Abstract
Lymfocytproliferation som reaktion på antigene eller mitogene stimulering er en let kvantificerbar fænomen nyttig til afprøvning immunmodulerende (dvs. immunsuppressiv eller immunstimulerende) kemiske forbindelser og biologiske. En af de tidligste trin under mitogenese er celle forstørrelse eller blastogen transformation, hvorefter stiger celle volumen før division. Det er normalt påvises i de første mange timers T-lymfocyt-stimulering. Her beskriver vi en hurtig fremgangsmåde til at kvantificere blastogenese i T-lymfocytter isoleret fra muse milt og humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) anvendelse af en automatiseret celletæller. Forskellige almindeligt anvendte proliferationsassays for det meste er besværlig og kun afspejler den samlede befolkning effekt snarere end individuelle cellulære effekter inden for en population. I modsætning hertil præsenteres automatiseret celletæller assay tilvejebringer hurtig, direkte og præcise målinger af cellediametre, der kan værebruges til at vurdere effektiviteten af forskellige mitogener og immunmodulerende lægemidler in vitro.
Introduction
T-lymfocytter er de primære celler er ansvarlige for adaptiv immunitet i pattedyr. Det er kendt, at de reagerer på specifikke antigene peptider præsenteret af MHC-molekyler på overfladen af antigenpræsenterende celler. Ved aktivering af en beslægtet T-celle-receptor (TCR), cellen forstørrer i en proces betegnet blastogen omdannelse eller blastogenese. Denne proces kan påvises i den første ~ 6 timer efter at stimulus påføres 1. Under blastogenese, mængderne af individuelle T-celler øges 2- til 4-fold 2-6. Lymfocytter begynder at proliferere i en proces kaldet klonal ekspansion, hvis formål er at generere så mange kloner af antigen-specifikke TCR-bærende celler som muligt. Afkom-celler derefter udøve deres immunologiske funktion ved at differentiere til cytotoksiske (CD8 +) eller hjælper (CD4 +) T-lymfocytter. Således naive T-lymfocytter i humant eller muse blod er i G 0 (hviler) fase af cellencyklus og støtte minimal metabolisk aktivitet. Ved udsættelse for antigener eller mitogener, T-celler genindtræde cellecyklussen, med en samtidig stimulering af transkription og proteinsyntese 7-10. Mitogener, såsom phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) og ionomycin stimulere lymfocytterne via aktivering af protein kinase C (PKC) og Ca2 + -afhængige signalveje 1. Aktiveringen af T-celler med PMA / ionomycin omgår TCR signalering trin.
In vitro proliferation assays er almindeligt brugt til det formål at vurdere lymfocytfunktionen og respons på stimuli. Spredning aflæsninger tages typisk en til tre dage efter påbegyndelse af T-cellestimulering og afspejler den kollektive tilstand af hundreder eller tusinder af celler. Styrken af forskellige mitogener og immunmodulerende lægemidler in vitro kan bedømmes ved blot at måle proliferationshastigheder i nærvær af disse forbindelser. Nogle af disse enssays og deres begrænsninger er diskuteret nedenfor.
For direkte celletal optælling, proceduren er tidskrævende, med en høj sandsynlighed for operatørfejl.
For DNA-syntese, den 3H-thymidin inkorporering assay måler DNA-syntese, men dens største begrænsning er dens radiotoksicitet. En ikke-radioaktiv alternativ er BrdU, men rækken af lineære respons for cellevækst er begrænset og antistofbehandling er påkrævet, som forøger antallet af trin i proceduren 11,12.
Til metabolisk aktivitet, tetrazoliumsalte (MTT, MTS, XTT, og WST-1) og Resazurinfarvestof-baserede kolorimetriske assays rapporterer den generelle metaboliske tilstand dividere cellepopulationer. Men MTT ikke er opløseligt i dyrkningsmediet, kræver yderligere vasketrin, således inkorporere fejl i målingen; XTT brug yderligere komponenter for at reducere effektivt; MTS-, WST-1- og tilsætte Resazurin-baserede målinger er påvirkeed af dyrkningsmediet pH og dets komponenter serum, albumin eller phenolrødt 13-16. Disse assays måler ikke det faktiske antal af levedygtige celler, men snarere estimere de kombinerede enzymaktiviteter. Derfor proliferationshastigheden kan ikke bestemmes nøjagtigt ved metaboliske assays på grund af det ikke-lineære korrelation mellem celleantal og reduktion farvestof 12,17.
Til måling ATP-koncentration, T-celle-aktiverings-induceret stigning i ATP korrelerer med proliferation. Imidlertid elevation af intracellulær ATP er en af de indledende trin i T-celleaktivering; mange skridt bag er den faktiske spredning 17,18.
