azur Environmental. 20 (1995).
- Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
