Abstract
Lymfocyttproliferasjon som svar på antigen eller mitogen stimulering er en lett målbar fenomen nyttig for testing av immunmodulerende (dvs. immunosuppressiv eller immunstimulerende) kjemiske forbindelser og biologiske. En av de tidligste trinnene under mitogenesis er cellen utvidelse eller blastogenic transformasjon, hvorpå cellevolumøkninger før divisjon. Det er vanligvis påvises i de første timene av T-lymfocytt stimulering. Her beskriver vi en rask metode for å kvantifisere blastogenese i T-lymfocytter isolert fra mus milt og humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) ved hjelp av en automatisert celleteller. Ulike brukte spredningsanalyser for det meste er arbeidskrevende og bare reflekterer den generelle befolkningen effekt snarere enn individuelle cellulære effekter i en befolkning. I kontrast, gir det fremlagte automatisert celleteller analysen rask, direkte og presise målinger av cellediameter som kan væreanvendt for å vurdere effektiviteten av forskjellige mitogener og immunmodulerende midler in vitro.
Introduction
T-lymfocytter er de primære celler er ansvarlige for adaptiv immunitet i pattedyr. Det er kjent at de reagerer på spesifikke antigene peptider presentert av MHC-molekyler på overflaten av antigen-presenterende celler. Ved aktivering av en beslektet T-celle-reseptor (TCR), forstørrer celle i en prosess kalt blastogenic transformasjon, eller blastogenese. Denne prosessen er detekterbar i den første ~ 6 timer etter at stimulus er påført en. Under blastogenese, volumene av de enkelte T-celler øke 2- til 4-ganger 2-6. Lymfocytter begynner å spre seg i en prosess som kalles klonal ekspansjon, som har til formål å generere så mange kloner av de antigen-spesifikke TCR-bærende celler som mulig. Avkommet Cellene da utøve sin immunologiske funksjon ved å differensiere til cytotoksisk (CD8 +) eller hjelper (CD4 +) effektor T-lymfocytter. Således naive T-lymfocytter i human eller mus blod er i G 0 (hvile)-fasen av cellesyklus og støtte minimal metabolsk aktivitet. Ved eksponering for antigener eller mitogener, T-celler oppgi cellesyklus, med en ledsagende stimulering av transkripsjon og proteinsyntese 7-10. Mitogener, såsom forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) og ionomycin stimulere lymfocyttene gjennom aktivering av proteinkinase C (PKC) og Ca 2 + -avhengige signalveier 1. Aktiveringen av T-celler med PMA / ionomycin styrer TCR-signaliseringstrinn.
In vitro proliferasjon analyser er mye brukt for det formål å evaluere lymfocytt-funksjon og respons på stimuli. Spredningsmålinger blir vanligvis tatt en til tre dager etter starten av T-cellestimulering og reflektere den kollektive tilstand av hundrevis eller tusenvis av celler. Styrken av forskjellige mitogener og immunmodulerende medikamenter in vitro kan evalueres ved ganske enkelt å måle sprednings priser i nærvær av disse forbindelser. Noen av disse enssays og deres begrensninger er omtalt nedenfor.
For direkte celle nummer telling, er fremgangsmåten tidkrevende, med en høy sannsynlighet for operatørfeil.
For DNA-syntese, måler 3H-tymidin inkorporering analyse DNA-syntese, men dens viktigste begrensningen er dens radiotoksisitet. En ikke-radioaktiv alternativ er BrdU, men omfanget av lineær respons for cellevekst er begrenset, og antistoff-behandling er nødvendig, noe som øker det antall trinn i prosedyren 11,12.
For metabolske aktivitet, tetrazoliumsalter (MTT, MTS, XTT, og WST-1) og resazurin fargestoffbaserte kolorimetriske assays rapportere den generelle metabolske tilstand av delende cellepopulasjoner. Imidlertid er MTT ikke er løselig i dyrkningsmediet, noe som krever ytterligere vasketrinn, således som omfatter feil i målingen; XTT trenger tilleggskomponenter for å redusere effektivt; MTS-, WST-1, og Resazurin baserte målinger er påvirkeed av kulturmediet pH-verdi og dens komponenter serum albumin eller fenolrødt 13-16. Disse analyser måler ikke den faktiske antallet levedyktige celler, men snarere anslå de kombinerte enzymaktiviteter. Derfor formeringshastigheten kan ikke bestemmes nøyaktig ved metabolske analyser på grunn av ikke-lineær korrelasjon mellom cellenummer og fargestoff reduksjon 12,17.
For måling av ATP konsentrasjon, T-celle aktivering-indusert økning i ATP korrelerer med spredning. Imidlertid heving av intracellulær ATP er en av den første delen av T-celleaktivering; mange skritt bak er selve spredning 17,18.