For farvestof fortynding assay CFSE fluorescerende farvestof farver celler ved kovalent binding til intracellulære proteiner. Farvestoffet viser en spredning-afhængigt fald i fluorescensintensitet, som kan spore antallet af celledelinger. Men på grund af kovalente protein mærkning, funktioner disseproteiner kan være kompromitteret. Farvestoffet er toksisk for cellerne ved højere koncentrationer. Ved lavere koncentrationer farvestof er imidlertid den indledende fluorescensintensitet reduceret, mindske antallet af celledelinger, der kan spores. Derudover, efter mærkning med CFSE, der er en spredning-uafhængig ~ 50% tab af indledende fluorescens under den første 24 til 48 timer periode, hvilket begrænser det dynamiske område for dette assay 19,20.
De fleste af disse assays afspejler den kollektive tilstand af et stort antal celler og kræver behandling af cellerne med fluorescerende farvestoffer. Nekrotiske og apoptotiske celler kan også bidrage til disse målinger, medmindre de fjernes fra analysen ved farvning med kemikalier eller antistoffer.
Lymfocyt blastogenese kan evalueres ved en række fremgangsmåder, såsom optisk mikroskopi eller flowcytometri 4,21,22. Her beskriver vi en hurtig fremgangsmåde til måling af T-celle-størrelser under anvendelse af enn automatiseret celletæller, som indsamler realtid celle billeder, der er gemt og kan genbruges analyseret på et senere tidspunkt. Foruden størrelse målinger, denne enhed giver præcise celleantal og procentdelen af levedygtige celler, som bestemt ved trypanblåt-farvning udelukkelse. Den enhed, der bruges i denne protokol er kommercielt tilgængelige, og producenten testet præcisionen af instrumentet ved hjælp af tre forskellige instrumenter og flere koncentrations- og levedygtighed kontrol. Resultaterne af disse undersøgelser viste en koefficient af varians, der var generelt under 6%. Som nævnt i protokollen, er enheden kalibreres regelmæssigt med 6 um og 8 um polystyren diameter perler. Fordelene ved at anvende en celletæller at differentiere mellem hvilende T-celler og T-lymfoblaster baseret på cellediameter er brugervenligheden og den automatiserede arten af analysen. Softwaren er i stand til at tegne en cirkel rundt om hver celle og beregning af cellediameter. Derudover imaldre er synlige for operatøren, der kan kontrollere rigtigheden af instrumentet identificere cellerne og korrekt tegne en cirkel omkring dem. Med hensyn til begrænsninger, kan instrumentet ikke i sig selv skelne mellem snavs og celler; Derfor er det vigtigt, at operatøren ser hvert billede, da det bliver behandlet. Der er et potentiale for at inkorporere luftbobler, som vil reducere antallet af brugbare områder til analyse; dette er imidlertid sjældent, hvis en regelmæssig udskylning vedligeholdelse udføres.
I denne undersøgelse blev grupper af milt-T-lymfocytter stimuleret med ionomycin og stigende koncentrationer af PMA i 12-48 timer. PMA-koncentrationer så lave som 2 ng / ml inducerede både en robust blastogen respons og signifikant proliferation. Målinger af virkningerne af en række lægemidler, såsom immunosuppressive cyclosporin A (CsA), FK506 (tacrolimus), og rapamycin (sirolimus), samt ionkanalblokkere TRAM-34 og FTY720 (fingolimod), om blastogenese viste god overensstemmelse med rapporterede effekter på spredning. Den blastogen respons af humane PBMC'er til PMA / ionomycin og murine T-celle-stimulering med anti-CD3 og anti-CD28 antistof-coatede magnetiske perler blev også målt.
Cellen counter assay kvantificerer både blastogenese og spredning sats (celletæthed) samtidig, men hver for sig, i modsætning til de ovennævnte metoder, der ser på en kombination af disse effekter. Den præsenterede protokol giver en hurtig og robust teknik for at vurdere styrken af mitogene og immunmodulerende midler.
Protocol
Alle forsøg udføres i overensstemmelse med protokoller er godkendt af Wright State University Lab Animal Care og brug Udvalg og Institutional Review Board.
BEMÆRK: humane PBMC'er isoleres ved Ficoll densitetsgradientcentrifugering metode 5.
1. Spleen Harvest
- House voksen kvindelige ICR mus i standard lab vilkår med fødevarer, vand og strøelse særlige krav til arten.
BEMÆRK: Dyr havde en gennemsnitsalder på 2,9 måneder og en gennemsnitlig vægt på 30,4 g på tidspunktet for eutanasi. - På datoen for isolation (DOI), aflive dyrene enkeltvis uden andre conspecifikt dyr til stede. Gør alle bestræbelser på at sikre minimal stress til musen. Euthanize hjælp CO 2 med sekundær cervikal dislokation at sikre døden.
- Sende dyret, stadig inde overførsel buret, ind i CO 2 kammer og start gasstrømmen ved 5 l / min. Denne strømningshastighed fortrænger oxygen ved den anbefalede 10-30% per min.
