Summary
Ein optimiertes Protokoll für die in - vitro - Reifung von Zebrabärbling Eizellen für die Manipulation der mütterlichen Genprodukten verwendet wird hier vorgestellt.
Abstract
Zelluläre Ereignisse, die während der frühesten Stadien der Embryonalentwicklung Tier nehmen durch maternalen Genprodukte in den Entwicklern Oozyte abgeschieden angetrieben. Da diese Ereignisse auf dem mütterlichen Produkten verlassen die in der Regel sehr schnell handeln nach der Befruchtung-dass präexistieren im Ei, Standardansätze zur Expression und funktionelle Reduktion der Injektion von Reagenzien in die befruchtete Eizelle beteiligt sind in der Regel unwirksam. Stattdessen solche Manipulationen müssen während der Oogenese, vor oder während der Anhäufung von mütterlichen Produkte durchgeführt werden. Dieser Artikel beschreibt im Detail ein Protokoll für die in - vitro - Reifung von unreifen Eizellen Zebrabärbling und die anschließenden in - vitro - Fertilisation, wodurch man tragfähige Embryonen , die bis zum Erwachsenenalter überleben. Dieses Verfahren erlaubt die funktionelle Manipulation der mütterlichen Produkte während der Oogenese, wie beispielsweise die Expression von Produkten für die phänotypische Rettungs- und getaggt Konstrukt Visualisierungen sowie einS, um die Reduktion der Genfunktion durch Reverse Genetik-Mittel.
Introduction
Während der Tierentwicklung, die Mutter Ablagerungen Genprodukte (zB RNAs, Proteine und andere Biomoleküle) in das Ei; diese Produkte sind wichtig für die frühe zelluläre Prozesse unmittelbar nach der Befruchtung 1, 2. Die Manipulation der Expression und Funktion von mütterlichen Produkten ist in der Regel unwirksam , wenn 3 einen Standard - Ansatz für die Injektion von Reagenzien in befruchteten Eier verwendet. Dies ist, weil die meisten RNAs und Proteine, die durch die Eizelle während des Oogenese produziert werden, so vorbelastet mütterliche Produkte sind bereits in der reifen Eizelle. Solche Produkte sind bereits existierenden undurchlässig für funktionelles Knockdown mit Gen-Targeting-Mitteln, wie Morpholino-Antisense-Oligos (MOs), da MOs das mRNA-Ziel, das nicht vorher existierende Proteins bereits in dem Ei bei der Befruchtung. Darüber hinaus passieren viele frühen embryonalen Prozesse zu früh nach der Befruchtung influen werdenced durch Protein-Produkte von RNA in die befruchtete Eizelle injiziert abgeleitet, da die RNA nicht schnell genug erzeugt werden können, die ersten Ereignisse von der Embryonalentwicklung zu beeinflussen. Aus dem gleichen Grunde, markierten Protein-Fusionen durch eine mRNA Injektion in die befruchteten Eizelle ausgedrückt kann nicht rechtzeitig für die Visualisierung während ihrer aktiven Rolle im frühen Embryo hergestellt werden. Die Injektion in extrudierten reife Eizellen vor Eiaktivierung ist möglich , aber ist im Zusammenhang mit ähnlichen technischen Problemen: so reife Eier sind bereits vorinstalliert mit dem mütterlichen Protein, und sie werden nicht translational aktiv werden (dh produziert Protein aus exogener Transkripte) bis nach dem Ei Aktivierung. Aus diesen Gründen muss die Manipulation der mütterlichen Genprodukten in der frühen Embryonalentwicklung wirken typischerweise während der Oogenese in der Reifung Eizelle durchgeführt werden.
Als einen Ansatz , um diese Hürden zu überwinden, in - vitro - Reifung Methoden, die für die Reifung von ooc ermöglichenytes aus Stufe IV zu Eibildung wurden in Zebrabärbling etabliert. Frühe Methoden in vitro - Reifung erlaubt, aber die resultierenden reifen Eier waren nicht zuständig für die Befruchtung 4. Anschließend wird die Manipulation der Kulturbedingung von neutral bis pH 9,0, den alkalischen pH - Wert der Ovarienflüssigkeit in Fischart gefunden nachahmt 5, 6, erlaubt für eine zuverlässige in - vitro - Fertilisation (IVF) nach in vitro - Reifung 7, 8. Tatsächlich in vitro -matured Oozyten können brauchbare Embryonen erhalten , die bis zum Erwachsenenalter und fruchtbar sind , die überleben , 3, 8. Dieses verbesserte Verfahren wurde weiter die funktionelle Manipulation der mütterlichen Gene umfassen, die angepasst, um die Expression von markierten Proteinen während der Oogenese Zebrabärbling durch exogene Expression und MO-vermittelte funktionelle knock down in maturing Stufe IV Oozyten 3 (Abbildung 1).
Zebrafisch Oogenese weist eine Reihe von charakteristischen Stufen zur Bildung von reifen Eizellen führenden 9 (Tabelle 1 für einen Eintrag zu verschiedenen Stadien der Oogenese sehen). Kurz gesagt, Oozytenentwicklung wird von Stufe I Eizellen initiiert und wird an dem Diplotän Stadium der Prophase I der Meiose verhaftet. Diese Oozyten unterziehen Wachstum durch aktive Transkription (initiiert während der Phasen IA und IB), die Bildung von kortikalen Alveolen (auch als Rindengranulat bekannt, während der Stufe II initiiert) und vitellogenesis (initiiert während der Stufe III). Oocyte Wachstum während der Stufe IV, vollendet, wenn der Meiose I wird fortgesetzt, was in der Demontage des Oozyten Nukleus, als das Keimbläschen bezeichnet (GV). Anschließend wird die Meiose II wieder in der Metaphase verhaftet. Der Abschluss der Oozyte Wachstums und Meiosehemmung während der ersten Stufe führt zu einer reifen IV V zB BühneG 9. Die Entfernung des follikuläre tritt Membran während der Freisetzung der Eizelle in das Lumen des Ovars 10 und ist von wesentlicher Bedeutung für die Befruchtung und richtige Eiaktivierung. Sobald die Eier von der Mutter während der natürlichen Paarung extrudiert werden, werden sie aktiviert. In Zebrabärbling, Einwirkung von Wasser ist ausreichend , um für volle Eiaktivierung, unabhängig von der Anwesenheit von Spermien 11.
