Summary
Ett optimerat protokoll för mognaden av zebrafisk oocyter som används för manipulering av matemella genprodukter in vitro presenteras här.
Abstract
Cellulära händelser som äger rum under de tidigaste stadierna av animaliskt embryonal utveckling drivs av maternella genprodukter deponeras i utvecklings äggcellen. Eftersom dessa händelser är beroende av moderns produkter som normalt fungerar mycket snart efter befruktningen, som preexist inne i ägget, standardmetoder för uttryck och funktionsnedsättning som innebär injektion av reagens i det befruktade ägget är vanligtvis ineffektiva. I stället måste sådana manipulationer utföras under oogenes, före eller under ansamling av moderns produkter. Denna artikel beskriver i detalj ett protokoll för mognaden in vitro av omogna zebrafisk oocyter och deras efterföljande in vitro-fertilisering, vilket gav viabla embryon som överlever till vuxen ålder. Denna metod tillåter den funktionella manipulering av maternella produkter under oogenes, såsom uttrycket av produkter för fenotypisk räddning och taggade konstruktet visualisering, samt ens minskningen av genfunktionen genom omvända-genetik medel.
Introduction
Under djurutveckling, moder insättningar genprodukterna (t ex RNA, proteiner och andra biomolekyler) i ägget; dessa produkter är viktiga för tidiga cellulära processer omedelbart efter befruktning 1, 2. Manipulation av uttryck och funktion av moderns produkter är typiskt ineffektiva vid användning av en standardiserad metod för insprutning av reagens in i befruktade ägg 3. Detta eftersom de flesta RNA och proteiner produceras av äggcellen under oogenes, så förinstallerade moderns produkter finns redan i den mogna ägg. Sådana redan existerande produkter är ogenomträngliga för funktionell knockdown med genen målsökande medel, såsom morfolino antisensoligos (MOS), eftersom MO: rikta mRNA, inte den tidigare existerande protein som redan finns i ägget vid befruktning. Dessutom har många tidiga embryonala processer sker för tidigt efter befruktningen att influenced av proteinprodukter som härrör från RNA injiceras i det befruktade ägget, som RNA inte kan produceras tillräckligt snabbt för att påverka de första händelserna i embryogenes. Av samma skäl, märkt proteinfusioner som uttrycks genom en mRNA injektion i det befruktade ägget kan inte framställas i tid för visualisering under deras aktiva roll i det tidiga embryot. Injektion i extruderade mogna oocyter före ägg aktivering är möjlig men är associerad med liknande tekniska frågor: sådana mogna ägg är redan förinstallerad med maternal protein, och de kommer inte att bli translatoriskt aktiv (dvs producera protein från exogena transkript) tills efter ägg aktivering. Av dessa skäl måste manipulation av moderns genprodukter verkar i början av embryogenes typiskt utföras under oogenes i mognande äggcellen.
Som ett tillvägagångssätt för att övervinna dessa hinder, in vitro-mognads metoder, som möjliggör för mognaden av OOCytes från steg IV till ägg bildning, har etablerats i zebrafisk. Tidiga metoder tillåts in vitro mognad, men de resulterande mogna äggen var inte kompetent för befruktning 4. Därefter manipulation av odlingsbetingelser från neutralt till pH 9,0, imitera det alkaliska pH-värdet i äggstocks fluiden som finns i fiskarter 5, 6, tillåts för tillförlitlig in vitro-fertilisering (IVF) efter in vitro-mognad 7, 8. I själva verket kan in vitro -matured oocyter ge livsdugliga embryon som överlever till vuxen ålder och som är fertila 3, 8. Detta förbättrade förfarande har vidare anpassas för att inkludera den funktionella manipulation av maternella gener, uttryckningen av märkta proteiner under zebrafisk oogenes genom exogen expression, och MO-medierad funktionell slå ner i mattannder steget IV oocyter 3 (Figur 1).
