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Developmental Biology

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작 doi: 10.3791/55213 Published: April 22, 2017
* These authors contributed equally

Summary

모체 유전자 산물의 조작에 사용 제브라 난자의 체외 성숙에 최적화 프로토콜은 여기에 제시된다.

Abstract

동물의 배아 발달의 초기 단계에서 발생하는 셀룰러 이벤트는 개발 난자로 입금 모계 유래 유전자 산물에 의해 구동된다. 이러한 이벤트는 일반적으로 계란 내부 수정, 즉 전세에 존재 후 곧 행동 산모의 제품에 의존하고 있기 때문에, 수정 된 난자에 시약의 주입을 포함하는 표현과 기능 감소를위한 표준 접근 방식은 일반적으로 효과가 있습니다. 대신에, 이러한 조작은 사전에 산모 제품의 축적 동안 oogenesis 동안 수행해야합니다. 이 문서에서는 성인에 생존 가능한 배아를 산출 구체적으로 미성숙 제브라 피쉬 난자의 체외 성숙과 그 이후의 체외 수정을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 표현형 구조를위한 제품 및 태그 구조 시각화의 표현으로 oogenesis 동안 산모 제품의 기능을 조작 할 수 있습니다뿐만 아니라역 유전학 에이전트를 통해 유전자 기능의 저하를이야.

Introduction

동물 개발하는 동안, 계란에 어머니 예금 유전자 제품 (예를 들어, RNA는 단백질 및 기타 생체 분자); 이 제품은 즉시 수정 1, 2 다음 초기 세포 과정에 중요하다. 수정란 (3)에 반응물의 주입을위한 표준 방법을 이용할 경우 모체 제품의 발현과 기능의 조작은 일반적으로 비효율적이다. 대부분의 RNA와 단백질이 oogenesis 동안 난 모세포에 의해 생산, 그래서 사전로드 된 산모의 제품은 이미 성숙 난자에 존재하기 때문입니다. 이 수법의 mRNA의 시비에서 계란에 이미 존재하지 않는 기존의 단백질을 대상으로하기 때문에 이와 같은 기존의 제품은, 예컨대 모르 폴리 노, 안티센스 올리고 (MOS) 등의 유전자를 표적 작용제와 기능적 최저 불 투과성이다. 또한, 많은 초기 배아 프로세스 수정이 influen 할 너무 빨리 이후에 발생할RNA를는 배아의 제 사건에 영향을 충분히 빠르게 제조 될 수 있으므로, 수정란 내로 주입 RNA로부터 유래 된 단백질 부산물 세드릭. 동일한 이유 때문에, 초기 배아에서의 적극적인 역할 중에 시각화를위한 시간에 제조 될 수있다 수정란 내로 주입을 통해 mRNA의 발현 된 단백질 융합체 태그. 계란 활성화 이전에 돌출 된 성숙 난자에 주입이 가능하지만, 유사한 기술적 인 문제와 연관되어 같은 성숙 계란이 이미 어머니의 단백질과 사전로드, 그들은 계란이 끝날 때까지 (즉, 외인성 성적 증명서에서 단백질을 생산) 병진으로 활성화되지 않습니다 활성화. 이러한 이유로, 초기 배 발생에 작용하는 모성 유전자 제품의 조작은 일반적으로 성숙 난자에 oogenesis 동안 수행 될 필요가있다.

OOC의 성숙을 허용 체외 성숙 방법, 이러한 장애물을 극복하는 하나의 방법으로서,, 킬로바이트 단계 IV에서 계란 형성, 제브라 피쉬 년에 설립되었다. 초기 방법은 체외 성숙에 사용할 수 있지만 결과 성숙 계란은 수정 4 유능하지 않았다. 이어서, 시험 관내 성숙 7,8 후 신뢰성 시험 관내 수정 (IVF) 허용 어류 5,6 검색된 난소 유체의 pH를 알칼리, 모방의 pH 9.0 중성의 배양 조건의 조작. 실제로, 체외 -matured 난자는 3, 8 비옥 성년에 생존 가능한 배아를 생성 할 수있다. 이 개선 된 방법은 상기 매트에 노크 기능 매개 MO 모체 유전자의 기능 조작을 통해 외인성 발현 제브라 oogenesis 동안 태그 단백질의 발현 등을 포함하도록 한uring 단계 IV 난자 3 (도 1).

제브라 oogenesis 성숙한 난자 9 (oogenesis의 다양한 단계에 대한 빠른 가이드 표 1 참조)의 형성에 주요한 특성 단의 수를 나타낸다. 간단히, 난자의 발달은 단계 I 난자에 의해 시작되고, 감수 분열의 의향의 I의 diplotene 단계에서 체포된다. 이러한 난자 (또한 단계 II 동안에 개시 피질 과립라고도 함) 피질 폐포의 형성 (단계 IA와 IB 중에 시작)을 통해 전사 활성 증가 및 vitellogenesis (단계 III 중에 개시)를 겪는다. 모세포 성장 I 다시 시작하면 감수, 난자 핵의 분해의 결과로, 본원 소포 (GV)로 지칭 IV 단계 동안 완료된다. 그 후, 감수 분열이 중기 II에서 다시 체포된다. 단계 IV 중 모세포 성장 감수 구속 완료는 성숙 단계의 예 V에 이르게9 g. 모낭 막의 제거는 난소 (10)의 내강에 난자의 방출시 발생 시비 적절한 달걀 활성에 필수적이다. 계란은 자연 교배시 어머니로부터 압출되면, 그들은 활성화된다. 제브라 피쉬, 물에 노출없이 정자 (11)의 존재, 계란 전체 활성화에 충분하다.