In - vitro - Bedingungen ermöglichen zur Zeit für die Reifung von Oozyten von frühem Stadium IV- , die von ihrer Größe identifiziert werden kann (690 bis 730 um), die Anwesenheit einer großen GV in einer asymmetrischen Position und ein vollständig opakes Aussehen aufgrund der Ansammlung von Dotter - Proteinen (2B) -nach mature V Eistadium, durch ein vollständig demontiert GV gekennzeichnet und einem durchscheinenden Aussehen durch Proteinverarbeitung 12 (2C) zum Eigelb. Bei diesem Ansatz ganze Ovarien containing Eizellen in verschiedenen Stadien der Entwicklung werden von Frauen entfernt. Die Oocyten sind erlaubt 8 in 17α-20β-dihydroxy-4 - pregnen-3-on (DHP), einer effektiven Reifung induzierenden Hormons zu entwickeln. Während dieser Zeit kann Reifungs Oozyten durch die Injektion von Expression (beispielsweise mit einer Kappe bedeckt, in vitro -transcribed mRNAs) oder Reverse-genetics Mittel (zB MOs) manipuliert werden. Die follikulären Schicht nicht vergießt nicht spontan in Richtung zum Ende der Reifungszeit, so muss er von Hand entfernt werden. Nach defolliculation, in - vitro - Fertilisation wird durch Triggern Eiaktivierung durch die Exposition der Eier in dem Wasser (in embryonalen (E3) mittel) 13 und eine Samenlösung erreicht. Die resultierenden Zygoten laufen Embryonalentwicklung und erlauben die Bewertung der Fähigkeit von Behandlungen mütterlichen Genfunktion und zur Visualisierung und Analyse der markierten Produkte mütterliche zu manipulieren (
Protocol
Alle Zebrabärbling wurden in strikter Übereinstimmung mit dem guten Tier Praxis behandelt, wie von den zuständigen nationalen und / oder lokalen Tierschutzkörpern definiert, und alle Tier Arbeit wurde von dem zuständigen Ausschuß (University of Wisconsin-Madison Sicherung Nummer A3368-01) zugelassen. Die Tiere wurden bei 26,5 ° C unter Standardbedingungen gehalten.
1. Vorauswahl von Frauen
HINWEIS: Die Oozyten bei erwachsenen Frauen überspannen typischerweise eine Reihe von Entwicklungsstadien, von Stufe I bis V (Abbildung 2). Bereinigen die Weibchen bereits existierender Eizellen durch eine erfolgreiche natürliche Paarung erhöht die Synchronisation von Oozyten Inszenierung, als sich neu entwickelnden Eizellen als Kohorte erscheinen 3, 14. Innerhalb von etwa 8 Tagen nach dem Abführmittel sind die meisten Eizellen in einem frühen Stadium IV, die für die Einleitung in - vitro - Reifung optimal ist. Eine derartige Synchronisation erhöht die Ausbeute an Oozyten That kann durch den gesamten Prozess von in - vitro - Reifung gehen, experimentelle Manipulation zu erleichtern. Siehe vorherige Beschreibungen 13 für Informationen zum Einrichten von Fisch in gepaart Paarungen und auf Fischwasserzusammensetzung (hier 14 g Meersalz und 150 g NaHCO 3 pro 1.000 Liter Umkehrosmosewasser, pH 6,5-8,5 (bevorzugter Bereich: 6.8 -7.5) und eine Leitfähigkeit von 180-360 & mgr; S). Siehe Brand et al. 13 für weitere Rezepte.
- Acht bis zehn Tage vor die in - vitro - Kultur - Manipulation, mit einem Fischnetz eines einzelnen männlichen und weiblichen ein einzelnen Fische des gewünschten Stammes mit einem passenden Behälter zu übertragen. Paar mehrere Sätze. Lassen Sie sie in der Gegen Tank über Nacht. Lassen Sie sie im Laufe des Abends und durch den Nachmittag des folgenden Tages paaren.
- Verwenden Sie ein Fischnetz die Weibchen zu trennen, die Eier während der Paarung ergeben und sie in einen separaten Tank. Füttert diese Frauen zweimal täglich mit einer Futtermischung haltendenng etwa eine gleiche Menge an Artemia und Fischfutterflocken. Die Menge der Nahrung sollte ausreichen, um etwa 20 min zur Verfügung zu stellen, aber nicht mehr, der Fütterungszeit.
2. Herstellung von Reifungsmedium
HINWEIS: Bereiten Sie Reifungsmedium am Tag des In - vitro - Reifung Experiments innerhalb von 1 h den Eizellen von den weiblichen entfernen (siehe Abschnitt 3).
- 20 ml von Leibovitz L-15-Medium mit L-Glutamin, pH 7,0, in ein 50 ml konischen Röhrchen unter sterilen Bedingungen. Bringen auf pH 9,0 mit 10 N NaOH.
- Fügen 9 ml Leibovitz L-15-Medium, pH 9,0, auf 2 separate 50 ml konischen Röhrchen. Label 1 tube "DHP +" und die andere "-DHP."
- In dem Rohr + DHP, mit 10 & mgr; l von 17α-20β-dihydroxy-4 - pregnen-3-on (DHP), 490 & mgr; l dH 2 O und 500 & mgr; l von 10% igem Rinderserumalbumin (BSA).
- Im -DHP Rohr wurde mit 100 & mgr; l von 10 mg / ml Gentamycin, 40081; l dH 2 O und 500 & mgr; l 10% BSA.