Zebrafisk oogenes uppvisar ett antal karakteristiska steg som leder till bildningen av mogna oocyter 9 (se tabell 1 för en sammanfattning av de olika stegen i oogenes). I korthet är äggcellen utveckling initieras av steg I äggceller och greps vid diplotene skede av profas I av meios. Dessa oocyter undergår tillväxt genom aktiv transkription (initieras under stadier IA och IB), bildandet av kortikala alveoler (även känd som kortikala granuler, som initierades under steg II), och vitellogenesis (initierats under steg III). Oocyt tillväxten är avslutad under steg IV, när meios I återupptas, vilket resulterar i demontering av oocyten kärnan, hänvisad till som den germinala vesikeln (GV). Därefter är meios greps igen på metafas II. Fullbordandet av oocyt tillväxt och meiotiska stillestånd under steg IV leder till ett moget stadium V t.ex.g 9. Avlägsnandet av den follikulära membranet inträffar under frisättningen av oocyten in i lumen av äggstocken 10 och är nödvändig för befruktning och korrekt ägg aktivering. När äggen extruderas från modern under naturlig parning blir de aktiveras. I zebrafisk, är exponering för vatten som är tillräcklig för full ägg aktivering, oavsett närvaron av spermier 11.
In vitro-villkor som för närvarande gör det möjligt att mognaden av oocyter från tidigt stadium IV-som kan kännas igen av deras storlek (690-730 um), närvaron av ett stort GV i en asymmetrisk position och en fullt opakt utseende på grund av ansamling av äggula proteiner (Figur 2B) -till det mogna stadiet V ägg, kännetecknad av en fullständigt demonteras GV och ett genomskinligt utseende på grund av äggula proteinbearbetning 12 (figur 2C). I detta tillvägagångssätt, hela äggstockar fortsaining oocyter i olika stadier av utveckling avlägsnas från honor. Oocyterna får utvecklas i 17α-20β-dihydroxi-4 pregnen-3-on (DHP), en effektiv mognad framkallande hormon 8. Under denna period, kan förfall oocyter manipuleras genom insprutnings av uttryck (t ex, capped, in vitro -transcribed mRNA) eller omvänd genetik medel (t ex MOS). Den follikulära skiktet inte spontant skjul mot slutet av mognadsperioden, så det måste avlägsnas manuellt. Efter defolliculation, är in vitro fertilisering uppnås genom att utlösa ägg aktivering genom exponering av äggen till vatten (närvarande i embryonal (E3) medium) 13 och en spermielösning. De resulterande zygoter genomgår embryonal utveckling och göra det möjligt att utvärdera möjligheten för behandlingar för att manipulera moderns geners funktion och för visualisering och analys av märkta maternella produkter (
Protocol
Alla zebrafisk hanterades i strikt överensstämmelse med god djur praxis enligt definitionen i de relevanta nationella och / eller lokala djurskyddsorgan, och alla djur arbete godkändes av behöriga utskott (University of Wisconsin-Madison försäkran nummer A3368-01). Djuren hölls under standardbetingelser vid 26,5 ° C.
1. Första urval av kvinnor
OBS: Oocyter i vuxna honor typiskt spänner över ett intervall av utvecklingsstadier, från steg I till V (figur 2). Spolning honorna av redan existerande oocyter genom en framgångsrik naturlig parning ökar synkronisering av äggcellen byggnadsställning, som nyligen utvecklings oocyter visas som en kohort 3, 14. Inom cirka 8 dagar efter purge, de flesta oocyter är i tidigt stadium IV, som är optimal för initieringen av in vitro-mognad. Sådan synkronisering ökar utbytet av oocyter that kan gå igenom hela processen av in vitro-mognad, vilket underlättar experimentell manipulation. Se tidigare beskrivningar 13 för detaljer om att etablera fisk i parade parningar och på fisk vattenkomposition (här, 14 g havssalt och 150 g NaHCOs 3 per 1000 L av omvänd-osmos vatten, pH 6,5-8,5 (föredraget intervall: 6,8 -7,5) och en konduktivitet på 180-360 | iS). Se Brand et al. 13 för ytterligare recept.
- Åtta till tio dagar före odling in vitro manipulation, använder en fisk nät för att överföra en enda manlig och en enda kvinnlig fisk av den önskade stammen till en passande behållare. Par flera uppsättningar. Lämna dem i parningstanken under natten. Låt dem para under kvällen och genom eftermiddagen följande dag.