시험 관내 조건으로 인해 현재의 축적 크기 (690-730 μm의) 비대칭 위치에 큰 GV가 존재하고, 완전히 불투명 한 외관에 의해 인식 될 수-IV 초기 단계에서 난자의 성숙을 허용 완전히 분해 GV 및 단백질 처리 (12) (도 2c)을 노른자 의한 반투명 외관 특징 성숙 단계 V 계란 노른자 -to 단백질 (도 2B). 이 방식에서, 전체 난소 계속개발의 다른 단계에서 aining 난자는 여성에서 제거됩니다. 난 모세포는 17α-20β 히드 록시 -4- pregnen -3- 온 (DHP), 효과적인 성숙을 유도하는 호르몬 8 개발할 수있다. 이 기간 동안 난자 성숙 식 주입 (예, 캡핑 체외 -transcribed의 mRNA) 또는 역 유전학 에이전트 (예를 들어, MOS)을 조작 할 수있다. 난포 층 자발적 성숙 기간의 끝으로 창고하지 않기 때문에 수동으로 제거해야합니다. defolliculation 후, 체외 수정은 (배아 (E3) 배지에서 본), 물 (13) 계란의 노광 및 정자 용액을 통해 알 활성화를 트리거링함으로써 달성된다. 생성 된 접합체는 배아 발달을 거치며 (모체의 유전자 기능을 조작하는 처리 능력의 평가하고 시각화 태그 모체 제품의 분석을 허용

Protocol

관련 국가 및 / 또는 지역 동물 복지 기관에 의해 정의 된 모든 제브라 피쉬는 좋은 동물 관행에 엄격한에 따라 처리하고, 모든 동물의 작업은 적절한위원회 (위스콘신 - 매디슨 보증 번호 A3368-01 대학)에 의해 승인되었다. 동물은 26.5 ° C로 표준 조건 하에서 유지 하였다.

여성의 1. 사전 선택

참고 : 난 모세포는 성인 여성의 일반적 단계에서 I V로, 발달 단계의 범위에 걸쳐 (그림 2). 새로 개발 된 난자는 코호트 3, 14으로 표시로서 성공적인 자연 교배를 통해 기존 난자의 여성 퍼지 것은 난자 준비의 동기화를 증가시킨다. 약 팔일 후 퍼지 내에서 대부분의 난자는 체외 성숙의 개시를위한 최적 초기 단계 IV,에 있습니다. 이러한 동기화는 난자 그쪽의 수율을 증가t 실험 조작을 촉진, 체외 성숙의 전체 과정을 통해 갈 수 있습니다. 한 쌍의 교배에 물고기 물 조성물 (여기서 생선 설정 방법에 대해서는 앞의 설명은도 13을 참조 바다 염 14g 및 역 침투 물을 1000 L 당의 NaHCO3 150g, pH가 6.5-8.5 (바람직한 범위는 6.8 -7.5) 및 180-360 μS 도전율). 브랜드 등의 알을 참조하십시오. 추가 조리법 (13).

  1. 여덟 10 일에는 체외 배양 조작하기 전에, 상대 탱크에 원하는 변형의 한 남성과 한 여성 물고기를 전송하는 물고기 그물을 사용합니다. 쌍 여러 세트. 짝짓기 탱크 하룻밤을 둡니다. 그들이 저녁 동안과 다음 날의 오후를 통해 짝짓기를 할 수 있습니다.
  2. 짝짓기하는 동안 알을 산출하고 별도의 탱크에 그들을 배치 암컷을 분리하는 물고기 그물을 사용합니다. 식품 혼합물로 하루에 두 번이 여성 피드 containi염수 새우, 생선 식품 조각의 대략 같은 양을 겨. 음식의 양은 공급 시간이 약 20 분, 그러나 더 제공하는데 충분해야한다.

성숙 중간 2. 준비

참고 : 여성으로부터 난자를 제거하는 1 시간 이내에 체외 성숙 실험의 날에 성숙 매체를 준비합니다 (3 절 참조).

  1. 무균 조건 하에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 L 글루타민, pH가 7.0 라이 보 비츠의 L-15 배지 20 ㎖를 추가한다. 10 N NaOH를 사용하여 pH 9.0로 준비한다.
  2. 2 개 개의 분리 된 50ml 원추형 튜브에 라이 보 비츠의 L-15 배지의 pH 9.0, 9 mL를 넣고. 라벨 1 관 "+ DHP"다른 "-DHP."
  3. + DHP 튜브, 17α-20β 히드 록시 -4- pregnen -3- 온의 10 μL (DHP), DH 2 O의 490 μL, 10 % 소 혈청 알부민의 500 μL (BSA)을 추가한다.
  4. -DHP 튜브에 10 ㎎ / ㎖의 겐타 마이신, 400의 100 μL를 추가81, DH 2 O의 L, 10 % BSA 500 μL.