- Efter at dyret er bevidstløs, forøge CO2 strømningshastighed til 15 l / min. Check dyret til ophør af åndedræt og efterlade i kammeret i yderligere 2 min.
- Påfør cervikal dislokation med distraktion kraft til at sikre døden.
- Høst milten fra dyret ved hjælp af aseptisk teknik inden for 10 min for døden.
- Sterilisere to sæt saks og pincet til fjernelse af milten i en autoklave ovn før anvendelse. Steriliser dissektion overflade ved at påføre 70% ethanol.
- Påfør 70% ethanol til musen maven. Brug ét sæt saks og pincet, lave et snit i pels og hud fra venstre side af maven, og derefter trække fra hinanden og skrælle huden til at afsløre bughinden. Når udsatte, anvende 4% klorhexidin løsning, før du åbner bughinden.
- Brug af det andet sæt af scissors og pincet, lave en 2- til 3-cm snit langs den centrale del af maven. Åbn bughinden og fjern milten ved at skære væk viscerale vedhæftede filer og overskydende fedt. Placer milten i Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS).
2. Udarbejdelse af Raw Spienocytter
BEMÆRK: Udfør alle trin under en laminar flow biosikkerhed kabinet ved hjælp af aseptisk teknik.
- Soak de høstede milte i 10 ml deioniseret sterilt H2O i 5 minutter i en 10 cm dyrkningsskål at lysere overflade erythrocytter.
BEMÆRK: Dette trin kan udelades, hvis milten blev beskadiget under isolation. - For at frigøre splenocytterne, knuse miltene mellem to steriliserede glasplader (matteret side vendende milten) over en frisk 10 cm dyrkningsskål. Bland med 10 ml RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 50 IE / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin (nedenfor henvist til ens komplet RPMI).
- Filter cellerne gennem et sterilt 40 um nylon celle si i en ny 10 cm dyrkningsskål at fjerne bindevævet og snavs.
- Lyse de resterende erythrocytter ved tilsætning af 20 ml RBC lysis buffer bestående af 155 mM NH4CI, 10 mM NaHCO3, og 0,1 mM EDTA ved pH 7,4 og ~ 300 mOsm / l.
BEMÆRK: Osmolalitet måles ved en frysepunktet eller et damptryk osmometer.- Overfør cellerne fra den 10-cm plade til en 50 ml konisk rør og centrifugeres ved 250 xg i 10 min (4 ° C).
- Fjern supernatanten, tilsættes 20 ml RBC lysis buffer og re-suspendere de pelleterede celler ved pipettering.
- Der inkuberes ved stuetemperatur i lysisbuffer i 10 min under forsigtig vipning.
- Centrifuger i 10 minutter ved 250 xg (4 ° C) for at pelletere cellerne. Hæld lysisbuffer.
- Resuspender celler i 10 ml komplet RPMI og centrifuger igen (250 xg, 10 min, 4 ° C). Discard supernatanten.
- Resuspender splenocytterne i 2 ml komplet RPMI opvarmet til 37 ° C til overførsel til nylon uldfiber kolonnen.
3. Oprensning af T-lymfocytter
- Vask nylon uld kolonnerne to gange med 5 ml komplet RPMI. Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO 2 cellekultur inkubator i 1 time.
BEMÆRK: Det er bydende nødvendigt at holde nylonuld våd under hele forsøget og at anvende komplet RPMI opvarmet til 37 ° C for alle nylon uld isoleringstrin. - Tilføj isolerede splenocytter til søjlen og inkuberes i 1 time for at tillade B-cellerne, fibroblaster, og accessoriske celler til at klæbe til nylonuld.
- Tilsæt 2 ml RPMI indeholdende splenocytterne i kolonnen og passerer igennem indtil toppen af nylonuld er nået.
- Tilsæt 2 ml komplet RPMI opvarmet til 37 ° C på toppen af nylon uld og passerer mediet gennem uldenindtil væskeniveauet når den øverste overflade.
- Tilsæt 3 ml varmt komplet RPMI til søjlen til helt at dække nylon uld.
- Inkubér indlæst kolonne uforstyrret i et 37 ° C, 5% CO2 cellekultur inkubator i 1 time.
- Eluer cellerne ved vask af søjlen to gange med 5 ml komplet RPMI. Udføre en supplerende vask af de eluerede celler ved centrifugering.
- Fyld kolonnen til toppen 2 gange med komplet RPMI og lad opløsningen i søjlen til at strømme gennem i en 50 ml sterilt konisk rør.
BEMÆRK: Undgå at trykke eller støde kolonnen, som kan løsne de B-celler, accessoriske celler, og fibroblaster klæber til nylon uld. - Opsaml gennemstrømning fraktion og centrifugering ved 250 xg i 10 min (4 ° C) for at pelletere cellerne. Der vaskes én gang med 10 ml komplet RPMI. Pelletere cellerne igen (250 xg, 10 min, 4 ° C) og re-suspendere i 2 ml komplet RPMI.