3. Dissection der Oozyten und Initiation der In - vitro - Kultur
HINWEIS: Das in - vitro - Kultur Experiment 8-10 Tage mit vorgewählten Frauen durchgeführt , nachdem sie Eier durch natürliche Paarung lösen. Verwenden Sie Reifungsmedium am selben Tag gemacht (siehe Abschnitt 2). Oozyten reift angemessen , wenn die Präparation in der Nähe des Endes des Fischtageszyklus (bestimmt im Labor durch voreingestellter künstliche Beleuchtung in der Fischanlage) 13 begonnen wird, möglicherweise Prozesse imitiert durch natürliche Paarung auftreten. Dies bedeutet , dass die meisten Schritte im Protokoll muss am Abend durchgeführt werden , wenn Fisch in einer Anlage mit einem Standard - Lichtzyklus untergebracht ist (zB Anfang Schritt 3.2 um 6 Uhr in einer Anlage mit einer 8.00 bis 10.00 Lichtperiode), obwohl andere Arbeitszeitperioden möglich sind mit einem entsprechend zeitverschobene Lichtzyklus.
- Vorbereiten einer 0,2% Tricaine Stammlösung in dH 2 O, gepuffert auf pH 7,0 mit 1 M Tris, pH 9,0, und halten diese Lösung bei 4 ° C. Dies kann vor der Zeit vorbereitet werden.
- Starten Sie den Versuch 0-4 h vor dem Ende des täglichen Lichtzyklus in der Anlage. In einem 250-ml-Becherglas mit 20 ml 0,2% Tricaine Stammlösung, pH 7,0, zu 80 ml Wasser und Fisch mischen.
- Übertragen Sie die vorgewählten Weibchen Tricaine Lösung und einschläfern sie durch Überbelichtung. Lassen Sie die Frauen in der Tricaine Lösung für 15 Minuten nach Beendigung der Kiemenbewegung.
- Mit einem Löffel sammeln die eingeschläfert Fisch aus der Tricaine Lösung und spülen Sie sie kurz in Fischwasser. Den Fisch auf ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu absorbieren.
- Verwenden Sie einen sauberen Rasierklinge den eingeschläfert Fisch auf der Ebene der Brustflosse enthaupten. Verwendung Präparierscheren, stellt einen Längsschnitt an der Bauchseite des Fisches, von dem vorderen Ende zu dem Analbereich erstrecken.
- Mit Dissektionszangen distanzieren sanft die Eizellen von den follikulären Massen. Sortieren der frühe Stufe IV - Oozyten (2B; vor GV Panne, bei nahezu maximaler Größe und durch ein dunkles, lichtundurchlässiges Zytoplasma und ein leicht ersichtlich GV in der Oocyte befand asymmetrisch gekennzeichnet). Discard Oozyten in früheren Stadien (Figur 2A) und durchscheinend, reifen Stadium V Eier (ähnlich wie in Figur 2C , aber die in den Ovarien vor der DHP - Behandlung).
HINWEIS: Die Oozyten werden für die Reifung in einem frühen Stadium IV ausgewählt, zum frühestmöglichen Zeitpunkt, dass die Ergebnisse in der reifen, Stufe V oocytes nach dem in - vitro - Kulturbedingungen (2C und D) 3. Weil Stufe IV Oozyten aktiv Produkte produzieren, die Manipulation in dieser Phase erlaubt die Expression von exogenen RNA-Produkten durch Injektion oder für die Reduktion der Genfunktion über MOs eingeführt. - Verwenden einer Glaspipette Pasteur der frühen Stufe IV-Oozyten zu einem zweiten 35 x 10 mm Kunststoff-Kulturschale mit 4 ml Leibovitz L-15 Medium + DHP zu übertragen. Übertragen minimale Mengen an -DHP Mediums in die Schale der + DHP Lösung enthält.
4. Oozyten-Mikroinjektionen
HINWEIS: Getrennter Stufe IV Oozyten in vitro - Reifung unterzogen werden können mikroinjiziert Reagenzien für funktionelle Manipulation einzuführen oder markierte Protein - Expression. Die Mikroinjektion von Reagenzien, wie mRNA und MOs (siehe Abschnitt 4) wird typischerweise durchgeführt , wenn die Oozyten in vitro durchlaufen matuRation in + DHP Medium vor defolliculation. Wenn es gewünscht wird, um mehr Zeit zu lassen, Manipulationen durchzuführen vor der Oocytenreifung kann die Injektionen auch in -DHP Medium durchgeführt werden, vor der Reifung, für mindestens 2 h. Sie können anschließend auf + DHP-Medium übertragen werden.
- Bereiten Sie mRNAs ein Standardausdruck-Kit. Halten Sie sie bei -80 ° C als 100-500 pg / ul Lager zur Injektion in einer Endkonzentration von 50-500 pg / ul (200 pg / ul wird empfohlen) in RNA-grade Wasser. Bereiten MOs bei einer Konzentration von 4 ng / & mgr; l in Wasser gemäß der Anweisungen des Herstellers. Injizieren sie bei Endkonzentrationen von 2 ng / & mgr; l (oder empirisch bestimmt).
HINWEIS: Die Injektionen werden üblicherweise in + DHP-Medium (siehe Hinweis in Abschnitt 5) vor dem defolliculation durchgeführt. - Wenn mRNA die Injektion, unmittelbar vor der Injektion verdünnen den mRNA unter Verwendung von RNA-grade-Umkehrosmose-Wasser und 0,2 M KCl um eine Endlösung von 0,1 M KCl zu erreichen.
- Wenn MOs, unmittelbar vor dem Einspritzen eingespritzt wird, verdünnen die MOs auf die gewünschte Konzentration unter Verwendung von Umkehrosmose-Wasser und 0,2 M KCl um eine Endlösung von 0,1 M KCl zu erreichen.