3. 난 모세포의 해부와 체외 문화의 개시

참고 : 체외 배양 실험은 그들이 자연의 짝짓기를 통해 알을 해제 8~10일 후 미리 선택된 여성으로 실시한다. 같은 날 만든 성숙 매체를 사용합니다 (섹션 2 참조). 절개 가능성 자연 교배를 통해 발생하는 프로세스를 모방 (생선 설비에서 미리 설정된 인공 조명에 의해 실험실에서 측정) 물고기 일주 사이클 (13)의 끝 부분에서 시작되는 경우 난자 적당히 성숙. 이 물고기는 표준 라이트 사이클 시설에 보관하는 경우 프로토콜의 가장 단계가 저녁에 수행되어야 함을 의미한다 (예를 들어, 8 오전 10시 빛을 기간 시설에 오후 6시 단계 3.2부터) 다른 작업 시간주기는 적절하게 시간 시프트 라이트 사이클도 가능하다.

  1. 1 개 M 트리스, pH를 9.0로 pH 7.0로 완충 DH 2 O에서 0.2 % tricaine 스톡 용액을 준비하고 4 ℃에서 용액을 유지한다. 이것은 미리 준비하실 수 있습니다.
  2. 시설에서 매일 빛주기의 끝 이전에 실험 0-4 시간을 시작합니다. 250 ㎖의 비이커에, 생선의 물 80 mL의 0.2 % tricaine 스톡 용액의 pH 7.0의 20 mL를 첨가하고 혼합한다.
  3. tricaine 솔루션에 미리 선택된 여성을 전송하고 과다 노출에 의해 그들을 안락사. 길 이동의 정지 후 15 분간 tricaine 용액 암컷 남기기.
  4. 숟가락을 사용하여, tricaine 솔루션에서 안락사 물고기를 수집하고 물고기 물에 잠시 그들을 씻어. 여분의 물을 흡수하는 종이 타월에 물고기를 놓습니다.
  5. 가슴 지느러미의 수준에서 안락사 물고기 목을 벨 깨끗한 면도날을 사용합니다. 해부 가위를 사용하여, 항문 영역의 전방 단부로부터 연장되는 물고기의 복부 측에 세로 절개.
  6. 참고 : 개발 난자를 포함하는 난소는, 내부 체강 내에서 불투명하고 덩어리 진 구조로 표시됩니다.
  7. 해부 집게를 사용하여 부드럽게 여포 대중으로부터 난자를 떼어 놓다. 정렬 초기 IV 모세포 (도 2B, 거의 최대 크기로, GV 고장 전에 어두운 불투명하고 난 모세포 세포질 내에 비대칭 위치한 명백 특징 GV). 초기 단계 (도 2a) 및 (DHP 처리 전에 난소도 2c에 해당하지만, 본 유사) 반투명 성숙 단계 V에서 알 난자 버린다.
    참고 : 난 모세포는 초기 단계 IV, 성숙 단계 V의 oocyt 결과 초기 단계에서 성숙을위한 선택시험 관내 배양 조건 (도 2CD) 후에 ES 3. 단계 IV 난자 적극적으로 제품을 생산하기 때문에,이 단계에서의 조작을 통해 RNA 주입 또는 MO의 도입을 통한 유전자 기능의 감소를위한 외인성 생성물의 발현을 허용한다.
  8. 4 mL의 라이 보 비츠의 L-15 배지 + DHP로 포함하는 제 35 X 10mm의 플라스틱 배양 접시에 초기 단계 IV 난자를 전송하는 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다. DHP의 + 용액을 함유하는 접시 -DHP 매체 최소량의 전송.

4. 난자 Microinjections

참고 : 체외 성숙에 진행 고립 단계 IV 난자 기능 조작 또는 태그 단백질 발현을위한 시약을 소개하는 미세 주입 할 수있다. 등의 mRNA 나 MO (섹션 4 참조)과 같은 시약의 미세 주입은 일반적으로 난자 체외 matu받은 때 행해진 다+ DHP 매체 배급은 앞서 defolliculation한다. 원하는 경우, 난자 성숙하기 전에 조작을 수행하기 위해 더 많은 시간을 허용하기 위해, 주사는 적어도 2 시간 동안 숙성 이전에, -DHP 매체에 행할 수있다. 그들은 이후 + DHP 매체에 전송 될 수 있습니다.

  1. 표준 표현 키트를 사용하여 mRNA를 준비. 50-500 페이지 / μL의 최종 농도로 주입을위한 100 ~ 500 페이지 / μL 재고로 -80 ° C에서 그들을 유지 RNA 수준의 물 (200 페이지 / μL 권장). 제조업체의 지침에 따라 물에 4 NG / μL의 농도 수법의를 준비합니다. 2 NG의 최종 농도로 이들을 주입 / μL (또는 같은 경험적으로 결정됨).
    참고 : 주사는 일반적으로 (섹션 5에서 참고를 참조하십시오) defolliculation하기 전에 + DHP 매체에서 실시된다.
  2. mRNA를 주입하는 경우, 분사 직전에, 0.1 M KCl을 최종 용액을 달성하기 위해 RNA 수준의 역 침투 물을 0.2 M의 KCl을 사용하여 mRNA를 희석.
  3. 주입 수법의 경우, 분사 직전에, 0.1 M KCl을 최종 용액을 달성하기 위해 역 침투 물 및 0.2 M KCl을 사용하여 원하는 농도로 희석 MO들.
  4. 수동으로 미세 겸자와 난자를 보유하고 인출 유리 모세관 피펫으로 만든 바늘을 사용하여 야생형 단계 IV 난자로 약 1 거리 nL 주입.
    1. 이전 피쉬 초기 배아 (15)에 주입 표준 프로토콜에 기재된 바와 같이, 가열 된 유리 모세관 튜브를 당기는 주입되는 용액을 로딩하고, 겸자와 바늘 끝이 파손되어 유리 바늘을 준비한다.
      참고 : 바늘이 점진적으로 테이퍼보다는 갑작스러운 일이 있다면 그것은 도움이됩니다; 이 바늘 끝의 휴식의 장소의 측면에서 더 많은 유연성을 허용하고 또한 주입 된 배아의 손상을 방지하는 데 도움이됩니다. 동일한 니들 배아 주사제로서는 용액을 사용하여 상기 미리 결정함으로써, 주입 볼륨을 조절원하는 양을 생산하는 마이크로 인젝터 압력 설정. 이러한 설정에 의해 결정될 수있다 모의 주입 이전에 15 바와 같이, 현미경 스테이지 교정 슬라이드 (0.01 mm) 및 주입 용액의 볼 루스에 원하는 직경을 얻기 위해 마이크로 인젝터의 설정을 조정하는 미네랄 오일 방울로.