- Mål c ell densitet ved anvendelse af et hæmocytometer og fortyndet i komplet RPMI til 0,5 x 10 6 celler / ml.
- Seed 1 eller 2 ml portioner af celler i hver brønd i en 24- eller 6-brønds celledyrkningsplade henholdsvis og dyrke cellerne ved 37 ° C med 5% CO2.
BEMÆRK: 1 mM 1,4-dithiothreitol (DTT) kan tilsættes til hver brønd på nuværende tidspunkt at forbedre T-celleoverlevelse. - Valgfrit: Bekræft effektiviteten af isolation protokol ved flowcytometri. Denne protokol normalt giver ~ 80% T-lymfocytter 23.
BEMÆRK: Nylon uld-oprenset celler indeholder ca. 50% CD4 + og 23% CD8 + -celler. For at oprense CD4 + og CD8 + subpopulationer yderligere, kan et enkelt immunomagnetisk depletering trin udføres ved anvendelse otte antistoffer og magnetiske perler 24. Alternativt kan renere CD4 + og CD8 + T-cellepopulationer isoleres ved positiv eller negativ selektion med specifikke antistoffer.
- Fyld kolonnen til toppen 2 gange med komplet RPMI og lad opløsningen i søjlen til at strømme gennem i en 50 ml sterilt konisk rør.
- Aktivere T-lymfocytter inden 24 timer af isolation ved tilsætning af PMA og ionomycin calciumsalt eller magnetiske perler overtrukket med anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer 23,25,26. Tilføj eksperimentelle lægemidler (f.eks, CSA, FK506, rapamycin, TRAM-34, og FTY720) på tidspunktet for aktivering.
BEMÆRK: Her PMA-koncentrationer varierede fra 2 til 250 ng / ml, og den ionomycin-koncentrationen blev holdt ved 250 nM. Om muligt bør fortyndinger fremstilles ud fra stock portioner af hvert lægemiddel, således at den til hver brønd af celler volumen er ≥1 pi at sikre reproducerbarhed. Den anti-CD3 / anti-CD28-overtrukne magnetiske perler tilsættes i en 1: 1 bead-til-celle-forholdet. Forøgelse af antallet af perler pr celle (dvs. perle-til-celle-forhold) vil øge intensiteten af stimulering 25,26. Perlerne vaskes og resuspenderes i komplet RPMI før deres tilsætning til cellerne. Bemærk at trypanblå pletter perlerne. - Kultur cellerne for 12-72 timer ved 37 ° C med 5% CO2 før analyse med det automatiserede celletæller.
5. Automatiseret Cell Counter Dataindsamling
- Før du kører prøven, skal du sørge for, at cellerne forsigtigt blandes med en serologisk pipette for at undgå klumper. Dette er særlig vigtigt for aktiverede lymfocytter grund af deres forøgede klæbeevne.
- For kulturer, der aktiveres med anti-CD3 / CD28 beads, efter pipettering, overføres prøven til et 1,5 ml eller 2 ml centrifugerør. Adskil perlerne ved at holde røret på en magnet for 1-2 min. Brug supernatanten indeholdende cellerne til analyse.
BEMÆRK: Analyser både hvilende og aktiverede celler inden for 1 time at tage højde for en på forhånd aktivering af hvilende celler ved serum stede i dyrkningsmediet. Efter 12 timer af PMA / ionomycin stimulation, en lille stigning i cellestørrelse var påviselig (figur 2
- For kulturer, der aktiveres med anti-CD3 / CD28 beads, efter pipettering, overføres prøven til et 1,5 ml eller 2 ml centrifugerør. Adskil perlerne ved at holde røret på en magnet for 1-2 min. Brug supernatanten indeholdende cellerne til analyse.
- Overfør 1 ml af cellesuspensionen til en prøvekop og køre det gennem den automatiserede celletæller i henhold til instruktionerne i manualen.
NB: For hver af forsøgene, bør der anvendes et minimum på 1 ml (højst 2 ml) af cellekultur. Den automatiserede celletæller anvender en sprøjte til at blande trypanblåt med cellesuspensionen og passerer cellen-trypanblåt blanding over et felt, der afbildes og analyseres af softwaren. Softwaren registrerer trypanblåt-farvede celler, tegner en cirkel rundt om hver celle, og bestemmer diameter. 100 billeder indsamles fra hver prøve, og cellelevedygtighed og størrelser bestemmes. detektionsgrænsen af cellen counter bruges her har en nedre grænse på 5 um. - Overfør data fra hver kørt til et regneark til yderligere analyse.
- Kalibrer enheden regelmæssigt ved hjælp af en enml prøve af 6 pm og 8 um polystyren diameter perler.