- Manuell halten Oozyten mit feinen Pinzetten und ungefähr 1 nL in Wildtyp - Oozyten im Stadium IV mit einer ausgezogenen Glaskapillare Pipette hergestellt unter Verwendung einer Nadel injizieren.
- Bereiten Sie die Glasnadel durch erhitztes Glaskapillarrohre Ziehen Laden die Lösung eingespritzt werden soll, und brechen die Nadelspitze mit einer Zange, wie zuvor in 15 Protokollen für Standardeinspritzung in Zebrabärbling frühe Embryonen beschrieben.
HINWEIS: Es ist hilfreich, wenn die Nadel eine allmähliche Verjüngung anstatt ein abrupt man hat; Dies ermöglicht mehr Flexibilität in Bezug auf den Standort der Pause in der Nadelspitze und hilft auch eine Beschädigung des injizierten Embryos zu verhindern. Unter Verwendung der gleichen Nadel und Lösung wie für die Embryo-Injektionen, stellen Sie das injizierte Volumen von vorge Bestimmung derMikroinjektor Druckeinstellungen, die das gewünschte Volumen herzustellen. Diese Einstellungen können durch mock-injizierende bestimmt werden in einen Tropfen Mineralöl auf einem Mikroskoptisch Kalibrierungsdia (0,01 mm) und Einstellen der Mikroinjektor - Einstellungen den gewünschten Durchmesser in dem Bolus von injizierten Lösung zu erhalten, wie zuvor beschrieben 15.
- Bereiten Sie die Glasnadel durch erhitztes Glaskapillarrohre Ziehen Laden die Lösung eingespritzt werden soll, und brechen die Nadelspitze mit einer Zange, wie zuvor in 15 Protokollen für Standardeinspritzung in Zebrabärbling frühe Embryonen beschrieben.
5. Eizellreifung und Defolliculation
HINWEIS: Während der Eizellreifung, werden sich die Eizellen zunehmend durchscheinend, die für die Beurteilung der erfolgreichen Kulturbedingungen ermöglicht.
- Weiterhin die unreifen Inkubieren (und gegebenenfalls eingespritzt) Oozyten in + DHP Medium bei 26,5 ° C, in regelmäßigen Abständen überprüft (alle 30 Minuten) , um sicherzustellen , dass die Oozyten , intakt bleiben und durchlaufen die richtige Reifung durch progressives scheinend zu werden (siehe Abbildung 2c) .
- Entfernen Sie alle Lysieren Eizellen mit einer Pasteur-Pipette und entsorgen Sie siein einem Labor Abfallbecher die Qualität des Mediums zu halten. Tauschen Sie das Kulturmedium mit etwa einem halben Volumen frischen + DHP Medium um eine klare Lösung zu erhalten, abhängig von der Menge der Eizelle Lyse.
- Erlaubt die in vitro - Reifung fortschreiten , bis ein Großteil des Oozyten durchscheinend worden und hat eine GV , die nicht mehr erkennbar ist (ca. 2 h in DHP - Behandlung, siehe Figur 2C im Vergleich zu D). Sehen Sie sie unter einem Binokular mit Durchlichtoptik.
- Entfernen Sie die äußerste follikulären Membran aus jeder gereiften Oocyten. Verwenden extra feine Zange eine Träne in der follikulären Membranen in einer Region mit erhöhter Raum zwischen der Eizelle und der Membranen zu bilden. Abschälen eines Teils der Membran ab und rollen den Oozyten aus der Membran während der geschälte Teil gedrückt gehalten wird.
HINWEIS: Der zugrunde liegende Chorionmembran bleibt typischerweise in enger Verbindung mit dem Ei während dieses Prozesses; nach Ei Aktivation, dehnt es sich für den Embryo um eine Schutzschicht zu bilden. - Übertragen des defollikuliert Oozyten in einem minimalen Volumen von Medium (in der Regel etwa 5-10 übertragen reife Oocyten in weniger als 20 & mgr; l) in einer Petrischale mit einem paar Tropfen der Kultur (DHP +) -Medium und gehen zur Befruchtung.
6. Düngung von In - vitro - Cultured Oozyten
HINWEIS: Die Sperma-Lösung auf Eis, unten vorbereitet, wird für ca. 2 h seine Wirksamkeit aufrechtzuerhalten.
- Vorbereiten einer Spermienlösung in der Nähe des Endes der Oocytenreifung Schritt und vor der Verwendung von fünf männlichen Hoden in 500 ul Hanks' Lösung defolliculation, wie zuvor 16, 17 beschrieben.
- In 10 bis 50 & mgr; l der Spermien Lösung für die defollikuliert Eizellen in + DHP Kulturmedium. 10 s warten.
- Mit einer Pipette wird ein paar Tropfen von embryonalem (E3) Medium zu den Oozyten. 1 min warten und dann die überfluten plmit E3 Medium aß.
HINWEIS: Die Zusammensetzung des E3 - Medium ist wie folgt: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, und 1-5% Methylene Blue 13. - Wiederholen Sie die Schritte 5.3, 6.2 und 6.3 auf eine größere Anzahl von befruchteten Embryonen zu erhalten.
- Lassen Sie die befruchteten Embryonen zu entwickeln. Verwenden eines Seziermikroskops mit Durchlichtoptiken die Progression durch die Furchungsstadien zu beobachten erfolgreiche Befruchtung zu gewährleisten, wie zuvor beschrieben für die Befruchtung 17 und Staging - 18.
Representative Results
Um festzustellen , ob das oben beschriebene Verfahren erfolgreich ist, können die Embryonen während der Furchungsstadien beobachtet werden , um das Erscheinungsbild des stereotypisch frühen embryonalen Spaltungsmusters 18 , um zu bestätigen, sowie bei 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) , um zu bestätigen die richtige Entwicklung des Grundkörpers Plan. Dieses Verfahren ermöglicht die Manipulation der mütterlichen Produkte für funktionelle Untersuchungen durch die Injektion von Reagenzien, wie mRNAs und MOs, während Oozytenentwicklung.