- Använd en fisk nät för att separera honor som ger ägg under parning och placera dem i en separat tank. Mata dessa kvinnor två gånger dagligen med en livsmedelsblandning containing approximativt en lika stor mängd av artemia och fisklivsmedels flingor. Mängden mat bör vara tillräckligt för att ge ca 20 min, men inte mer, av matdags.
2. Framställning av Mognad Medium
OBS: Förbered mognadsmedium på dagen för in vitro-mognadsexperiment inom en timme för avlägsnande av oocyterna från den kvinnliga (se avsnitt 3).
- Tillsätt 20 ml av Leibovitzs L-15-medium med L-glutamin, pH 7,0, till en 50 ml koniskt rör under sterila betingelser. Föra den till pH 9,0 med 10 N NaOH.
- Lägga 9 ml av Leibovitzs L-15-medium, pH 9,0, till 2 separata 50 ml koniska rör. Etikett en tub "+ DHP" och den andra "-DHP."
- I + DHP röret, tillsätt 10 | il av 17α-20β-dihydroxi-4 pregnen-3-on (DHP), 490 mikroliter av dH 2 O och 500 mikroliter av 10% bovint serumalbumin (BSA).
- I -DHP röret, tillsätt 100 | il av 10 mg / ml gentamycin, 40081; L av dH 2 O och 500 mikroliter av 10% BSA.
3. Dissekering av Oocyter och initiering av in vitro-kultur
OBS: in vitro-kultur experiment utförs med förvalda honor 8-10 dagar efter att de släpper ägg genom naturlig parning. Använd mognadsmedium gjorde samma dag (se avsnitt 2). Oocyter mogna lämpligt om dissektionen påbörjas nära slutet av fisken dygnscykel (bestämd i laboratoriet genom förinställda artificiell belysning i fiskanläggning) 13, eventuellt härma processer som sker genom naturlig parning. Detta innebär att de flesta steg i protokollet måste utföras på kvällen om fisken är inrymda i en anläggning med en vanlig ljuscykel (t ex början steg 3,2 vid 6:00 i en anläggning med en 08:00 till 10:00 ljusperiod), även om andra arbetstidsperioder är möjliga med en lämpligt tidsförskjuten ljuscykel.
- Bered en 0,2% tricaine stamlösning i dH 2 O, buffrad till pH 7,0 med 1 M Tris, pH 9,0, och hålla denna lösning vid 4 ° C. Detta kan förberedas i förväg.
- Initiera försöket 0-4 h före slutet av den dagliga ljus cykel i anläggningen. I en 250-ml bägare, tillsätt 20 ml av 0,2% tricaine stamlösning, pH 7,0, till 80 ml av fisk vatten och blanda.
- Överför förvalda honor att tricaine lösning och avliva dem genom överexponering. Lämnar honorna i tricaine lösningen för 15 min efter upphörandet av gill rörelse.
- Med hjälp av en sked, samla avlivas fisk från tricaine lösningen och skölj dem hastigt i fisk vatten. Placera fisken på en pappershandduk för att absorbera överflödigt vatten.
- Använd en ren rakblad för att halshugga den avlivas fisk i nivå med bröst fin. Med hjälp dissekera sax, gör ett längsgående snitt på den ventrala sidan av fisken, som sträcker sig från den främre änden till den anala området.
- Med hjälp av dissekera pincett försiktigt dissociera ägg från follikulära massorna. Sortera de tidigt stadium IV oocyter (fig 2B; före GV nedbrytning, vid nära maximal storlek och som kännetecknas av en mörk, opak cytoplasma och en lätt uppenbara GV beläget asymmetriskt inuti oocyt). Kassera oocyter vid tidigare stadier (Figur 2A) och genomskinliga, mogna stadiet V ägg (liknande de i figur 2C men närvarande i äggstockarna före DHP behandling).