BEMÆRK: Den faktiske perle størrelser målt af fabrikanten for hvert parti skal anvendes, ikke den nominelle størrelse. 6 og 8 um perler er praktisk, fordi disse diametre er tæt på de forventede diametre af hvilende og aktiverede T-celler (se figur 1).
6. Data og statistisk analyse
- Analyser af data ved hjælp af passende statistisk og graftegning software.
BEMÆRK: regnearket for hver kørsel indeholder antallet af celler med hver diameter (interval: 5 um til 70 um). Cellerne over en 17 um diameter fjernes fra analysen for at udelukke støvpartikler og små bobler, som kan læses som levedygtige celler ved instrumentet. - Udfør hypotese test hjælp Welch t-test for datasæt med ulige varians; Resultaterne anses statistisk signifikante, hvis p <0,001. Den anvendte formel var,
hvor
og 
er eksempler midler, 
og 
er eksempler afvigelser, og 
og 
er stikprøvestørrelser for hvert datasæt. Antallet af frihedsgrader er konservativt estimeres ved den mindste af de to stikprøvestørrelser for hver sammenligning. Søjlediagrammer er præsenteret som middelværdi ± SEM.
og 
er eksempler midler, 
og 
er eksempler afvigelser, og 
og 
er stikprøvestørrelser for hvert datasæt. Antallet af frihedsgrader er konservativt estimeres ved den mindste af de to stikprøvestørrelser for hver sammenligning. Søjlediagrammer er præsenteret som middelværdi ± SEM. 7. Milt-T-lymfocyt-proliferationsassay
- Mål T-celleproliferation ved anvendelse af en MTS- eller MTT-kolorimetrisk pladelæser proliferationsassay.
BEMÆRK: Analysen er basend på MTS tetrazoliumforbindelse (Owen reagens) reduktion til opløseligt formazanprodukt, sandsynligvis ved NADPH eller NADH produceret i metabolisk aktive celler ved dehydrogenaseenzymer. - Tæl oprensede T-celler med en hæmocytometer og re-suspendere dem i komplet RPMI-1640 ved en endelig densitet på 1 x 10 6 celler / ml.
BEMÆRK: 1 mM DTT kan tilsættes til cellerne i denne fase. - Aktivere cellerne med PMA og ionomycin sammen med testlægemidlerne, hvis det kræves, og blandes forsigtigt (svarende til trin 4).
- Plade 100 pi cellerne i hver brønd i en 96-brønds-cellekultur behandlet plade og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 i 48 timer. Tilsæt 100 pi RPMI-1640-medier uden celler i en brønd for at opnå en aflæsning af baggrunden absorbans.
- Tilsæt 20 pi MTS-reagens til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 4 timer.
- Læs absorbansmålinger ved 490 nm ved anvendelse af en pladelæser. A'etbsorbance målinger svarer til antallet af metabolisk aktive celler i hver brønd.
BEMÆRK: Træk baggrundsniveauer, hvis nødvendigt. Absorbansværdierne baggrund afhænge af typen af dyrkningsmedium, serum, ydre pH, og varigheden af MTS-reagens lyspåvirkning. MTS-baserede reagenser er lysfølsom, og udsættelse for lys i flere timer kan resultere i højere background absorbansværdier.
Representative Results
Vi anvendte dette assay til sammenligning lymfocyt blast dannelse under stimulering med PMA, en phorbolester, og ionomycin, en calciumionophor. Figur 1A viser frekvensfordelingen af diametre af hvilende og farmakologisk aktiverede milt-T-celler. Behandling af celler med PMA / ionomycin for ~ 2 dage resulterede i et markant skift i medianen af fordelingen mod større diametre (se f.eks henvisning 4). Antallet af celler med mindre diametre blev således reduceret. For at konstatere, at vores enhed rapporterede de korrekte diametre, vi udførte to kalibreringer med polystyren perler af 6 um og 8 um diametre (se Materialer tabel). Figur 1B og 1C viser aflæsninger fra aktiverede T-celler overlejret med en 8 um standard og hvilende T-celler overlejret med en 6 um standard. Figur1D viser kontrol perlestørrelser indberettet af producenten plottet mod den mediane diametre målt med vores automatiske celletæller. Det viste sig, at 6 um størrelse var lidt overvurderet i vores målinger, sandsynligvis på grund af tærsklen af instrumentet har en nedre grænse på 5 um måling. Men standardafvigelsen af perlen diametre beregnes fra celle counter målinger var i overensstemmelse med standardafvigelsen rapporteret af producenten. Vi konkluderer ud fra disse forsøg, denne enhed kan bruges pålideligt at sammenligne hvile og mitogenstimulerede muse T-celle størrelser, og at enheden nøjagtigt kan måle den faktiske celle diametre.