5. 난자 성숙과 Defolliculation

참고 : 난자 성숙 과정에서 난자가 성공적으로 배양 조건의 평가를 허용하는, 점진적으로 반투명하게 될 것이다.

  1. 26.5 ℃에서 + DHP 매체 난자, 난자가 그대로 유지되도록하기 위해 주기적으로 (30 분마다)에 의하면 점진적 반투명 됨으로써 적절한 성숙을 겪고있다 (도 2C 참조) (적절한 주입이 경우 등) 성숙 배양을 계속 .
    1. 파스퇴르 피펫 어떤 용균 난자를 제거하고 폐기실험실 폐기물 비커에 매체의 품질을 유지합니다. 난자 용해의 양에 따라, 맑은 용액을 유지하기 위해 신선한 + DHP 매체의 약 절반 볼륨으로 배양액을 교환하십시오.
    2. 난자의 대부분은 반투명이되어 더 이상 알 수있는 GV가 (DHP의 치료에 약 2 시간을, D에 비해 그림 2C 참조)까지 체외 성숙 할 수있게합니다. 투과광 광학 ​​장치 해부 현미경을 볼 수 있습니다.
  2. 각각의 성숙 난자로부터 최 모낭 막을 제거한다. 난자와 막 사이에 증가 된 공간 영역에서 난포 막에서 눈물을 만들기 위해 여분의 미세 집게를 사용합니다. 막의 일부를 박리하고, 박리 부분을 누르면서 막 밖으로 난자 롤.
    참고 : 기본 융모막 멤브레인이 과정에서 계란과 긴밀한 관계를 유지 일반적 것이다; 계란 행위 후ivation는, 상기 배아의 보호 층을 형성하기 위해 확장된다.
  3. (전형적으로 20 미만 μL 약 5-10 성숙한 난자 전송) 매체의 최소한의 볼륨으로 이동 defolliculated 모세포 배양 (+ DHP) 중 몇 방울 배양 접시 및 수정을 진행.

체외 배양 난자 제 시비

참고 : 얼음에 정자 솔루션, 약 2 시간 동안의 효능을 유지 아래 준비했다.

  1. 앞서 16, 17 바와 같이, 행크스 용액 500 μL 다섯 개 수컷에서 사용 고환 defolliculation 위하여 난자 성숙 단계의 끝 전에 가까운 정자 용액을 준비한다.
  2. + DHP 문화 매체에 defolliculated 난자에 정자 솔루션의 10 ~ 50 μL를 추가합니다. 10 초를 기다립니다.
  3. 피펫을 사용하여 난자로 배아 (E3) 매체의 몇 방울을 추가합니다. 와줘 1 분을 기다린 후 홍수E3 매체 먹었다.
    주 : 5 mM의 염화나트륨, 0.17 mM의 KCl을 0.33 mM의 CaCl2를 0.33 mM의 황산, 1-5 % 메틸렌 블루 (13)를 다음과 같이 E3 배지의 조성이다.
  4. 반복 수정 된 배아의 큰 숫자를 얻기 위해 5.3, 6.2, 6.3 단계를 반복합니다.
  5. 기름지게 배아 개발을 허용합니다. 이전에 수정 (17, 18)을 준비에 기재 한 바와 같이, 성공적인 수정을 보장하기 위해 절단 단계를 통해 진행을 관찰하는 투과광 광학 장치 해부 현미경을 사용합니다.

Representative Results

위에서 설명한 절차가 성공하면, 배아뿐만 아니라 포스트 수정 (HPF) 24 시간에서 같이 틀에 박힌 초기 배아 분열 패턴 (18)의 모양을 확인하기 위해 절단 단계에서 관찰 할 수 결정하기 위해 적절한 개발을 확인합니다 기본적인 몸 계획. 이 절차는 난자의 개발 과정 등의 mRNA와 수법의 같은 시약의 주입을 통해 기능 연구를위한 모성 제품의 조작이 가능합니다.