For fargestoff fortynning analysen, flekker CFSE fluorescerende fargestoff celler ved kovalent binding til intracellulære proteiner. Fargestoffet viser en spredning avhengig reduksjon i fluoriserende intensitet, noe som kan spore antall celledelinger. Men på grunn av kovalente protein merking, funksjoner av disseproteiner kan bli kompromittert. Fargestoffet er toksisk for cellene ved høyere konsentrasjoner. Ved lavere fargestoffkonsentrasjoner, er imidlertid den første fluorescensintensitet redusert, redusere antall celledelinger som kan spores. I tillegg, etter merking med CFSE, er det en spredning uavhengig ~ 50% tap av opprinnelig fluorescens i løpet av den første 24 til 48 timers periode, noe som begrenser det dynamiske området for denne analysen 19,20.
De fleste av disse analyser reflektere den kollektive tilstand av et stort antall celler og krever behandling av cellene med fluorescente fargestoffer. Nekrotiske og apoptotiske celler kan også bidra til disse målingene, med mindre de er fjernet fra analysen ved farging med kjemikalier eller antistoffer.
Lymfocytt blastogenese kan evalueres ved en rekke metoder, slik som optisk mikroskopi eller flowcytometri 4,21,22. Her beskriver vi en hurtig metode for måling av T-cellestørrelser ved hjelp av enn automatisert celleteller, som samler sanntidscelle bilder som er lagret og kan bli re-analysert på et senere tidspunkt. I tillegg til størrelsesmålinger, gir denne anordning presise celle tall og den prosentandel av levedyktige celler, som bestemt ved trypan blå eksklusjon flekk. Anordningen som brukes i denne protokollen er kommersielt tilgjengelig, og produsenten testet presisjonen av instrumentet ved hjelp av tre forskjellige instrumenter og flere konsentrasjons- og levedyktighet kontroller. Resultatene fra disse studiene viser en koeffisient av avviket som var generelt under 6%. Som nevnt i protokollen, enheten kalibreres med jevne mellomrom med 6 mikrometer og 8 mikrometer diameter polystyren perler. Fordelene med å bruke en celleteller for å skille mellom hvilende T-celler og T-lymfoblaster basert på cellediameteren er brukervennlighet og den automatiserte arten av analysen. Programvaren er i stand til å tegne en sirkel rundt hver celle og beregning av cellediameteren. I tillegg er imaldre er synlige for brukeren, som kan kontrollere riktigheten av instrumentet til å identifisere de celler, og på riktig måte å tegne en sirkel rundt dem. Når det gjelder begrensninger, kan instrumentet ikke per se skille mellom avfall og celler; Derfor er det viktig at operatøren ser hvert bilde som det blir behandlet. Det er mulighet for å innlemme luftbobler, noe som vil redusere antallet av brukbare felt for analyse; Dette er imidlertid sjelden hvis det vanlige spyle det utføres vedlikehold.
I denne studien ble grupper av milt-T-lymfocytter stimulert med ionomycin og økende konsentrasjoner av PMA til 12-48 timer. konsentrasjoner så lave som 2 ng / ml indusert både en robust blastogenic svar og betydelig spredning PMA. Målinger av effekten av flere legemidler, slik som immundempende ciklosporin A (CsA), FK506 (tacrolimus), og rapamycin (sirolimus), samt ion kanalblokkere TRAM-34 og FTY720 (fingolimod), på blastogenese viste god overensstemmelse med rapporterte effekter på proliferasjon. Den blastogenic respons av humane PBMC til PMA / ionomycin og murin T-celle stimulering med anti-CD3 og anti-CD28 antistoff-belagte magnetiske kuler ble også målt.
Den celleteller assay kvantifiserer både blastogenese og formeringshastigheten (celletetthet) samtidig, men hver for seg, i motsetning til de ovenfor nevnte fremgangsmåter, som ser ved en kombinasjon av disse effekter. Den presenterte protokollen gir en hurtig og robust teknikk for å vurdere styrken av mitogene og immunmodulerende midler.
Protocol
Alle forsøk er utført i henhold til protokoller godkjent av Wright statsuniversitet Lab Animal Care og bruk Committee and Institutional Review Board.
MERK: Menneske PBMC blir isolert ved Ficoll-tetthetsgradient-sentrifugering metode 5.
1. Spleen Harvest-
- Hus voksen hunn ICR mus i standard laboratorieforhold med mat, vann og sengetøy krav som er spesifikke for arten.
MERK: Dyr hadde en gjennomsnittsalder på 2,9 år og en gjennomsnittlig vekt på 30,4 g på tidspunktet for aktiv dødshjelp. - På datoen for isolasjon (DOI), avlive dyrene enkeltvis uten andre conspecific dyr til stede. Gjør alle anstrengelser for å sikre minimal stress til musen. Avlive ved hjelp av CO 2 med sekundær halshugging for å sikre død.