OBS: Oocyter väljs för mognad i tidigt stadium IV, så tidigt som resulterar i mogna, etapp V oocytes efter in vitro odlingsbetingelser (Figur 2C och D) 3. Eftersom stadium IV oocyter aktivt producerar produkter, manipulation på detta stadium möjliggör för uttryck av exogena produkter genom RNA-injektion eller för reduktion av genfunktion via införda MO. - Använda ett glas Pasteur-pipett för att överföra de tidiga stadium IV oocyter till en andra 35 x 10 mm plastodlingsskål innehållande 4 ml Leibovitz L-15 medium + DHP. Överföra minimala mängder -DHP medium till skålen innehållande + DHP lösningen.
4. Oocyte Mikroinjektioner
NOT: Isolerad stadium IV oocyter som genomgår in vitro-mognad kan mikroinjiceras att införa reagenser för funktionell manipulering eller märkt protein expression. Mikroinjektion av reagens, såsom mRNA och MO (se avsnitt 4), utförs typiskt när oocyterna genomgår in vitro maturanson i + DHP-medium, före defolliculation. Om så önskas, för att ge mer tid för att genomföra manipulationer före oocytmognad, injektionerna kan också utföras i -DHP medium, före mognad, under åtminstone 2 h. De kan därefter överföras till + DHP medium.
- Förbered mRNA med en vanlig uttrycks kit. Hålla dem på -80 ° C som en 100-500 pg / pL lager för injektion vid en slutlig koncentration av 50-500 pg / pL (200 pg / pL rekommenderas) i RNA-kvalitet vatten. Förbereda MO vid en koncentration på 4 ng / ^ il i vatten enligt tillverkarens anvisningar. Injicera dem vid slutkoncentrationer av 2 ng / mikroliter (eller såsom bestäms empiriskt).
OBS: Injektioner utförs typiskt i + DHP medium före defolliculation (se anmärkningen i avsnitt 5). - Om injicera mRNA, omedelbart före injektionen, späd mRNA med användning av RNA-grade omvänd-osmos vatten och 0,2 M KCl för att uppnå en slutlig lösning av 0,1 M KCl.
- Om injicera MO, omedelbart före injektionen, späd MO till den önskade koncentrationen med användning av omvänd-osmos vatten och 0,2 M KCl för att uppnå en slutlig lösning av 0,1 M KCl.
- Hålla manuellt oocyter med fin pincett och injicera ca 1 nL in i vildtyp steget IV oocyter med användning av en nål gjord med en drog-glaskapillär pipett.
- Förbereda glas nålar genom att dra uppvärmd glaskapillärrör, laddar den lösning som skall injiceras, och bryta nålspetsen med pincett, såsom tidigare beskrivits i protokoll för standard injektion i zebrafisk tidiga embryon 15.
OBS: Det är bra om nålen har en gradvis avsmalning snarare än en abrupt en; Detta ger mer flexibilitet när det gäller placeringen av avbrott i nålspetsen och även hjälper till att förhindra skador på den injicerade embryot. Med användning av samma nål och lösning som för embryo injektioner, justera den injicerade volymen genom för-bestämning avmicroinjector tryckinställningar som producerar den önskade volymen. Dessa inställningar kan bestämmas genom mock-injicering i en droppe mineralolja på ett mikroskopsteget kalibreringsliden (0,01 mm) och justering microinjector inställningar för att erhålla den önskade diameter i bolus injicerad lösning, som tidigare beskrivits 15.
- Förbereda glas nålar genom att dra uppvärmd glaskapillärrör, laddar den lösning som skall injiceras, och bryta nålspetsen med pincett, såsom tidigare beskrivits i protokoll för standard injektion i zebrafisk tidiga embryon 15.
5. oocytmognad och Defolliculation
OBS! Under oocytmognad kommer ägg blivit allt genomskinlig, vilket gör det möjligt att bedöma framgångsrika odlingsbetingelser.
- Fortsätta att inkubera omogna (och, om så är lämpligt, injicerade) oocyter i + DHP-medium vid 26,5 ° C, kontroll periodvis (varje 30 min) för att säkerställa att oocyterna förbli intakt och genomgår riktig mognad genom att bli progressivt genomskinlig (se figur 2C) .
- Ta bort eventuella lyserande ägg med en pasteurpipett och kasta demi ett labb avfallsbägare att upprätthålla kvaliteten på mediet. Byta ut odlingsmediet med approximativt en halv volym av färsk + DHP-medium för att bibehålla en klar lösning, beroende på mängden av oocyt lys.