기능 연구를위한 모성 제품의 조작 :

야생형 및 돌연변이 제품 mRNA의 코딩은 감수 분열 및 초기 배아 단계에서 모체의 유전자 기능의 조작의 효과를 테스트하는 시험 관내 성숙 된 난 모세포에 주입 될 수있다. 예를 들어, 야생형 배아 WI로 주입 될 수있다LD 형 제품의 mRNA 과발현의 효과를 테스트하기 위해 또는 돌연변이 RNA 이러한 공정에서 지배적 전위 (예를 들어, 중 - 함수 얻고 antimorphic) 효과를 테스트하기 위해. oogenesis의 단계 IV에서 배양 조건을 개시 만 난자 (성숙 단계 V 난자으로도 2b를 개발할 수 있지만, 시험 관내 배양에서 난 모세포는 주입의 mRNA에서 GFP 발현에 의해 도시 된 바와 같이, 난자 개발 과정 외래의 mRNA로부터 단백질을 생산할 수 -2D는) 또한 나이 르 등. 3 참조. mRNA의 주입을 통해 야생형 산물의 발현은 또한 클로닝 위치 3,24 중에 유전자 신원 확인 모체 효과 돌연변이 구조를위한 수단이된다. 이 경우, 야생형의 mRNA는 야생 형 제품이 돌연변이 표현형을 구출 할 수 있는지 여부를 테스트하는 동형 접합 돌연변이 암컷의 난자에 주입된다. 이 유전자 구조가 도시된다 <AurB mRNA를 주입 강한>도 3A-3C는, 그 대응하는 유전자, 세포 섬 (CEI) (도 3A-3C)에 돌연변이 표현형 효과를 구하기 위해 도시된다. 대조군의 배아는 해당 돌연변이 표현형 3 보여 개발할 수있다. 돌연변이는 또한 RNA 변이 제품 야생형 생성물에 의한 것과 구조의 정도를 비교함으로써, 부분적인 기능을 유지하고 있는지 여부를 테스트 돌연변이 난 모세포 내로 주입 될 수있다.

개발 된 난자에 주입의 mRNA로부터 단백질 발현은 거의 또는 전혀 지연이 발생하는 것으로 나타납니다. 강한 GFP 발현에 관계없이 난자 (3)의 발전 단의 상응 mRNA의 주입 2 시간 이내에 관찰되었다 (도 2B-2D]. 또한 나이 르 3 참조). 같은 mCherry 같은 제품 :Sas6 및 Birc5b (잡종)는 : GFP는 수정 후 제 배아 세포주기 3, 25시 즉시 관찰 될 수있다. oogenesis 중의 mRNA의 주입은 셀룰러 섬 / aurB 3 쓸데 사이클 / lrmp 24 모체 제품의 경우에서와 같이, 관계없이 융합 태그 부분의 바로 수정 후에 기능적 단백질의 제조에 이르게하고, 잡종 / bir5b 25. 번역 차단 / dhx16 미션 임파서블 3의 경우와 같이, 쓸데없는 사이클 / Lrmp 3 및 배아의 후기 단계에 도시 된 바와 같이, MO들도 즉시 수정 후 효과를 갖는다. 성숙 난자에 주입 할 때 접속자 차단 모스, 단계 IV에서의 난자 것으로 인해 이미 존재하는 모성 성적 성숙, 모체 기능에 영향이 없을 수도 <SUP 클래스 = "외부 참조"> 3.

morphants의 발생 :

이미 확인 된 돌연변이 유전자에 상응하는 MO를 사용하는 경우, morphant 표현형 돌연변이 표현형을 모방 할 것으로 예상된다. Morphants는 MO를 제어 uninjected 배아 및 표준 주사와 비교된다. 해당 돌연변이 돌연변이 표현형 쓸데주기 (도 3d-F)을 모방 한 난자에 Lrmp MO의 주입에 의해 도시 된 바와 같이 번역 차단 모르 주입 성공적으로 알려진 돌연변이 표현형 3 phenocopy있다. 의 MOS 특이성 (이전에 검토) 배아로 MO들 19, 20을 주입 할 때 사용 된 것과 동일한 접근 방식을 통해 결정될 수있다.

형광 표지 된 융합 단백질의 발현 :

도 3G, mRNA를 형광 단백질 (예 : GFP 및 mCherry)에 융합 관심 유전자 산물을 코딩하는 것이 아니라 야생형 또는 초기 배아에서 해당 제품을 시각화하는 돌연변이 모세포 (즉, 세포 내 라이 제이션 패턴을 반영하거나 주입 할 수있다 및 3H). 비슷한 융합을 코딩하지만 돌연변이 대립 유전자를 포함하는 mRNA를 유사 돌연변이가 잠재적 인 세포 내 지역화에 영향을 미치는 여부를 테스트하는 표현 될 수있다.