- Plasser dyret, fremdeles inne overføringen buret, inn i CO 2 kammeret og start gasstrømmen ved 5 l / min. Denne strømningshastighet fortrenger oksygen ved den anbefalte 10-30% per min.
- Etter at dyret er bevisstløs, øke CO to strømningshastigheten til 15 l / min. Sjekk dyret for opphør av pust og la i kammeret for ytterligere 2 min.
- Påfør halshugging med distraksjon makt for å sikre død.
- Høste milten fra dyret ved bruk av aseptisk teknikk innen 10 min død.
- Steriliser to sett med sakser og pinsetter for fjerning av milten i en autoklav ovn før bruk. Steril disseksjon overflate ved å påføre 70% etanol.
- Anvende 70% etanol til musen magen. Ved hjelp av ett sett med saks og pinsett, lage et kutt i pels og hud fra venstre side av magen, deretter trekke fra hverandre og skrelle tilbake huden for å avsløre bukhinnen. Når utsatt, bruke 4% klorhexidin oppløsning før du åpner bukhinnen.
- Ved hjelp av det andre settet av scissors og pinsetter, gjør en 2- til 3-cm snitt langs den sentrale del av magen. Åpne peritoneum og fjerne milten ved å skjære bort viscerale vedlegg og overflødig fett. Plasser milten i Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS).
2. Utarbeidelse av Raw Splenocytter
MERK: Utfør alle trinnene under en laminær biosikkerhet skapet ved hjelp av aseptisk teknikk.
- Bløt de høstede miltene i 10 ml avionisert sterilt H2O i 5 minutter i en 10 cm kulturskål for å lysere erytrocytter overflaten.
MERK: Dette trinnet kan utelates dersom milten ble skadet under isolasjon. - For å løsne splenocytes, knuse milten mellom to steriliserte glass lysbilder (frostet siden som vender mot milt) over en frisk 10 cm kultur parabolen. Bland med 10 ml RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 50 IU / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin (nedenfor referert til ens full RPMI).
- Filter cellene gjennom et sterilt 40 mikrometer nylon celle sil inn i en ny 10 cm kultur parabolen å fjerne bindevev og rusk.
- Lyse de resterende erytrocytter ved tilsetning av 20 ml av RBC lysis buffer bestående av 155 mM NH4CI, 10 mM NaHCO 3, og 0,1 mM EDTA ved pH 7,4 og ~ 300 mOsm / l.
MERK: Osmolalitet er målt ved et frysepunkt eller et damptrykk osmometer.- Overfør cellene fra 10 cm plate til et 50 ml konisk rør og sentrifuger ved 250 xg i 10 minutter (4 ° C).
- Fjern supernatanten, tilsett 20 ml av RBC lysis buffer, og re-suspendere de pelleterte celler ved pipettering.
- Inkuber ved romtemperatur i lysis buffer i 10 min med forsiktig vugging.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 250 xg (4 ° C) for å pelletere cellene. Hell av lyseringsbuffer.
- Re-suspendere celler i 10 ml komplett RPMI og sentrifuger på nytt (250 xg, 10 min, 4 ° C). Plateard supernatanten.
- Re-suspen splenocyttene i 2 ml RPMI komplett oppvarmet til 37 ° C for overføring til en nylon ullfiberen kolonne.
3. Rensing av T-lymfocytter
- Vask nylon ull kolonnene to ganger med 5 ml komplett RPMI. Inkuber ved 37 ° C i en 5% CO 2 cellekulturinkubator i 1 time.
Merk: Det er viktig å holde nylon ull våt for varigheten av eksperimentet og for å bruke RPMI fullstendig oppvarmet til 37 ° C for alle nylon ull isoleringstrinn. - Legg isolerte splenocytter til kolonnen og inkuberes i en time for å la B-celler, fibroblaster, og celler til å følge nylon ull.
- Tilsett 2 ml RPMI inneholdende de splenocytter inn i kolonnen og passere gjennom inntil toppen av nylon ull er nådd.
- Tilsett 2 ml RPMI komplett oppvarmet til 37 ° C på toppen av nylon ull og passerer mediet gjennom ullinntil væskenivået når den øvre overflate.
- Tilsett 3 ml varm komplett RPMI til kolonnen for å fullstendig dekke nylon ull.
- Inkuber den fylte kolonne uforstyrret i en 37 ° C, 5% CO2 cellekulturinkubator i 1 time.
- Eluere cellene ved vasking av kolonnen to ganger med 5 ml komplett RPMI. Utføre en ytterligere vask av de eluerte cellene ved sentrifugering.
- Fyller kolonnen til toppen 2 ganger med komplett RPMI og la løsningen i kolonnen for å strømme gjennom inn i en 50 ml steril konisk rør.