- Tillåta mognad in vitro för att fortskrida till dess att en majoritet av de oocyter blir genomskinlig och har en GV som inte längre är uppenbar (ca 2 h på DHP behandling, se figur 2C i jämförelse med D). Visa dem under ett dissektionsmikroskop med genomlysning optik.
- Ta det yttersta follikulär membran från varje mognat äggcellen. Använd extra fin pincett för att göra en reva i den follikulära membran i en region med ökad utrymmet mellan äggcellen och membranet. Skala bort en del av membranet och rulla ägget ur membranet medan du håller ned skalade delen.
OBS: Den underliggande chorionic membranet kommer typiskt att förbli i nära association med ägget under denna process; efter ägg ageraivation, expanderar den för att bilda ett skyddsskikt för embryot. - Överföra de defolliculated oocyter i en minimal volym av medium (typiskt, överföra ca 5-10 mogna oocyter på mindre än 20 | il) till en petriskål med några droppar odlingsmedium (+ DHP) och fortsätt till befruktning.
6. Befruktning in vitro Odlade Oocyter
OBS! Spermie lösningen på is, beredd nedan kommer att behålla sin styrka i ungefär 2 timmar.
- Förbereda en spermie lösning nära slutet av oocytmognad steget och före defolliculation använder testiklar från fem hanar i 500 mikroliter av Hanks lösning, såsom beskrivits tidigare 16, 17.
- Lägg 10-50 mikroliter av spermier lösning på defolliculated ägg i + DHP odlingsmedium. Vänta 10 s.
- Med användning av en pipett, tillsätt några droppar av embryonal (E3) medium till oocyterna. Vänta 1 min och sedan översvämma plåt med E3-medium.
OBS: Sammansättningen av E3 mediet är som följer: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, och 1-5% metylenblått 13. - Upprepa steg 5,3, 6,2 och 6,3 för att erhålla ett större antal befruktade embryon.
- Låt befruktade embryon att utvecklas. Använda ett dissektionsmikroskop med transmitterade ljus optik för att observera fortskridandet genom de klyvningssteg för att säkerställa framgångsrik fertilisering, såsom tidigare beskrivits för befruktning 17 och iscensättning 18.
Representative Results
För att bestämma om den ovan beskrivna proceduren är framgångsrik, kan observeras embryona under klyvningssteg för att bekräfta uppträdandet av den stereotypa tidig embryonal klyvningsmönstret 18, såväl som vid 24 timmar efter befruktning (HPF) för att bekräfta den korrekta utvecklingen grundkroppens plan. Denna procedur möjliggör för manipulering av maternella produkter för funktionella studier genom injektion av reagens, såsom mRNA och MO, under oocytutveckling.
Manipulering av moderns produkter för funktionella studier:
mRNA som kodar för vildtyp och muterade produkter kan injiceras i in vitro mognande oocyter för att testa effekten av manipulering av maternal genfunktion under meios och de tidiga embryonala stadier. Till exempel, kan embryon av vildtyp injiceras med wild-typ-mRNA för att testa för effekten av produktens överuttryck, eller med mutant-RNA för att testa för potentiella dominanta (t.ex. få-av-funktion och antimorphic) effekter i dessa processer. Oocyter i in vitro-odling kan producera protein från exogent mRNA hela oocytutveckling, såsom visas genom expression av GFP från injicerade mRNA, även om endast oocyter som initierar odlingsbetingelser i steg IV i oogenes kan utvecklas till mogna stadium V-oocyter (fig 2B -2D, se även et al. Nair 3). Expressionen av vildtyp produkt genom injicerade mRNA är också avgörande för att rädda maternal effekt mutationer för att bekräfta gen identitet under positionell kloning 3, 24. I detta fall, är vildtyp mRNA injiceras i oocyter från homozygota mutant honor för att testa om vildtyp produkter kan rädda den mutanta fenotypen. Denna genetiska räddnings illustreras i <strong> Figur 3A-3C, där injicerad AurB mRNA visas att rädda de fenotypiska effekterna av en mutation i dess motsvarande gen, cellulär ö (CEI) (Figur 3A-3C). Embryona från en kontrollgrupp är också tillåtet att utveckla för att visa motsvarande mutanta fenotypen 3. Mutant RNA kan också injiceras i mutant oocyter för att testa om den muterade produkten bibehåller partiell funktion genom att jämföra omfattningen av undsättning med den som orsakas av vildtyp produkt.