Manipulation der mütterlichen Produkte für funktionelle Studien:
mRNA , kodierend für Wildtyp- und mutierten Produkte lassen sich in in - vitro - Reifung Oozyten injiziert werden , um die Wirkung der Manipulation der mütterlichen Genfunktion während der Meiose zu testen und die frühe Embryonalstadien. Zum Beispiel können Wildtyp-Embryonen mit wi injiziert werdenld-Typ mRNA für die Wirkung der Produktexpression zu testen oder mit mutierten RNA zu testen , für potentielle dominant (zB gain-of-function und antimorphic) Effekte in diesen Prozessen. Oozyten in in vitro - Kultur in der Lage , Protein aus exogenen mRNA gesamten Oozytenentwicklung zu erzeugen, wie durch die Expression von GFP aus injizierten mRNA gezeigt, obwohl nur Oozyten , die Kulturbedingungen in der Stufe IV der Oogenese initiieren zu reifen Stadium V - Oozyten (2B entwickeln -2D siehe auch Nair et al. 3). Die Expression von Wildtyp - Produkt durch injizierten mRNA ist auch für die Rettung von mütterlich-Effekt Mutationen instrumental Gen Identität während Positionsklonierung 3, 24 zu bestätigen. In diesem Fall wird Wildtyp-mRNA in Eizellen von homozygot mutierten Weibchen injiziert zu testen, ob Wildtyp-Produkte den mutierten Phänotyp retten kann. Diese genetische Rettung dargestellt in <strong> 3A-3C, wo Aurb mRNA injiziert wird , um die phänotypischen Wirkungen einer Mutation in seiner entsprechenden Gen, zellulären Insel (CEI) (3A-3C) gezeigt , zu retten. Die Embryonen aus einer Kontrollgruppe werden auch 3 das entsprechende mutante Phänotyp entwickeln gelassen zu zeigen. Mutant RNA kann auch in Mutanten-Oozyten injiziert werden, um zu testen, ob das mutierte Produkt durch den Vergleich des Ausmaßes der Rettung der Dosis durch das Wildtyp-Produkt Teilfunktion behält.
Die Protein-Expression von mRNA in der Entwicklung von Eizellen injiziert wird mit wenig oder gar keiner Verzögerung auftritt. Starke GFP - Expression ist innerhalb von 2 h der Injektion der entsprechenden mRNA, unabhängig von dem Entwicklungsstadium der Eizelle 3 beobachtet (2B-2D; siehe auch Nair et al . 3). Produkte wie mCherry:SAS6 und Birc5b (Motley): GFP können sofort nach der Befruchtung und während des ersten embryonalen Zellzyklus 3, 25 beobachtet werden. Die Injektion von mRNA während der Oogenese führt auch zur Produktion von Protein , das, unabhängig von der verschmolzenen getaggt Einheit ist , funktionell ist unmittelbar nach der Befruchtung, wie im Fall von mütterlichen Produkten für zellulare Insel / Aurb 3, wirkungslosen Zyklus / lrmp 24 gezeigt ist, und bunt / bir5b 25. Translation-blocking MOs eine Wirkung auch unmittelbar nach der Befruchtung hat, wie vergeblichen Zyklus / Lrmp 3 und in späteren Stadien der Embryonalentwicklung gezeigt, wie im Fall von Mission Impossible / dhx16 3. Splice-blocking MOs, wenn in Reifung Eizellen injizierte, hat keine Auswirkung auf mütterliche Funktion, wahrscheinlich aufgrund bereits vorhandene reife mütterliche Transkripte in Stufe IV Eizellen <sup class = "xref"> 3.
Generation von morphants:
Wenn eine MO Verwendung entsprechend ein Gen mit einer bereits identifizierten Mutation wird die morphant Phänotyp erwartet, dass die mutierten Phänotyp imitieren. Morphants sind im Vergleich zu nicht-injizierten Embryonen und denjenigen mit einem Standard injiziert, MO steuern. Die Injektion eines Übersetzungsblockierungs morpholino kann erfolgreich Phänokopie den bekannten mutanten Phänotyps 3, wie durch die Injektion von Lrmp MO in Oozyten gezeigt, die den mutierten Phänotyp der entsprechenden Mutation, wirkungslosen Zyklus (3D-F) nachahmt. Die Spezifität von MOs können durch die gleichen Methoden bestimmt werden verwendet , wenn MOs in Embryonen (rezensiert zuvor) 19, 20 eingespritzt wird .
Die Expression von fluoreszenzmarkierten Fusionsproteinen:
mRNA , kodierend für Genprodukte von Interesse für fluoreszierende Proteine fusioniert (zB GFP und mCherry) kann auch in entweder Wildtyp- oder mutierte Oozyten injiziert werden , um die entsprechenden Produkte innerhalb des frühen Embryos (dh Reflektieren eines subzellulären Lokalisation Muster sichtbar zu machen, Figur 3G und 3H). kodierenden mRNAs für ähnliche Fusionen aber das mutierte Allel denen in ähnlicher Weise ausgedrückt werden kann, testen, ob die Mutation mögliche subzellulären Lokalisierungen betrifft.