MERK: Unngå å trykke eller bumping kolonnen, som kan løsne B-celler, hjelpeceller og fibroblaster ånd av nylon ull. - Samle gjennomstrømningsfraksjon og sentrifugering ved 250 xg i 10 minutter (4 ° C) for å pelletere cellene. Vask en gang med 10 ml komplett RPMI. Pellet cellene på nytt (250 xg, 10 min, 4 ° C) og re-suspen i 2 ml RPMI komplett.
- Mål c ell tetthet ved hjelp av en hemocytometer og fortynnet i fullstendig RPMI til 0,5 x 10 6 celler / ml.
- Seed 1 eller 2 ml porsjoner av celler til hver brønn i en 24- eller 6-brønners cellekulturplate, henholdsvis, og kulturen av cellene ved 37 ° C med 5% CO2.
MERK: 1 mM 1,4-ditiotreitol (DTT) tilsettes til hver brønn på dette stadiet for å øke T-celle-overlevelse. - Valgfritt Bekreft effektiviteten av isolasjonsprotokoll ved strømningscytometri. Denne protokollen normalt gir ~ 80% T-lymfocytter 23.
MERK: Nylon ull-renset cellene inneholder ca 50% CD4 + og 23% CD8 + celler. For å rense CD4 + og CD8 + subpopulasjoner ytterligere, kan en enkelt immunomagnetisk utarming trinn utføres ved hjelp av åtte antistoffer og magnetiske kuler 24. Alternativt kan renere CD4 + og CD8 + T-cellepopulasjoner bli isolert ved positiv eller negativ seleksjon med spesifikke antistoffer.
- Fyller kolonnen til toppen 2 ganger med komplett RPMI og la løsningen i kolonnen for å strømme gjennom inn i en 50 ml steril konisk rør.
- Aktivere T-lymfocytter i løpet av 24 timer av isolering ved tilsetning av PMA og ionomycin kalsiumsalt eller magnetiske kuler belagt med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer 23,25,26. Legg eksperimentelle medikamenter (f.eks CsA, FK506, rapamycin, TRAM-34, og FTY720) på tidspunktet for aktivering.
MERK: Her PMA konsentrasjoner varierte fra 2 til 250 ng / ml, og ionomycin konsentrasjonen ble holdt på 250 nM. Om mulig bør fortynninger fremstilles fra lager alikvoter av hvert legemiddel, slik at volumet tilsatt til hver brønn av celler er ≥1 mL å sikre reproduserbarhet. Den anti-CD3 / anti-CD28-belagte magnetiske kuler blir tilsatt i en 1: 1 perle-til-celle-forhold. Økende antall perler per celle (dvs. den perle-til-celle-forhold) vil øke intensiteten av stimulering 25,26. Kulene ble vasket og resuspendert i fullstendig RPMI før deres tilsetning til cellene. Merk at trypanblå flekker perlene. - Culture cellene i 12-72 timer ved 37 ° C med 5% CO2 før analysering med den automatiserte celleteller.
5. Automatisert celleteller datainnsamling
- Før du kjører prøven, sørg for at cellene er forsiktig blandet med en serologisk pipette for å unngå klumper. Dette er spesielt viktig for aktiverte lymfocytter på grunn av deres økte klebrighet.
- For kulturer som er aktivert med anti-CD3 / CD28-perler, etter pipettering, overføre prøven til et 1,5 ml eller 2 ml sentrifugerør. Separere perlene ved å holde røret på en magnet i 1-2 min. Bruk supernatanten inneholdende cellene for analyse.
MERK: Analyser både hvilende og aktiverte celler i løpet av en time for å registrere eventuell pre-aktivering av hvilende celler av serum til stede i dyrkningsmediet. Etter 12 timer fra PMA / ionomycin stimulering, en liten økning i cellestørrelse var påvisbar (figur 2
- For kulturer som er aktivert med anti-CD3 / CD28-perler, etter pipettering, overføre prøven til et 1,5 ml eller 2 ml sentrifugerør. Separere perlene ved å holde røret på en magnet i 1-2 min. Bruk supernatanten inneholdende cellene for analyse.
- Overføre 1 ml av cellesuspensjonen inn i en prøvekopp og kjøre det gjennom automatisert celleteller i henhold til instruksjonene i håndboken.
MERK: For hver av studiene, bør brukes minst 1 ml (maksimalt 2 ml) av cellekultur. Den automatiserte celleteller benytter en sprøyte for å blande trypanblått med cellesuspensjonen og passerer celle-trypanblått blandingen i løpet av et felt som er avbildet og analysert av programvaren. Programvaren oppdager trypanblått-farget celler, tegner en sirkel rundt hver celle, og bestemmer diameter. 100 bildene blir samlet inn fra hver prøve, og celleviabilitet og størrelser bestemmes. Den deteksjonsterskel for celleteller som er brukt her har en nedre grense på 5 um. - Overfør data fra hver kjøre til et regneark for videre analyse.