그림 1
그림 1 : 체외 난자 성숙합니다. 시험관 난자 성숙에 관여하는 다양한 단계를 도시 한 개략도. 성인 여성은을 위해 미리 선택되어 알을 낳는 이미 성숙하고 프로에 한 계란을 제거하기 위해, 절차 8 일 전에새로운 난자 개발을 티끌. 난소 개발 모세포를 함유 암컷에서 제거하고 시험 관내에서 난자 성숙을 유도하는 호르몬 DHP를 함유하는 매체에 전사된다. 여성 및 직전 또는 난자 성숙시에서 제거한 후, 난자 모체 요소의 기능 조작을위한 RNA 제품 및 기타 시약 주입 될 수있다. 성숙한 난자를 수동으로 defolliculated 및 수정 된, 가능한 배아를 생성하기 위해 정자 용액을 시험관에서 수정 된 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
시험관 난자 성숙과 주조의 mRNA에서 제품의 발현 : 그림 2. (A)가 난소로부터 관찰 단계 I-III에서 난자여성 사일 후 정화 (DPP). (B)는 8 DPP 여성에서 난소 관찰, 단계 IV에서 난자. 생식 소포 (GV, 화살촉)를 명확하게 볼 및 편심 위치를 차지한다. 단 III에서의 난자 (A)도 명백 GV를 나타내고 있지만 난자에 중심이 발견된다. (B)의 단계 IV 난자는 성숙한 난자 (C)에 비해 최대 근처 인 크기를 갖는다. (CD)의 mRNA의 전사 관내 (C, 가시광에서 스테이지 V (난자 성숙) (B)에서와 같이, 단계 IV에서 개시 및 GFP-인코딩 성숙 중에 주입 관내 성숙 상태에서 2 시간 후에서 난자 단, D, 가시광 및 GFP 형광)의 오버레이. GV는 단계 IV 난자보다 불투명 단계 V 난자에 더 이상 분명하지 않습니다. 주입 된 난자는 GFP 단백질 (D)을 표현한다. 성숙 단계 IV 난자의 Defolliculation은 DES 인프로토콜 섹션에서 cribed. 스케일 바 = 300㎛ 인. 모든 패널은 나이 르 등 알 3에서, 허가, 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 체외 난자 성숙을 통해 조작 및 모자 제품의 시각화. (A - C) 단계 IV의 CEI / aurB 난자에 야생형 aurB mRNA의 주입을 통해 섬 세포 / 오로라 B 내의 돌연변이에 의해 야기 모체 효과 표현형의 구조. 멤브레인 (녹색) 강조 항 ß 카테닌 항체 가시화 65 MPF 고정 blastodiscs 동물 뷰를 도시 병합 된 이미지, 항 - 튜 블린 항체 α는 (미세 소관을 나타내도록적색), 및 DAPI는 DNA (청색)을 지정. 정상 고랑 성숙을 나타내는 야생형 배아 (A) β 카테닌 축적. (B)는 CEI uninjected / aurB 단계 IV 난자에서 CEI / aurB 배아는 β 카테닌이 누적되지 않는 부분, 기초 고랑을 나타낸다. 야생형 aurB mRNA를 밭고랑에 강력한 β 카테닌의 축적을 도시와 주입 CEI / aurB 난자로부터 (C)를 구출 CEI / aurB 배아. (D - F) 모르 단계 IV 모세포 내로 주입 Lrmp에서 쓸데없는 사이클 / lrmp의 돌연변이에 기인하는 모성 - 효과 Phenocopy. 항 - 튜 불린 항체 γ 가시화 70 MPF 고정 blastodiscs, 동물의 모습을 보여주는 이미지를 병합 DNA (블루)를 지정하는 중심체 (적색) 및 DAPI를 나타내는. 야생형 배아, γ-튜 불린, centrosomal 재료 마커 각각 핵 연관에서 (D). (산모 효과 FUE 돌연변이 체에서 E)는 전핵 융합은 융합 부모의 프로 핵 및 감수 분열 II에 대한 극체에 해당하는 DNA 라벨 2 ~ 3 패치의 결과로 실패합니다. Lrmp의 morphants 산모 Lrmp 기능이 억제되는 경우, 유사하게 핵 이외에, γ-튜 불린와 연결 실패, 분할에 실패하고 (F). 초기 배아에서 모체 제조 상품 (GH) 가시화. 외래의 mRNA로부터 Sass6-mCherry 단백질 IV 난자가 중심 소체에 편재 스테이지 주입. 중심체 (녹색) 강조 항 γ - 튜 불린 항체로 가시화 40 MPF 고정 blastodiscs 동물보기, mCherry 형광을 나타내는 병합 된 이미지는 Sass6 (적색) 표시하고, DAPI는 DNA (청색)을 지정. (G)는 Sass6-mCherry 단백질이 핵 (화살표) 측면 부위에 중심체 마커 γ-tubulin에 의해 표지하는 초점 편재 나타냈다. (H 등은 나이 르로부터 허가, 복제 하였다 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Oogenesis의 단계 난자 지름 (μm의) 주요 랜드 마크 (들)
1A - Prefollicle 7~20 활성 전사의 개시, 핵소체 축적
1B - 난포 20-140 염색체의 Decondensation
II - 피질 치조 140-340 피질 폐포 생산
III - Vitellogenesis 340-690 난황 전구 단백질과 지질의 축적 ooplasm 어둡게
초기 IV - 난자 성숙 690 (730) (하부 영역) 새싹 소포의 비대칭 현지화
초기 IV - 난자 성숙 690 (730) (상부 영역) 어린 싹 소포는 중기 II에서 체포 사라
V - 성숙한 난자 ~ 750 Ooplasm / 노른자는 반투명하게

표 1 : 얼룩말 난자 개발의 랜드 마크물고기.

Discussion

위의 프로토콜은 따라서 초기 제브라 피쉬 배아에서 모성 유전자 제품의 연구를 허용, 수정 전에 유전자 제품의 조작을위한 것입니다. 이전 연구는 체외 4 난자를 성숙 할 수 있었다; 이 프로토콜은 난자 8 성숙 관내의 후속 수정이 가능하도록 수정되었다. 이것은 차례로 초기 배아 3 모계 상속 제품의 기능 조작 및 시각화를위한 시약의 주입이 가능합니다. 이 방법에 의한 배아는 생존 할 수 있으며 비옥 한 성인이 될 살아남을 수 있습니다. 건강한, 비옥 한 성인 (게시되지 않은 관찰)이되었다 약 절반의 그 단계에서 부레 인플레이션에 의해 평가로 예비 실험에서,이 과정에서 파생 된 수정 된 배아의 약 절반은 개발의 5 일에 생존했다.