Abbildung 1: In Vitro Oocytenreifung. Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte in vitro in Oocytenreifung beteiligt zeigt. Erwachsene Weibchen sind vorselektierten für Eiablage 8 Tage vor dem Verfahren, sie Eier zu reinigen, die bereits ausgereift sind und proMote neue Oozytenentwicklung. Die Ovarien, enthält Entwicklungs Oozyten werden von Weibchen entfernt und in ein Medium überführt , das Hormon DHP enthält Oocytenreifung in vitro zu induzieren. Nach dem Entfernen von Frauen und unmittelbar vor oder während der Eizellreifung, Eizellen mit RNA-Produkten und anderen Reagenzien für die funktionelle Manipulation der mütterlichen Faktoren injiziert werden. Reife Oozyten werden manuell defollikuliert und in vitro mit einem Spermium befruchtet Lösung Befruchtete Embryos lebensfähig zu erhalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: In - vitro - Eizellreifung und Expression von Produkten aus injizierten mRNA. (A) Oozyten in den Stufen I-III, beobachtet in Ovarien vonFrauen 4 Tage nach Spülung (dpp). (B) Oozyten im Stadium IV, beobachtet in Ovarien von Weibchen 8 dpp. Die Keimbläschen (GV, Pfeilspitze) ist deutlich sichtbar und nimmt eine exzentrische Position. Die Phase - III - Oozyten in (A) zeigen auch eine leicht ersichtlich , GV, aber es gefunden wird in der Eizelle zentriert. Stufe IV Oozyten in (B) haben eine Größe , das in der Nähe von maximal ist im Vergleich zu den reifen Oocyten in (C). (C und D) Oozyten im Stadium V (reifen Oozyten) nach 2 h in in - vitro - Reifung Bedingungen in der ersten Stufe eingeleitet IV, wie in (B) und während der Reifung mit GFP-kodierende, in vitro transkribierte mRNA (C, sichtbares Licht injizierten nur, D, Überlagerung des sichtbaren Lichts und GFP-Fluoreszenz). Die GV ist nicht mehr ersichtlich, in der Stufe V-Oozyten, die auch weniger opak als Stufe IV-Oozyten. Injizierten Oocyten exprimieren GFP - Protein (D). Defolliculation von reifen Stadium IV Oozyten modercribed im Protokollabschnitt. Maßstabsbalken = 300 & mgr; m. Alle Platten wurden reproduziert mit Genehmigung von Nair et al 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Manipulation und Visualisierung von Maternal Produkten durch In - vitro - Eizellreifung. (A - C) Rettung des mütterlich-Effekt - Phänotyp verursacht durch eine Mutation in Zell Insel / aurora B durch die Injektion von Wildtyp - mRNA Aurb in der Stufe IV CEI / Aurb Oozyten. Fusionierten Bilder Tier Ansichten von 65 MPF festen blastodiscs zeigen, sichtbar gemacht mit anti-ß-Catenin-Antikörper Membranen markieren (grün), anti-α-Tubulin-Antikörper, um anzuzeigen, Mikrotubuli (rot) und DAPI DNA (blau) zu bezeichnen. (A) β-Catenin - Akkumulation in Wildtyp - Embryonen, indikativ für normale Reifung Furche. (B) A CEI / Aurb Embryo aus einem nicht - injizierten CEI / Aurb Stufe IV Oozyte zeigt teilweise, rudimentäre Furchen , die β-Catenin nicht akkumulieren. (C) einem geretteten CEI / Aurb Embryo von einer CEI / Aurb Oozyte injiziert mit Wildtyp - mRNA Aurb an den Furchen robust β-Catenin - Akkumulation darstellt. (D - F) Phänokopie der mütterlich-Effekt , verursacht durch eine Mutation in wirkungslosen Zyklus / lrmp aus der Injektion von Lrmp morpholino in die Stufe IV Oozyten. Fusionierte Bilder Tier Ansichten von 70 MPF fixierte blastodiscs zeigen, sichtbar gemacht mit Anti-γ-Tubulin-Antikörper, um anzuzeigen, Zentrosomen (rot) und DAPI DNA (blau) zu bezeichnen. (D) In Wildtyp - Embryonen, jeden Kern assoziiert mit γ-Tubulin, ein Marker für zentrosomalen Material. (E) im mütterlichen Effekt FUE Mutanten, Fusions pronukleären versagt, was in zwei bis drei Flecken von DNA - Etiketten entspricht , nicht fusionierten parentalen Pro-Nuclei und dem Polkörper für Meiose II. (F) In Lrmp morphants, wo mütterliche Lrmp Funktion inhibiert wird, nicht die Kerne in ähnlicher Weise zu unterteilen , und zusätzlich, nicht mit γ-Tubulin assoziieren. (G und H) Visualization of maternal hergestelltes Produkt im frühen Embryo. Sass6 mCherry-Protein aus exogener mRNA in der Stufe IV injizierte Oozyten zu den Centriolen lokalisieren. Fusionierte Bilder Tier Ansichten von 40 MPF festen blastodiscs zeigen, sichtbar gemacht mit Anti-γ-Tubulin-Antikörpern Zentrosomen markieren (grün), um anzuzeigen, mCherry Fluoreszenz Sass6 (rot) und DAPI DNA (blau) zu bezeichnen. (G) ausgedrückt Sass6 mCherry-Protein lokalisiert den Kern (Pfeile) flankierende von der Zentrosomen Marker γ-Tubulin an den Aufstellungsorten zu etikettierenden Foci. (H et al 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Stadien der Oogenese | Oocyte Durchmesser (um) | Key Orientierungspunkt (e) |
| 1A - Prefollicle | 7 bis 20 | Initiation der Transkription aktiven, Akkumulation von Nukleoli |
| 1B - Follikel | 20 bis 140 | Dekondensation Chromosomen |
| II - Cortical alveolus | 140-340 | Cortical Alveolen Produktion |
| III - Vitellogenese | 340-690 | Verdunklung von Ooplasma durch die Ansammlung von Dotter-Precursor-Protein und Lipiden |
| Frühe IV - Eizellreifung | 690-730 (unterer Bereich) | Asymmetrische Lokalisierung von Keimbläschen |
| Frühe IV - Eizellreifung | 690 bis 730 (oberer Bereich) | Germinalvesikel verschwindet, Verhaftung in der Metaphase II |
| V - Reife Eizelle | ~ 750 | Ooplasma / Eigelb wird durchscheinend |
Tabelle 1: Grenzsteine von Oozyten - Entwicklung in ZebraFisch.