- Kalibrer enheten på en jevnlig basis med en 1ml prøve av 6 um og 8 um diameter polystyrenperler.
MERK: bør brukes Selve perlestørrelser målt av produsenten for hvert parti, ikke den nominelle størrelse. 6 og 8 um perler er praktisk fordi disse diametre er nær de forventede diameter på hvilende og aktiverte T-celler (se figur 1).
6. data og statistisk analyse
- Analysere dataene ved hjelp av egnet statistisk og grafer programvare.
MERK: arket for hvert forsøk inneholder det antall celler med hver diameter (område: 5 um til 70 um). Cellene over en 17 um diameter, fjernes fra analysen for å utelukke støv og små bobler, som kan leses som levedyktige celler ved hjelp av instrumentet. - Utføre hypotesetesting ved hjelp av Welch t-test for datasett med ulik varians; Resultatene er ansett statistisk signifikant når p <0,001. Formelen som brukes var,
hvor
og 
er utvalgsgjennomsnitt, 
og 
er utvalgsavvik, og 
og 
er utvalgsstørrelser for hvert datasett. Antall frihetsgrader er konservativt estimert med minste av de to utvalgsstørrelser for hver sammenligning. Stolpediagrammene er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
og 
er utvalgsgjennomsnitt, 
og 
er utvalgsavvik, og 
og 
er utvalgsstørrelser for hvert datasett. Antall frihetsgrader er konservativt estimert med minste av de to utvalgsstørrelser for hver sammenligning. Stolpediagrammene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. 7. milt T-lymfocytter Proliferation Assay
- Måle T-celleproliferasjon ved hjelp av en MTS- eller MTT-baserte koloplateleser proliferasjonsanalyse.
MERK: Analysen er basend på MTS tetrazoliumforbindelsen (Owen reagens) reduksjon til løselig formazan produkt, trolig av NADPH eller NADH produsert i metabolsk aktive celler ved dehydrogenase enzymer. - Telle rensede T-celler med et hemocytometer og re-suspendere dem i fullstendig RPMI-1640 ved en endelig tetthet på 1 x 10 6 celler / ml.
MERK: 1 mM DTT kan tilsettes til cellene på dette stadiet. - Aktivere cellene med PMA og ionomycin sammen med test-legemidler, hvis nødvendig, og bland forsiktig (tilsvarende trinn 4).
- Plate 100 ul ble cellene i hver brønn av en 96-brønn cellekultur behandlet plate og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 48 timer. Tilsett 100 ul RPMI-1640 medium uten celler inn i en brønn for å oppnå en avlesning av bakgrunnen absorbans.
- Tilsett 20 ul av MTS-basert reagens til hver brønn og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 i 4 timer.
- Ta absorbansmålinger ved 490 nm med en plateleser. A-enbsorbance målinger tilsvarer antallet av metabolsk aktive celler i hver brønn.
MERK: Trekk fra bakgrunnsnivå hvis nødvendig. Bakgrunns absorbansverdiene avhenge av typen av kulturmedium, serum, utvendig pH og varigheten av MTS-reagens eksponering for lys. MTS-baserte reagenser er følsom for lys, og eksponering for lys i flere timer kan føre til høyere bakgrunns absorbans verdier.
Representative Results
Vi brukte denne analysen for å sammenligne lymfocytt blåsedannelse under stimulering med PMA, en forbolester, og ionomycin, en kalsiumionofor. Figur 1A viser frekvensfordelingen av diametre på hvilende og farmakologisk aktiverte milt T-celler. Behandling av celler med PMA / ionomycin for ~ 2 dager, resulterte i en betydelig endring i median av fordelingen mot større diameter (se for eksempel referanse 4). Antall celler med mindre diameter er tilsvarende redusert. For å forsikre seg om at vår enhet rapporteres de korrekte diameter, utførte vi to kalibreringer med polystyrenkuler av 6 pm og 8 pm diameter (se Materialer tabell). Figurene 1B og 1C viser avlesninger fra aktiverte T-celler, overlagret med en 8 um standard og hvilende T-celler, overlagret med en 6 um standard. Figur1D viser kontroll perlestørrelser rapportert av produsenten plottet mot median diameter målt med vår automatisert celleteller. Det viste seg at 6 um størrelsen var litt overvurdert i våre målinger, sannsynligvis på grunn av målegrensen til instrumentet som har en nedre grense på 5 um. Imidlertid standardavviket av vulsten diametre beregnet fra celleteller målingene var i overensstemmelse med standardavviket rapportert av produsenten. Vi konkluderer ut fra disse eksperimentene at denne enheten kan brukes på en pålitelig måte å sammenligne hvile og mitogenstimulerte mus T-cellestørrelser og at enheten kan nøyaktig måle den faktiske celle diameter.