여러 가지가 있습니다의 중요한 단계는 프로토콜 고려해야한다. 적절한 단계에서 난 모세포는 여성이 최근 성관계를 한 경우 농축 될 수있다 성숙 (초기 단계 IV)를 시작,하지만 8 전 DPP합니다. 최근에 성관계를하지 않은 생선을 사용하여 성숙을받지 않습니다 계란 (14), 퇴화 될 수 있습니다. 8 이하 일 이내에 성관계 여성은 단계 III 이하로 계란의 대부분이있을 것이다, 따라서, 계란은 체외에서 제대로 성숙되지 않습니다. 팔일 종래 정합 암컷 난소 초기 단계 IV에서의 난자의 최적 비율을 가질 것이다. 이들은 그들의 불투명도 및 편심 위치 (도 2b)에서 GV의 존재를 인식 할 수있다. 난자는 현미경 졸업 마이크로 슬라이드 상에 배치하고 준비 표준 지침 (표 1)과 비교하여 난자 단계 판단은 또한 크기 측정에 의해 도움을받을 수있다. 그러나, 초기 단계 IV 난자는 거의 최대 크기가 성숙 대비해야(상대 투명도 및 GV 부족 인식;도 2C) 난자 일반적 직접 난자 크기 측정의 필요성을 제거하는, 상기 한 바와 같이 용이하게 인식된다.

체외 성숙에 여성의 난자 기증자가 적응하는에 일광주기의 마지막 몇 시간 이내에 시작해야합니다. 난 모세포는 빛 사이클의 아침 기간 동안 배양하면, 가난한 수정률에 반영, 제대로 성숙되지 않습니다. 체외 난자 성숙 방법 주기성 의존성 이유는 알 수 있지만, 아마도 oogenesis 21 순환 동안 유전자 발현과 관련된 생체 달걀 성숙 기본 주기성 편향을 반영하지 않는다. 적절한 난자의 준비에도 불구하고 체외 성숙에 성공 받아야 실패한 난자의 일반적인 원인은 DHP이 만료 된 것입니다. DHP 호르몬은 일반적으로 년 후에 만료 및 효과를 보장하기 위해필자 성숙, 작업 배치는 사용하기 9 개월 이내에 교체해야합니다.

이 방법의 목적은 모체 제품의 조작 기능 때 난자 사출 다른 중요한 단계이다. 이 절차는 0-30 MPF에 수정란 표준 주사에 대한 다를 요구 사항이 있습니다. 난자 주입하는 핵심 요소는 라이 보 비츠의 L-15 배지 22, 23과 계란 조기 활성화를 유도하지 않는 조건에서 주사를 수행 할 필요가있다. 그들은 난소에 포함되어 있기 때문에, 성숙 된 난자는 주사로 특정 과제를 포즈. 프로토콜은 상기 제 난소로부터 난자 해리하고 주입하는 동안 각각의 집게 별도로 난자 해리 들고 나왔다. 이 기술은 최소한의 처리와 적절한 단계에서 미리 정렬 된 난자를 잘 작동하고 있습니다했다. 다른 방법도 사용할 수 있으며, 이러한ⅰ) 표준 주입에 배치 난자 아가 관내 성숙 배지에서 유지하면서 이러한 대안적인 방법에서 통 지원 주입 동안 난자의 수직 벽 (난자 사출 판에 전사 할 필요 15) 및 II를 쓰루로 : ) 난자는 난자는 양자 주입 후 분해되어야이 방법에서, 주입 된 난 모세포와 접촉 (않도록 주입 중에 집게로 유지 될 수 난소 질량에 부착 DHP 노출을 용이하게 유지하고 그들의 defolliculation 있도록 허용 자체 IVF 필수). 이 단계에서 융모 막 9 충분히 개발되어 있지 않기 때문에이 특정 과제에도 불구하고, 단계 IV 난자 용이, 주사 바늘 가능성이 관통 할 수있다.

현재 성숙 프로토콜의 하나의 한계는 시험 관내 성숙 상태에 적절한 난자 발전을 촉진하는 점이다난자의 성숙이 단계 IV 이전 단계에서 시작될 때 생성 할 수 없습니다. 난 모세포들은 (340 대 690 μm의 범위에 대응 vitellogenesis) 단계 III 중에 발생 520 ㎛의 직경에 도달 할 때 성숙을 진행하여 DHP에 반응 할 능력이 될 9. 그러나, 수정 3 유능하지 않은 난자의 단계 III 난자 결과의 문화. 대해서만 체외 배양 단계 IV (도 2B)에서 개시된다 성숙 단계 V 난자 (도 2CD)으로 발전 할 수 난자. 이는 단계 III는 vitellogenesis와 난자의 성장 9에 필수적이라는 사실과 관련이있을 수 있습니다. 따라서, 본 문서에 제시된 시험 관내 난자 성숙 과정은 난자 IV (B)가 아니라 이전 단계에서의 난자 (단계 I과 단계의 시작 인구 표기 - III]으로 나뉘어진다 전자 체외 문화의 성숙 방법 개선은 미래에 따라서 체외 성숙 접근 방식의 힘을 확장, 이전 단계에서 난 모세포 배양의 시작을 허용 할 수있다.