Vi fortsatte derefter med at teste afhængighed af stigningen den gennemsnitlige diameter på PMA koncentration og fundet, at, til en fast ionomycin koncentration på 250 nM, PMA virkning blev ikke signifikant ændret ved at løfte sin koncentration from 2 til 250 ng / ml (figur 2A). Brug af MTS-assay målte vi T-celleproliferation ved 50 og 250 ng / ml PMA og fandt ingen mærkbar forskel (figur 2C), i overensstemmelse med data vores cellediameter. Calcineurin inhibitor narkotika cyclosporin A (300 nM) og FK506 (1 nM) undertrykte både blastogenese (figur 2B) og proliferation (figur 2C). Hæmning var ikke komplet i begge tilfælde dog. Målinger udført 12 timer efter PMA / ionomycin tilsætning viste en 7,2% og 6,8% forøgelse i diameter for 50 ng / ml og 250 ng / ml PMA, henholdsvis (figur 2D). Størrelse stiger ved disse to koncentrationer var ikke signifikant forskellige, som det var tilfældet i 48 timer stimulation (sammenlign figur 2A).
data De celle diameter indsamlet fra hvile og aktiverede T-celler efter 48 timer af PMA / ionomycin stimulation er sammenfattet i
Vi testede også andre kemiske forbindelser er rapporteret at være immunosuppressive: CsA, FK506, rapamycin, FTY720 og sporvogn-34. I figur 3 cell size målinger opnået i hvilende og aktiverede T-celler i fravær og nærvær af disse lægemidler er vist. CsA og FK506, som er målrettet mod calcineurin-afhængige nuklear faktor af aktiverede T-celler (NFAT) 27,28, var den mest potente, hæmme blastogen reaktion med næsten 72% (figur 3A og 3B). Interessant, medforøgede PMA-koncentrationer, styrken af CsA og FK506 faldet en smule, selv om der var ingen yderligere stigning celle diameter i fravær af disse lægemidler (figur 2A og 2B). Rapamycin, et immunosuppressivt middel, som inhiberer mammalian target of rapamycin (mTOR) 29,30, havde en moderat, men statistisk signifikant virkning (figur 3A, 3B og 3C). FTY720 er en sphingosin 1-phosphat-receptor-agonist, som hæmmer lymfocyt egress i omløb 31 og blev for nylig vist sig at inhibere TRPM7 en kation kanal højt udtrykt i T-lymfocytter 32. Både FTY720 og rapamycin havde en sammenlignelig virkning på blastogenese, hvilket reducerer den fra gennemsnittet af en stigning i diameter 52% til ca. 34% (figur 3A og 3B). TRAM-34 er en blokker af calcium-aktiverede kaliumkanal KCa3.1 33. Testet ved 700 nM, TRAM-34 var ineffektiv i murine T-celler, in ifølge en nylig human T-celleproliferation undersøgelse; dets styrke kan afhænge af arten og styrken af mitogen stimulation 34 (figur 3A og 3B). 700 nM TRAM-34 var effektive til at blokere KCa3.1 kanaler i vores patch clamp elektrofysiologi eksperimenter (data ikke vist). Sammenligningen blev foretaget mellem hvile og narkotika-eksponerede celler i flere forsøg inden for samme eksperiment på 48 timer. Når rapamycin og CsA blev anvendt sammen, blastogenese var fuldstændigt inhiberet (figur 3C).
Aktivering af murine T-celler med anti-CD3 / anti-CD28-overtrukne magnetiske perler i 72 timer frembragte en stigning i den gennemsnitlige diameter, som blev reduceret til 5% i nærvær af CsA (figur 3D) 27%. Humane mononukleære celler efter PMA / ionomycin aktivering i 48 timer steg i diameter med 33%, og aktivering i nærvær af CsA faldt responset på 23% ( inden-side = "1"> Tabel 1: Sammenfatning af den gennemsnitlige cellediameter og relative forøgelser i overfladeareal. Målinger blev udført 48 timer efter aktivering med 250 ng / ml PMA og 250 nM ionomycin. 