Vi fortsatte deretter å teste avhengighet av den midlere økning diameter på PMA-konsentrasjon og funnet at ved en fast ionomycin konsentrasjon på 250 nM, PMA effekten ble ikke vesentlig endret ved å heve dets konsentrasjon from 2 til 250 ng / ml (figur 2A). Ved bruk av MTS-baserte assay, målte vi T-celle-proliferasjon ved 50 og 250 ng / ml PMA og fant ingen merkbar forskjell (figur 2C), i overensstemmelse med våre cellediameter data. Den kalsineurinhemmer narkotika ciklosporin A (300 nM) og FK506 (1 nM) trykkes både blastogenese (figur 2B) og spredning (figur 2C). Inhibering ble ikke fullført i begge tilfeller, men. Målinger utført 12 timer etter PMA / ionomycin tillegg viste et 7,2% og 6,8% økning i diameteren for 50 ng / ml og 250 ng / ml PMA, henholdsvis (figur 2D). Størrelse øker ved disse to konsentrasjoner var ikke signifikant forskjellig, slik tilfellet var for 48 timers stimulering (sammenlign figur 2A).
data cellediameter innsamlet fra hvilende og aktiverte T-celler etter 48 timer fra PMA / ionomycin stimulering er oppsummert i
Vi har også testet andre kjemiske forbindelser som er rapportert å være immunsuppressive: CSA, FK506, rapamycin, FTY720 og TRAM-34. I figur 3, cellestørrelsesmålinger oppnådd i hvilende og aktiverte T-celler i fravær og nærvær av disse stoffene er vist. CsA og FK506, som målrette kalsineurin-avhengige nukleær faktor av aktiverte T-celler (NFAT) 27,28, var den mest potente, hemme blastogenic respons med nesten 72% (figur 3A og 3B). Interessant, medøkte konsentrasjoner PMA, styrken av CsA og FK-506 falt noe, selv om det ikke var noen ytterligere økning cellediameter i fravær av disse legemidler (figur 2A og 2B). Rapamycin, et immunsuppressiv som hemmer mammalian target of rapamycin (mTOR) 29,30, hadde en moderat, men statistisk signifikant effekt (figur 3A, 3B og 3C). FTY720 er en sfingosin 1-fosfat-reseptor agonist som hemmer lymfocytt utgang i sirkulasjon 31 og ble nylig funnet å hemme TRPM7, et kation kanal sterkt uttrykt i T-lymfocytter 32. Både FTY720 og rapamycin hadde en sammenlignbar effekt på blastogenese, noe som reduserer den fra gjennomsnittet av en 52% økning i diameter til omtrent 34% (figur 3A og 3B). TRAM-34 er en blokkering av kalsium-aktiverte kalium kanal KCa3.1 33. Testet på 700 nM, TRAM-34 var ineffektive i murine T-celler, jegn samsvar med en fersk human T-celleproliferasjon studie; dets styrke kan avhenge av arten og styrken til mitogen stimulering 34 (figur 3A og 3B). 700 nM TRAM-34 var effektive i blokkering KCa3.1 kanaler i våre patch clamp elektrofysiologi eksperimenter (data ikke vist). Denne sammenligningen ble gjort mellom hvile og narkotika utsatt celler i flere studier innen samme eksperiment på 48 timer. Når rapamycin og CsA ble brukt sammen, blastogenese ble fullstendig hemmet (Figur 3C).
Aktivering av murine T-celler med anti-CD3 / anti-CD28-belagte magnetiske kuler i 72 timer ga en 27% økning i den gjennomsnittlige diameter, som ble redusert til 5%, i nærvær av CsA (figur 3D). Humane mononukleære celler ved PMA / ionomycin-aktivering i 48 timer øket i diameter med 33%, og aktivering i nærvær av CsA reduserte responsen til 23% ( innen-page = "1"> Tabell 1: Sammenfatning av midlere cellediameter og relative økning i overflateareal. Målinger ble utført 48 timer etter aktivering med 250 ng / ml PMA og 250 nM ionomycin. 