Discussion
Das obige Protokoll ist für die Manipulation von Genprodukten vor der Befruchtung, so dass für die Untersuchung der mütterlichen Genprodukten in dem frühen Zebrafischembryo. Frühere Studien konnten Eizellen in vitro reifen 4; Dieses Protokoll wurde modifiziert , für die nachfolgende Düngung von in vitro gereiften Eizellen 8 zu ermöglichen. Dies wiederum ermöglicht die Injektion von Reagenzien für die funktionelle Manipulation und Visualisierung von mütterlich vererbten Produkten im frühen Embryo 3. Embryonen aus diesem Verfahren resultiert, kann lebensfähig sein und überleben kann fruchtbar Erwachsene werden. In Vorversuchen etwa der Hälfte der befruchteten Embryonen aus diesem Verfahren abgeleitet wurde am Tag 5 der Entwicklung lebensfähig, durch Schwimmblase Inflation in diesem Stadium zu beurteilen, wie, etwa die Hälfte davon wurde gesund, fruchtbar Erwachsene (nicht veröffentlichten Beobachtungen).
Es gibt eine Reihevon kritischen Schritte in dem Protokoll zu berücksichtigen. Oozyten im geeigneten Stadium der Reifung (frühes Stadium IV) zu initiieren, angereichert werden kann, wenn das Weibchen verpaart kürzlich wurde, jedoch nicht vor 8 dpp. Mit Fisch, der möglicherweise nicht vor kurzem ergeben gepaart haben 14 Eier in degenerieren, die Reifung nicht unterliegt. Weibchen gepaart innerhalb von weniger als 8 Tagen werden eine Mehrheit der Eier im Stadium III oder weniger, und somit werden die Eier nicht richtig in vitro reifen. Eierstöcke bei Frauen, die 8 Tage vor verpaart werden einen optimalen Anteil von Oozyten in frühem Stadium IV haben. Diese kann durch ihre Opazität und die Anwesenheit des GV in einer exzentrischen Position (2B) erkannt werden. Oocyte Stufe Bestimmung kann auch durch Größenmaß unterstützt werden, wobei die Eizellen auf einen graduierten Mikrometer Objektträger unter einem Mikroskop platziert , und im Vergleich zu Standard - Staging - Richtlinien (Tabelle 1). Allerdings haben frühes Stadium IV Oozyten annähernd maximale Größe im Vergleich zu reifen(erkannt durch ihre relative Transparenz und das Fehlen einer GV; 2C) Oozyten und sind leicht zu erkennen, wie oben beschrieben, die im allgemeinen die Notwendigkeit eines direkten Oozyte Größenmaß vermeidet.
In - vitro - Reifung innerhalb von einigen Stunden nach dem Ende des Tageslichtzyklus , in dem die weiblichen Eizelle Spender akklimatisieren beginnen. Oozyten nicht richtig reifen, in schlechten Befruchtungsraten reflektiert, wenn im Laufe des Vormittags Periode des Licht-Zyklus kultiviert. Der Grund für die zirkadiane Abhängigkeit der in vitro Oocytenreifung Methode wird nicht verstanden , aber spiegelt wahrscheinlich darunter liegendes circadian Vorspannungen in in vivo Eizellreifung die cycling Genexpression während der Oogenese 21. Eine häufige Ursache für Oozyten andernfalls trotz ordnungsgemäßer Oozyte staging in vitro - Reifung erfolgreich zu unterziehen ist , dass der DHP abgelaufen ist. DHP Hormon Ablauf der Regel nach einem Jahr und Wirkung, um sicherzustellen,ive Reifung, sollte die Arbeits Charge innerhalb von 9 Monaten Gebrauch ersetzt werden.
Die Injektion von Oozyten, ist ein weiterer wichtiger Schritt, wenn der Zweck des Verfahrens ist die funktionelle Manipulation der mütterlichen Produkte. Dieses Verfahren hat die Anforderungen an 0-30 MPF von denen für Standard-Injektionen in der befruchteten Eizelle unterscheiden. Ein Schlüsselfaktor in Oocyteninjektion ist die Notwendigkeit , die Injektionen unter Bedingungen durchzuführen, die zu einem vorzeitigen Eiaktivierung führen nicht, wie in Leibovitz L-15 Medium , 22, 23. Weil sie in Ovarien eingebettet sind, Reifung Eizellen stellen auch besondere Anforderungen an Injektion. Das Protokoll über schlägt erste Oozyten aus den Ovarien dissoziieren und dann jede Oozyte separat mit einer Pinzette dissoziiert zu halten, während der Injektion. Diese Technik hat sich bewährt und erlaubt Vorsortierung Oozyten im geeigneten Stadium bei minimaler Handhabung. Alternative Methoden können auch verwendet werden, wiewie: i) Plazieren Oozyten in Standard - Injektionströge Agarose 15, wobei die vertikalen Wände der Troges Unterstützung der Oozyten während der Injektion (in diesem alternativen Verfahren, müssen die Oozyten Injektionsplatten übertragen werden , während in der in - vitro - Reifungsmedium gehalten) und ii ) ermöglicht die Oozyten mit dem Ovarmasse befestigt zu bleiben, die mit einer Pinzette während des Injektions Kontakt mit dem injizierten Oozyten gehalten werden kann (in diesem Ansatz zu vermeiden, sollte die Oocyten nach der Injektion sowohl erleichtern Belichtung DHP dissoziiert werden und deren defolliculation zu ermöglichen , selbst wesentlich für IVF). Trotz dieser besonderen Herausforderung, Stufe IV Oozyten ohne weiteres mit einer Injektionsnadel durchdrungen werden können, wahrscheinlich weil die Chorionmembran in diesem Stadium nicht vollständig 9 entwickelt wird.