Figur 1: hyppighedsfordeling af murine milt-T-celle-diametre. (A) Sorte søjler angiver hvile og røde søjler angiver PMA / ionomycin-aktiverede (48 t) celler. (B) Udlodning af aktiverede milt-T-celler oven på en 8 um partikelstørrelse kalibrering standard. (C) Udlodning af hvilende T-celler overlejret på en 6 um kalibrering standard. Antallet af celler og perler, der anvendes, er angivet i kasser. (D) Median diameter målt ved celletæller afbildet mod perlediameteren rapporteret af fabrikanten. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2: Afhængighed af murin T-celleaktivering på PMA koncentration. (A) Mean diametre på T-celler enten ubehandlede eller behandlet med 2, 50, og 250 ng / ml PMA til en fast ionomycin koncentration (250 nM). (B) Cell counter målinger af hvilende og aktiverede (2, 50, 250 ng / ml PMA) T-celler i fravær og tilstedeværelse af 300 nM CsA eller 1 nM FK506. (C) MTS proliferation assay ved 50 og 250 ng / ml PMA med 250 nM ionomycin i fravær og nærvær af 300 nM CsA. Signifikante forskelle (p <0,001) er vist med stjerner. n er det totale antal forsøg. Data er fra celler isoleret fra 3 mus. (D) Cell diametre af hvilende og aktiverede T-celler (250 ng / ml PMA og 250 nM ionomycin) 12 timer efter aktivering i fravær og nærvær af 300 nM CsA. pload / 55.212 / 55212fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 3: Effekter af CsA, FK506, FTY720, rapamycin, og TRAM-34 om cellestørrelse. (A og C) Gennemsnitlige diametre på hvilende og PMA / ionomycin-aktiverede murine T-celler i fravær og nærvær af narkotika. Koncentrationer er vist i kassen. (B) data fra en udtrykt som procent forøgelse af hvilende T-cellediameter. Lymfocytaktivering blev udført med 250 ng / ml PMA og 250 nM ionomycin, og målingerne blev taget efter 48 timer. (D) Celletalsmåler målinger af hvilende og anti-CD3 / CD28-aktiverede T-celler, 72 timer efter aktivering i fravær og nærvær af 300 nM CsA.rge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 4: blastogenese i humane PBMC'er upon mitogen stimulation. (A) Sorte søjler angiver hvile og røde søjler angiver aktiverede PBMC'er. (B) Mean diameter hvilende og aktiverede PBMC'er i fravær og tilstedeværelse af 300 nM CsA. Celler blev aktiveret med 250 ng / ml PMA og 250 nM ionomycin, og målingerne blev taget efter 48 timers aktivering. Klik her for at se en større version af dette tal. kolonne1 Resting Aktiveret CsA 100 nM CsA 200 nM gennemsnitlig diameter 6,94 um 9,78 um 8.19 um 7,92 um Gennemsnitlig stigning i diameter 40,92% 17.88% 14.09% Gennemsnitlig Surface Area 151.37 μm² 300.61 μm² 210.56 μm² 197.22 μm² Gennemsnitlig stigning i Surface Area 98,59% 39.00% 30,16%
Discussion
Her beskriver vi en teknik til hurtig påvisning og kvantificering af T-celle blastogen transformation under anvendelse af en automatiseret celletæller. Under vores betingelser (250 ng / ml PMA og 250 nM ionomycin stimulation) blev cellen overfladeareal forøges to gange, og volumenet tre gange efter 48 timers aktivering. Assayet er tilstrækkelig følsom til at påvise sprængning i de første 12 timer af aktivering, hvor cellen steg kun 1,25 gange sammenlignet med hvilende (figur 2D). En mere fysiologisk relevant mekanisme T-celle-aktivering ved anvendelse af anti-CD3 og anti-CD28 antistof-coatede magnetiske perler frembragte en signifikant blastogen respons, med en gennemsnitlig 2,3 gange stigning i volumen (72 timer efter aktivering, figur 3D). Humane mononukleære celler viste en 2,6 gange ændring i volumen på PMA / ionomycin stimulation i 48 timer (figur 4). ICR mus milt-T-celle gennemsnitlige diameter og volumen blev bestemt til at være6.9 um og 1,9 x 10 -4 nl hhv. Humane PBMC'er (fra en rask donor) havde en gennemsnitlig diameter på 7,7 um og en gennemsnitlig volumen på 2,7 x 10 -4 nl. Ved anvendelse af denne protokol, vi også testet stigende koncentrationer af PMA for deres evne til at aktivere T-celler. Disse encellede resultaterne var i overensstemmelse med proliferationsassays udføres på lignende PMA-koncentrationer.
Adskillige forbindelser er rapporteret at påvirke celleproliferation blev testet: FTY720 31,32; den immunosuppressive cyclosporin A, FK506, rapamycin og 27,28; og TRAM-34, en blokker af calcium-aktiverede KCa3.1 kanaler 33,35. Vi fandt, at ved de testede koncentrationer, de mest potente hæmmere af blastogenese var CsA og FK506. Rapamycin havde en mindre, men statistisk signifikant undertrykkende virkning på blastogenese. TRAM-34, på den anden side, påvirkede ikke blastogenesereaktion.
CsA undertrykt både blastogenese og proliferation, men ikke fuldstændigt (figur 2B og 2C), hvilket viser, at automatiseret celletæller måling er en god korrelat af lægemiddel effektivitet i T-celle-proliferation. I nærvær af rapamycin sammen med CsA, blastogenese var fuldstændigt inhiberet, hvilket antyder, at NFAT- og mTOR-medierede veje i kombination fuldt ud kan redegøre for T-celle-udvidelsen ved mitogenisk stimulering med PMA / ionomycin (figur 3C).