Figur 1: Frekvens distribusjoner av murine milt T-celle diameter. (A) Svarte søyler indikerer hvile og røde søyler indikerer PMA / ionomycin-aktiverte (48 timer) celler. (B) Utdeling av aktiverte milt-T-celler oppå en 8 mikrometer partikkelstørrelse kalibreringsstandard. (C) Fordelingen av hvilende T-celler, overlagret på en 6 um kalibreringsstandard. Antallet av celler og kuler som brukes er angitt i bokser. (D) Median diameteren målt ved celleteller plottet mot perlediameteren rapportert av produsenten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2: Avhengighet av murine T-celleaktivering på PMA-konsentrasjon. (A) Midlere diameter på T-celler, enten ubehandlet eller behandlet med 2, 50, og 250 ng / ml PMA i en fast konsentrasjon ionomycin (250 nM). (B) celleteller målinger av hvilende og aktiverte (2, 50, 250 ng / ml PMA) T-celler i fravær og nærvær av 300 nM CsA eller 1 nM FK506. (C) MTS proliferasjonsanalyse ved 50 og 250 ng / ml PMA med 250 nM ionomycin i fravær og nærvær av 300 nM CsA. Signifikante forskjeller (p <0,001), er angitt med asterisker. n er det totale antall forsøk. Dataene er fra celler isolert fra 3 mus. (D) Celle diametre på hvilende og aktiverte T-celler (250 ng / ml PMA og ionomycin 250 nM) 12 timer etter aktivering i fravær og nærvær av 300 nM CsA. pload / 55212 / 55212fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3: Effekter av CsA, FK506, FTY720, rapamycin, og TRAM-34 på celle størrelse. (A og C) Gjennomsnittlig diameter på hvile- og PMA / ionomycin-aktiverte murine T-celler i fravær og nærvær av narkotika. Konsentrasjoner vises i boksen. (B) av data fra A uttrykt som prosent økning i forhold til hvilende T-cellediameteren. Lymfocyttaktivering ble utført med 250 ng / ml PMA og ionomycin 250 nM, og målinger ble tatt etter 48 timer. (D) celleteller målinger av hvilende og anti-CD3 / CD28-aktiverte T-celler, 72 timer etter aktivering i fravær og nærvær av 300 nM CsA.rge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 4: blastogenese i humane PBMC ved mitogen stimulering. (A) Svarte søyler indikerer hvile og røde søyler viser aktiverte PBMC. (B) Midlere diameter på hvilende og aktiverte PBMC i fravær og nærvær av 300 nM CsA. Cellene ble aktivert med 250 ng / ml PMA og ionomycin 250 nM, og målinger ble tatt etter 48 timer med aktivering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. COLUMN1 Resting aktivert CsA 100 nM CsA 200 nM Gjennomsnittlig Diameter 6,94 mikrometer 9,78 mikrometer 8,19 mikrometer 7,92 mikrometer Gjennomsnittlig økning i omkrets 40.92% 17.88% 14.09% Gjennomsnittlig Surface Area 151.37 μm² 300.61 μm² 210.56 μm² 197.22 μm² Gjennomsnittlig økning i Surface Area 98,59% 39.00% 30.16%
Discussion
Her beskriver vi en teknikk for rask påvisning og kvantifisering av T-celle blastogenic transformasjon ved hjelp av et automatisk celleteller. Under våre betingelser (250 ng / ml PMA og ionomycin 250 nM stimulering) ble celleoverflatearealet økes to ganger og volumet tre ganger etter 48 timer med aktivering. Analysen er tilstrekkelig følsom til å påvise sprengning i løpet av de første 12 timer av aktivering, hvor cellevolumet økte bare 1,25 ganger sammenlignet med hvilende (figur 2D). En mer fysiologisk relevant mekanismen for T-celleaktivering ved anvendelse av anti-CD3 og anti-CD28 antistoff-belagte magnetiske kuler ga en signifikant blastogenic reaksjon, med et gjennomsnitt 2,3 ganger økning i volum (72 timer etter aktivering, figur 3D). Humane mononukleære celler viste en 2,6-gangers volumendring ved PMA / ionomycin stimulering i 48 timer (figur 4). ICR mus milt T-celle gjennomsnittlig diameter og volum ble bestemt til å være6,9 um og 1,9 x 10 -4 nl, respektivt. Humane PBMC (fra en frisk donor) hadde en gjennomsnittlig diameter på 7,7 um og et gjennomsnittlig volum på 2,7 x 10 -4 nl. Ved hjelp av denne protokoll har vi også testet økende konsentrasjoner av PMA for deres evne til å aktivere T-celler. Disse encellede resultater var i overensstemmelse med proliferasjonsanalyser utført ved lignende konsentrasjoner PMA.
Flere forbindelser rapportert å påvirke celledeling ble testet: FTY720 31,32; den immunsuppressive cyklosporin A, FK506, og rapamycin 27,28; og TRAM-34, en blokkering av kalsiumaktiverte KCa3.1 kanaler 33,35. Vi har funnet at ved de testede konsentrasjoner, de mest potente inhibitorer av blastogenese ble CsA og FK-506. Rapamycin hadde en mindre, men statistisk signifikant hemmende effekt på blastogenese. TRAM-34, på den annen side, ikke påvirker blastogenese.
CsA trykt både blastogenese og proliferation, men ikke fullstendig (figur 2B og 2C), som viser at automatisk celleteller måling er en god korrelat av medikament effektivitet i T-celle-proliferasjon. I nærvær av rapamycin sammen med CsA, blastogenese ble fullstendig hemmet, noe som tyder på at NFAT- og mTOR-medierte baner i kombinasjon fullt ut kan stå for T-celle-utvidelse ved mitogen stimulering med PMA / ionomycin (figur 3C).