Proteinuttryck från mRNA injiceras i utvecklings äggceller tycks uppstå med liten eller ingen fördröjning. Stark GFP-uttryck observeras inom 2 h från injektionen av motsvarande mRNA, oberoende av utvecklingsstadiet av oocyten 3 (Figur 2B-2D; se även et al Nair 3.). Produkter som mCherry:Sas6 och Birc5b (brokiga): GFP kan observeras omedelbart efter befruktning och under den första embryonala cellcykeln 3, 25. Injektion av mRNA under oogenes leder också till produktion av protein som, oberoende av den sammansmälta taggade del, är funktionell omedelbart efter befruktning, såsom visas i fallet med maternella produkter för cellulär ö / aurB 3, futil cykel / lrmp 24, och brokiga / bir5b 25. Translation-blockerande MO: har också en effekt omedelbart efter fertilisering, såsom visas för futil cykel / Lrmp 3 och vid senare stadier av embryogenes, såsom i fallet med omöjligt / dhx16 tre uppdrag. Skarv-blockerande MO, när de injiceras i mognande oocyter, inte kan ha en effekt på maternal funktion, sannolikt på grund av redan närvarande mogna maternal transkript i stadium IV oocyter <sup class = "xref"> 3.
Generation av morphants:
När du använder en MO motsvarande en gen med en redan identifierad mutation är morphant fenotyp förväntas efterlikna mutantfenotypen. Morphants jämförs med oinjicerade embryon och de som injicerats med en standard, kontroll MO. Injektion av en translation-blockerande morfolino framgångsrikt kan phenocopy den kända mutantfenotypen 3, såsom visas genom injektion av Lrmp MO i oocyter, som härmar den mutanta fenotypen av den motsvarande mutationen, futil cykel (Figur 3D-F). Specificiteten för MO kan bestämmas genom samma tillvägagångssätt som används vid injicering av MOS till embryon (tidigare granskade) 19, 20.
Uttryck av fluorescensmärkta fusionsproteiner:
mRNA som kodar för genprodukter av intresse smält till fluorescerande proteiner (t.ex. GFP och mCherry) kan också injiceras i antingen vildtyp eller mutanta oocyter för att visualisera de motsvarande produkter inom den tidiga embryot (dvs återspeglar en subcellulär lokalisering mönster; Figur 3G och 3H). mRNA som kodar för liknande fusioner men involverar mutant-allelen kan på liknande sätt uttryckas för att testa om mutationen påverkar eventuella subcellulära lokaliseringar.