Eine Einschränkung des aktuellen Reif Protokolls ist , dass in vitro - Reifung Bedingungen , die richtige Oozytenentwicklung fördernkann nicht erzeugt werden, wenn in der Stufe Oocytenreifung früher als Stufe IV eingeleitet wird. Oozyten werden kompetent zu DHP reagieren , indem sie die Reifung unterziehen , wenn sie einen Durchmesser von 520 & mgr; m, zu erreichen , die während der ersten Stufe auftritt III (vitellogenesis, auf den Bereich 340 zu 690 & mgr; m entspricht) 9. Jedoch ist die Kultur der Stufe III Oozyten Ergebnisse in Oozyten , die für die Befruchtung 3 nicht zuständig sind. Nur Oozyten , deren in vitro - Kultur wird in der Stufe IV initiiert (2B) in reife entwickeln kann, Stufe V - Oozyten (2C und D). Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen, dass im Stadium III für vitellogenesis und Eizelle Wachstum 9 wesentlich ist. Figur e; III - die in vitro Oocytenreifung Verfahren in diesem Artikel vorgestellten sollten nur mit einer Ausgangspopulation von Oozyten im Stadium IV (B), und nicht mit Oozyten in früheren Stadien (Stadien I somit verwendet werden ,
Eine weitere Einschränkung in dem vorgestellten Verfahren ist, dass defolliculation, die für die nachfolgenden Schritte umfassen Befruchtung essentiell ist, ist derzeit ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt in dem Verfahren. Die follikulären Membran ist eine transparente Schicht, die die Entwicklung von Oozyten umgibt, und die Entfernung kann langwierig sein. Wenn diese Membran nicht vollständig entfernt wird, wird das Ei nicht voll aktiviert und gedüngt. Dies wird durch den Ausfall des Chorion deutlich gemacht zu erweitern und die Entwicklung von unregelmäßig angeordnet, Furche artiger structures (pseudocleavages), die charakteristisch für unfertilized Embryonen 11. Die enzymatische defolliculation Methoden wie Kollagenase, wie in Xenopus verwendet, versucht worden. Doch in unseren Händen ist diese Technik nicht erfolgreich, und wir setzen daher auf manuelle defolliculation. Da manuelle defolliculation ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig ist , ist es schwierig , große Chargen von befruchteten Eizellen nach in vitro Eizellreifung zu erhalten. Aufgrund der zeitlichen durch manuelle defolliculation auferlegten Beschränkung, zur Zeit wir ein paar defollikuliert, reifen Eier in einer Zeit, in kleinen Chargen von 5-10 Eiern befruchten. Der Einbau von enzymatischer defolliculation mit diesem Verfahren würde seine Ausbeute und die allgemeine Bedienbarkeit wahrscheinlich erheblich erhöhen.
Obwohl Embryonen nach der Befruchtung in vitro -matured Eizellen produzierten lebensfähig Erwachsene werden können, stellen wir fest, dass nach dem in - vitro - Fertilisation, ein Bruchteil von Embryonen zu tun normal oder in einer zeitgemäßen Weise nicht teilen. Wir sind derzeit die Auswahl für Leitungen , deren Ausbreitungs umfasst Runden der in vitro Oocytenreifung, die in Embryonen in robusteren Muster der Entwicklung führen kann durch diese Methode abgeleitet.
Das Verfahren ist für die klaren Rettungs- oder Visualisierung von Proteinlokalisierung für eine Reihe von Mutationen 25 24, erlaubt. Doch für manche Gene kann die Regulierung der Produktexpression von entscheidender Bedeutung sein, so dass die durch injizierte mRNA exprimierten Produkte zu unterschiedlichen Ergebnissen 26 führen kann. Es ist auch wichtig achtsam aller Bedienelemente zu sein (zB Embryonen mit Reagenzien injiziert , die ähnliche Eigenschaften wie die in dem Experiment noch verwendet werden , haben vorhergesagt , um nicht einen Effekt, wie beispielsweise Steuer MOS- oder RNAs nur kodierend für inerte Proteine zu produzieren, wie beispiels wie GFP), als zugrunde liegende Variabilität unsachgemäße Schlussfolgerungen führen kann.
nt "> Ein Ansatz , der in - vitro - Manipulation durch Befruchtung gefolgt ist besonders nützlich im Fall von maternal abgelagerten Produkte, in denen die Methode der Injektion von RNA, MOs oder Protein in das befruchtete Ei kann in das Ei nicht effektiv akkumulierte Produkte bereits reduzieren. andere kürzlich entwickelten Verfahren, wie CRISPR-mutierten Generation, sind ebenfalls wirksam bei mutanten Bedingungen für maternal exprimierte Gene 26 erzeugt wird . Dieses Verfahren ist jedoch das Wachstum von mehreren Generationen von Fisch erfordert. die in vitro Oocytenreifung Technik ermöglicht eine schnelle funktionelle Manipulation Untersuchung der Funktion von maternal exprimierte Gene, einschließlich der Rettungs- und Phänokopie mütterlicher-Effekt Mutationen sowie die Expression von RNA und Proteinen im frühen Embryo.Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir möchten, dass die Mitglieder der Pelegri Labor und Fisch Anlage Führungskräfte danken, die bei der Erleichterung dieses Projektes beteiligt waren. Die Unterstützung für dieses Projekt wurde von NIH R56 GM065303 und NIH 2 T32 GM007133 zu ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 und NIH 2 T32 GM007133 zu CCE und NIH RO1 GM065303 zu FP bereitgestellt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO2-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO2 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4 - 5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 mL | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| beakers, 250 mL (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| 17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
| gentamicin | Sigma | G1272 | |
| Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
| Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
| Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips | any maker | ||
| Conical tubes 15 mL | any maker | ||
| Conical tubes 50 mL | any maker | ||
| plastic pipette 10 mL with bulb | any maker | ||
| plastic pipette 20 mL with bulb | any maker | ||
| Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
| Reagents for fish water: | |||
| Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
| Reagents for E3 medium: | |||
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| KCl | Sigma | P5405-500G | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
| MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
| Fish Food: | |||
| Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
| Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |
References
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