Det dynamiske området for noen proliferasjonsanalyser er begrenset (se figur 2). Proliferasjonsanalyser, slik som den vi har brukt (figur 2C), rapporterer et signal som inkluderer bidrag fra apoptotiske og nekrotiske celler. Automatiserte endrings diameter målinger har ikke den begrensningen, som målingene gjelder bare levedyktige celler. Celleviabilitet vurderes av utelukkelse av trypanblått flekk fra sunne, levedyktige celler. I størrelse målinger, ved terminlysspredning i flowcytometri dublett celle diskriminering kan være problema 22. I den automatiserte celleteller målinger, ble det ikke funnet dublett populasjonen (figur 1). Dessuten målingen var tilstrekkelig presis til å skjelne mellom effektene av 100 og 200 nM cyklosporin (tabell 1) og for å detektere blastogenese innen 12 timer fra mitogen stimulering (figur 2D).
Denne nye analysen er spesielt nyttig for et lite antall prøver. Opp til 15 prøver kan måles i en time. Imidlertid har analysen sine begrensninger, de fleste som kan reduseres. Selv om det kan effektivt løse små (<1 um) forskjell i cellediameter, maskinmodell brukte vi har en lavere deteksjonsgrense på 5 um. Denne grensen kan føre til overvurdering av meget små cellestørrelser, fordi den effektivt utelukker alle celler med mindre diametre. Men nyere modeller av celleteller ha deteksjon treskeåringer på ~ 2 mikrometer, som skal avhjelpe dette problemet. Dersom det er for mye smuss i prøven, behandler instrumentet dem som levedyktige celler. I tillegg kan luftbobler tidvis komme inn i flyten celle og forårsake forvrengning av celle bilder tatt av maskinen. Den forvrengning synes ikke å påvirke levedyktigheten bestemmelse, men det kan påvirke de målte diametere. Derfor anbefales det at alle bildene kontrolleres av eksperimentator for luftbobler før dataene fra hver studie er akseptert for analyse. Ettersom programvaren bare trekker sirkler rundt cellene, kan diametrene av ikke-sfæriske celler være skjevt mot lengdeaksen, slik at analysen mindre egnet for ikke-sfæriske celler.
Denne analysen er rask, tar ca 4 minutter per prøve, sammenlignet med proliferasjonsanalyser, som krever noen få timer. Datainnsamlingen er også ganske enkel å bruke programvaren som følger med enheten. Programvaren kan eksportere måledata til en spreadsheet for analyse. Endelig er det en enkelt-celle, i motsetning til en populasjon, måling; både blastogenese og spredning måles; og det skiller mellom levedyktige og døde celler samtidig. Den kan brukes til å evaluere forskjellige musestammer for deres evne til å montere en immunrespons. Målingen kan også brukes med hell for måling av blastogenese i T-celler fra humane donorer (figur 4), og det kan også brukes i andre celletyper.
Cell volumøkninger er kjent for å bidra til regulering av metabolismen: celle hevelse stimulerer glutamin-indusert glykogen syntese og lipogenese i hepatocytter 36,37. Nøytrofile vise migrasjonsrelatert økning på 35-60% volum, mens kjemotaktiske agenter tale 10-15% hevelse 38-40. Den nåværende analysen kan potensielt brukes til å studere disse prosessene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
| 40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
| 50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
| 6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
| Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
| FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
| Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
| TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
| FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100x stock |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10x stock |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
| 8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
| 6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
| Single magnetic separation stand for 1.5 - 2 ml tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
| Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
| Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |
References
- Weiss, A., Samelson, L. E. T-lymphocyte activation. Fundamental Immunology. Paul, W. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. Fifth ed 321-364 (2003).
- Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV). Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).
- Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator. J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).
- Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes. J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).
- Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages. J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).
- Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity. Blood. 57 (5), 894-899 (1981).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA. Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle. J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).
- Teague, T. K., et al. Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).
- Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells. Science. 325 (5937), 167-171 (2009).
- Messele, T., et al. Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).
- Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA. J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).
- Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).
- Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 37 (3), 406, 408 410-412 (2004).
- Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin. J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).
- Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).
- Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications. Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging. Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).
- Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination. Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).
- Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes. Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Trickett, A., Kwan, Y. L. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).
- Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence. J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).
- Sigal, N. H., Dumont, F. J. Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction. Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).
- Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).
- Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition. PLoS One. 10 (4), e0121710 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns. Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).
- Mandala, S., et al. Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists. Science. 296 (5566), 346-349 (2002).
- Qin, X., et al. Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels. Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).
- Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications. Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).
- Petho, Z., et al. The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation. Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).
- Wulff, H., et al. Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).
- Lang, F., et al. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).
- Hue, L. Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume. Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).
- O'Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents. J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).
- Hsu, L. S., Becker, E. L. Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B. Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).
- Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro. Am J Physiol. 267, 6 Pt 1 C1623-C1632 (1994).