Figur 1: In vitro oocytmognad. Schematiskt diagram som visar de olika steg som ingår i in vitro oocytmognad. Vuxna honor är förvald för äggläggning 8 dagar före ingreppet för att rensa dem ägg som redan har mognat och att proMöte nya äggcellen utveckling. Äggstockarna, innehållande u-oocyter, avlägsnas från honor och överfördes till ett medium innehållande hormonet DHP att inducera oocytmognad in vitro. Efter avlägsnande från honor och omedelbart före eller under oocytmognad, kan oocyter injiceras med RNA-produkter och andra reagens för den funktionella manipulering av maternella faktorer. Mogna oocyter manuellt defolliculated och befruktas in vitro med en spermie lösning till att ge befruktade, livsdugliga embryon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: In vitro oocytmognad och expression av produkter från injicerade mRNA. (A) Oocyter vid stegen I-III, som observerats i äggstockarna frånfemales 4 dagar efter spolning (dpp). (B) Oocyter vid steg IV, som observerats i äggstockarna från hondjur 8 dpp. Det germinala vesikeln (GV, pilspets) är klart synlig och upptar ett excentriskt läge. Steg III oocyter i (A) uppvisar även en lätt uppenbara GV, men det visar sig centrerad i oocyten. Stadium IV oocyter i (B) har en storlek som är nästan maximal jämfört med den hos mogna oocyter i (C). (C och D) Oocyter vid steg V (mogen oocyter) efter 2 timmar i in vitro mognadsbetingelser initieras vid steg IV, såsom i (B), och injiceras under mognad med GFP-kodning, in vitro transkriberade mRNA (C, synligt ljus endast; D, överlagring av synligt ljus och GFP-fluorescens). GV är inte längre tydligt i scen V oocyter, som också är mindre opak än stadium IV oocyter. Injicerade oocyter uttrycka GFP-protein (D). Defolliculation av mogna stadiet IV oocyter är described i protokollet sektionen. Scale bar = 300 | im. Alla paneler reproducerades, med tillstånd från Nair et al 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: manipulation och visualisering av Maternal produkter genom In Vitro oocytmognad. (A - C) Räddning av moderns-effekten fenotyp orsakas av en mutation i cellulär ö / aurora B genom injektion av vildtyp aurB mRNA till stadium IV CEI / aurB oocyter. Sammanslagna bilderna visar djur vyer av 65 MPF fasta blastodiscs, visualiseras med anti-beta-katenin-antikroppar för att markera membran (grön), anti-a-tubulin-antikroppar för att indikera mikrotubuli (röd), och DAPI för att beteckna DNA (blått). (A) β-catenin ackumulering i embryon av vildtyp, som anger normal fåra mognad. (B) En cei / aurB embryo från ett icke-injicerade cei / aurB stadium IV oocyt visar partiella, rudimentära fåror som inte ackumuleras β-katenin. (C) En räddad cei / aurB embryo från en cei / aurB oocyt injicerad med vildtyp aurB mRNA visar robust β-katenin ackumulering vid fårorna. (D - F) Phenocopy av moderns-effekt som orsakas av en mutation i futil cykel / lrmp från injektionen av Lrmp morfolino in i stadium IV oocyter. Sammanslagna bilderna visar djur vyer av 70 MPF fasta blastodiscs, visualiseras med anti-y-tubulin-antikroppar för att indikera centrosomer (rött) och DAPI för att beteckna DNA (blått). (D) I vildtyp embryon, vardera nucleus associerar med γ-tubulin, en markör för centrosomal material. (E) I FUE mutanter maternal-effekt, misslyckas pronukleär fusion, vilket resulterar i två till tre fläckar av DNA-etiketter som motsvarar icke sammansmälta parentala pro-kärnor och den polära kroppen för meios II. (F) I Lrmp morphants, där maternal Lrmp funktionen inhiberas, kärnorna misslyckas på liknande sätt att dela sig och, dessutom, misslyckas att associera med γ-tubulin. (G och H) Visualisering av maternellt framställda produkten i det tidiga embryot. Sass6-mCherry protein från exogent mRNA injiceras i stadium IV oocyter lokaliseras till de centrioler. Sammanslagna bilderna visar djur vyer av 40 MPF fasta blastodiscs, visualiseras med anti-y-tubulin-antikroppar för att markera centrosomer (gröna), mCherry fluorescens för att indikera Sass6 (röd), och DAPI för att beteckna DNA (blått). (G) Uttryckt Sass6-mCherry proteinet lokaliseras till Foci märkas av centrosom markör γ-tubulin vid ställen som flankerar kärnan (pilar). (H et al 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Stadier av oogenes | Oocyt diametern (pm) | Nyckel landmärke (er) |
| 1A - Prefollicle | 7 till 20 | Initiering av aktiv transkription, ackumulering av nukleolerna |
| 1B - Follikelstimulerande | 20-140 | Dekondensationsvärde av kromosomer |
| II - kortikal alveolerna | 140-340 | Kortikal alveoler produktion |
| III - Vitellogenesis | 340-690 | Mörknande av ooplasma genom ackumulering av äggula prekursorprotein och lipider |
| Tidig IV - oocytmognad | 690-730 (lägre intervall) | Asymmetrisk lokalisering av germinal vesikel |
| Tidig IV - oocytmognad | 690-730 (övre rad) | Germinal vesikler försvinner, gripande vid metafas II |
| V - mogna äggcellen | ~ 750 | Ooplasma / äggula blir genomskinlig |
Tabell 1: Landmärken av oocytutveckling i Zebrafisk.