제시된 방법의 또 다른 제한은 수정과 관련된 후속 단계를위한 필수적이라고 defolliculation은 현재 절차의 속도 - 제한 단계이다. 모낭 막을 현상 난자 주위의 투명층이며, 제거 지루할 수있다. 이 멤브레인이 완전히 제거되지 않으면, 계란은 완전히 활성화 및 수정 된이되지 않습니다. 이 확장 할 융모막의 실패와 불규칙하게 배치, 밭고랑처럼 세인트의 개발에 의해 분명하게 만들어미 수정 된 배아 (11)의 특성 ructures (pseudocleavages). 제노 푸스에서 사용 된 것과 같은 콜라게나 제와 같은 효소 defolliculation 방법이 시도되어왔다. 그러나, 우리의 손에,이 기술은 성공하지 않았으며 따라서 우리는 수동 defolliculation에 의존하고 있습니다. 수동 defolliculation은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요이기 때문에 체외에서 난자 성숙 후 수정란의 큰 배치를 얻기가 어렵다. 때문에 수동 defolliculation에 의해 부과 된 시간 제한에, 우리는 현재 5 ~ 10 알의 작은 일괄 적으로 한 번에 몇 defolliculated, 성숙 계란을 기름지게. 이 절차와 효소 defolliculation의 통합 가능성이 대폭 수율과 전반적인 사용 용이성을 증가시킬 것입니다.

체외 -matured 난자의 수정 후 생성 된 배아가 가능한 성인이 될 수 있지만, 우리는 체외 수정 후 배아의 일부가 할 수 있습니다 정상적으로 적시에 나눌 수 없습니다. 현재는 그의 증식이 방법에 의해 유도 된 배아의 발달보다 강력한 패턴을 초래할 수 체외 난자 성숙 발사 포함 라인을 선택한다.

절차는 돌연변이 (24), (25)의 수에 대한 명확한 구조 또는 단백질 현지화의 시각화를 위해 허용했다. mRNA의 주입에 의해 표현되는 제품은 결과 변수 (26)으로 이어질 수 있도록하지만, 일부 유전자 제품 발현의 조절은 매우 중요 할 수있다. 모든 컨트롤 (예를 들어, 단지 불활성 단백질을 코딩하는 그러한 제어 나 MO 등의 효과를 얻지 못하고 예상되는 실험에 사용 된 것과 유사한 특성을 갖는 시약 또는 RNA를 주입 배아 등 염두하는 것도 중요 GFP 등), 기본 변화는 잘못된 결론으로 ​​이어질 수 있기 때문이다.

NT "> 시비 다음 시험 관내 조작을 수반 접근은 효과적으로 제품을 감소되지 않을 수정란 내로 RNA 모스 또는 단백질을 주입하는 표준 방법이 이미 알 축적 모계 증착 제품의 경우에 특히 유용하다. 이러한 CRISPR 돌연변이 생성과 같은 다른 최근에 개발 된 방법은, 또한 모체 발현 유전자 26 돌연변이 조건을 생성하는데 효과적이다. 그러나,이 방법은 물고기의 몇몇 세대의 성장을 필요로한다. 시험관 난자 성숙 기법 급속 기능 조작을 허용 구조 산모 효과 돌연변이 phenocopy뿐만 아니라 초기 배아에서 RNA와 단백질의 발현을 포함한 발현 모체의 유전자의 기능을 연구한다.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

Acknowledgments

우리는이 프로젝트를 촉진하는 수단이 있었다 Pelegri 연구소와 생선 시설 관리 직원의 회원들에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 프로젝트에 대한 지원은 FP에 NIH R56 GM065303 및 ELW에 대한 NIH 2 T32 GM007133, NIH CCE 5 F31 GM108449-02 및 NIH 2 T32 GM007133 및 NIH RO1 GM065303에 의해 제공되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO2-7H2O Sigma 63138
NaHCO2 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4 - 5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 mL any maker
Ice bucket any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
beakers, 250 mL (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
Leibovitz'z L-15 medium Thermofisher 11415064
NaOH  Sigma 221465 for pH'ing
BSA Sigma A2058
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) Sigma P6285
gentamicin Sigma G1272
Injection Apparatus Eppendorf FemtoJet or equivalent
Capillary Tubing for injection needles FHC 30-30-1 or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm
Needle puller Sutter Instruments Model P-87 any maker
Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips any maker
Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips any maker
Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips any maker
Conical tubes 15 mL any maker
Conical tubes 50 mL any maker
plastic pipette 10 mL with bulb any maker
plastic pipette 20 mL with bulb any maker
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm AmScope MR095 or equivalent
Reagents for fish water:
Instant Ocean Salt Drs. Foster & Smith  CD-116528
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761-1KG
Reagents for E3 medium:
NaCl Sigma S5886-1KG
KCl Sigma P5405-500G
CaCl2, dihydrate Sigma C7902-500G
MgSO4, heptahydrate Sigma 63138-250G
Methylene Blue Sigma M9140-25G
Fish Food:
Frozen brine shrimp Brine Shrimp Direct FBSFKG50
Tetramin Flakes Drs. Foster & Smith 16623

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References

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Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55213, doi:10.3791/55213 (2017).More

Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55213, doi:10.3791/55213 (2017).

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