Dynamikområde nogle proliferationsassays er begrænset (se figur 2). Proliferationsassays, såsom den, vi har brugt (figur 2C), rapporterer et signal, der indeholder bidrag fra apoptotiske og nekrotiske celler. Automatiserede ændre diameter målinger ikke har denne begrænsning, da målingerne vedrører kun levedygtige celler. Cellelevedygtighed vurderes ved udelukkelse af trypanblåt-plet fra sunde og levedygtige celler. I størrelse målinger, anvendelse af fremadrettetlysspredning i flowcytometri diskrimination dublet celle kan være problematisk 22. I de automatiserede celle counter målinger blev der ikke dublet population fundet (Figur 1). , Målingen var også tilstrækkelig præcis til at skelne mellem virkningerne af 100 og 200 nM cyclosporin (tabel 1) og at opdage blastogenese inden 12 timer af mitogen stimulation (figur 2D).
Denne nye assay er særlig nyttigt for små antal prøver. Op til 15 prøver kan måles i 1 time. Men analysen har sine begrænsninger, hvoraf de fleste kan mindskes. Selvom den effektivt kan løse små (<1 um) forskel i cellediameter, maskinmodellen vi bruges har en lavere detektionsgrænsen på 5 um. Denne grænse kan medføre overvurdering af meget små cellestørrelser, da det effektivt udelukker alle celler med mindre diametre. Men nyere modeller af cellen tælleren har påvisning tærskeårige på ~ 2 um, som bør afhjælpe dette problem. Hvis der er for meget snavs i prøven, instrumentet behandler dem som levedygtige celler. Derudover kan luftbobler lejlighedsvis komme ind i flow-celle og fremkalde cellen billeder taget af maskinen. Den forvrængning synes ikke at påvirke levedygtigheden beslutsomhed, men det kan påvirke de målte diametre. Derfor anbefales det, at alle billeder kontrolleres af forsøgslederen for luftbobler, før data fra hvert forsøg accepteres til analyse. Da softwaren kun trækker cirkler omkring cellerne, kan diametrene af ikke-sfæriske celler være skæv hen imod den lange akse, hvilket gør assayet mindre egnet til ikke-sfæriske celler.
Dette assay er hurtig, idet ca. 4 min per prøve, sammenlignet med proliferationsassays, som kræver et par timer. Dataindsamlingen er også ret simpelt ved hjælp af softwaren, der følger med enheden. Softwaren kan eksportere måledata til en spreadsheet til analyse. Endelig er det en enkelt celle, i modsætning til en population, måling; både blastogenese og proliferation måles; og det skelner mellem levedygtige og døde celler samtidigt. Det kan bruges til at evaluere forskellige musestammer for deres evne til at opbygge et immunrespons. Assayet kan også anvendes med succes til måling af blastogenese i T-celler fra humane donorer (figur 4), og det kan også anvendes i andre celletyper.
Cell volumen stiger er kendt for at bidrage til reguleringen af stofskiftet: celle hævelse stimulerer glutamin-induceret glykogen syntese og lipogenese i hepatocytter 36,37. Neutrofiler vise migration-associerede volumen stigninger på 35-60%, mens kemotaktiske midler fremkalde 10-15% hævelse 38-40. Den nuværende assay kan potentielt anvendes til at studere disse processer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
| 40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
| 50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
| 6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
| Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
| FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
| Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
| TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
| FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100x stock |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10x stock |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
| 8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
| 6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
| Single magnetic separation stand for 1.5 - 2 ml tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
| Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
| Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |
References
- Weiss, A., Samelson, L. E. T-lymphocyte activation. Fundamental Immunology. Paul, W. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. Fifth ed 321-364 (2003).
- Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV). Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).
- Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator. J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).
- Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes. J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).
- Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages. J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).
- Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity. Blood. 57 (5), 894-899 (1981).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA. Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle. J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).
- Teague, T. K., et al. Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).
- Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells. Science. 325 (5937), 167-171 (2009).
- Messele, T., et al. Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).
- Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA. J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).
- Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).
- Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 37 (3), 406, 408 410-412 (2004).
- Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin. J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).
- Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).
- Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications. Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging. Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).
- Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination. Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).
- Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes. Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Trickett, A., Kwan, Y. L. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).
- Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence. J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).
- Sigal, N. H., Dumont, F. J. Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction. Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).
- Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).
- Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition. PLoS One. 10 (4), e0121710 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns. Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).
- Mandala, S., et al. Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists. Science. 296 (5566), 346-349 (2002).
- Qin, X., et al. Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels. Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).
- Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications. Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).
- Petho, Z., et al. The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation. Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).
- Wulff, H., et al. Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).
- Lang, F., et al. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).
- Hue, L. Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume. Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).
- O'Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents. J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).
- Hsu, L. S., Becker, E. L. Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B. Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).
- Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro. Am J Physiol. 267, 6 Pt 1 C1623-C1632 (1994).