Discussion
Protokollet ovan är för manipulering av genprodukter före befruktning, vilket möjliggör studier av matemella genprodukter i början zebrafisk embryot. Tidigare studier har kunnat mogna äggceller in vitro 4; detta protokoll modifierades för att möjliggöra för den efterföljande fertilisering av in vitro-mognade oocyter 8. Detta i sin tur gör det möjligt för injektion av reagens för funktionell manipulation och visualisering av maternellt ärvda produkter i tidiga embryot 3. Embryon som härrör från denna metod kan vara livskraftig och kan överleva att bli fertila vuxna. I preliminära experiment, ungefär hälften av de befruktade embryon från detta förfarande var lönsamt på dag 5 av utveckling, som bedöms av simblåsan inflation i detta skede, varav ungefär hälften blev friska, fertila vuxna (opublicerade observationer).
Det finns ett antalkritiska steg att tänka i protokollet. Oocyter vid lämplig tidpunkt för att initiera mognad (tidigt stadium IV) kan berikas om den kvinnliga har parat nyligen, men inte före den 8 DPP. Använda fisk som inte har parat nyligen kan resultera i degenererade ägg 14, som inte kommer att genomgå mognad. Kvinnor parade inom mindre än 8 dagar kommer att ha en majoritet av ägg i stadium III eller mindre, och därmed kommer äggen inte mognar på rätt sätt in vitro. Äggstockar hos honor som parat 8 dagar före kommer att ha en optimal fraktion av oocyter i tidigt stadium IV. Dessa kan kännas igen av deras opacitet och närvaron av GV i ett excentriskt läge (Figur 2B). Oocyt steget bestämning kan också underlättas genom storleksmätning, med oocyterna placerades på en graderad mikrometer glider under ett mikroskop och jämfört med standard riktlinjer mellanstationer (tabell 1). Men tidigt stadium IV äggceller har nästan maximal storlek jämfört med mognaoocyter (känns igen av deras relativa transparens och bristen på en GV; Figur 2C) och är lätt att känna igen, såsom beskrivits ovan, som i allmänhet undanröjer behovet av en direkt mätning oocyt storlek.
In vitro mognad måste börja inom några timmar efter utgången av dagsljus cykel som de kvinnliga äggcell givare acklimatiserad. Oocyter inte mogna ordentligt, återspeglas i fattiga befruktning priser, om odlas under perioden av ljuset cykeln morgonen. Orsaken till den cirkadiska beroende av in vitro oocytmognad metoden är inte klarlagd, men återspeglar sannolikt underliggande dygnsrytm fördomar i in vivo äggmognad involverar cykling genexpression under oogenes 21. En vanlig orsak till äggceller misslyckas att genomgå framgångsrik in vitro mognad trots korrekt äggcellen iscensättning är att DHP har löpt ut. DHP hormon upphör vanligen efter ett år, och för att säkerställa effektIve mognad bör arbets partiet bytas ut inom 9 månaders användning.
Injektion av oocyter är ett annat kritiskt steg när syftet med förfarandet är den funktionella manipulation av maternella produkter. Detta förfarande har krav som skiljer sig från dem för standard injektioner i det befruktade ägget vid 0-30 MPF. En viktig faktor för oocytinjektion är behovet av att utföra injektionerna under betingelser som inte leder till för tidig ägg aktivering, såsom i Leibovitz L-15-medium 22, 23. Eftersom de är inbäddade i äggstockarna, som förfaller äggceller utgör också särskilda utmaningar injektion. Protokollet ovan antyder först dissociera oocyter från äggstockarna och sedan hålla varje dissocierade oocyt separat med pincett under injicering. Denna teknik har fungerat bra och låter försortering äggceller vid lämplig tidpunkt med minimal hantering. Alternativa metoder kan också användas, såsomsom: i) placera oocyter till standard injektion rännor agaros 15, där de vertikala väggarna hos tråget stöd oocyten under injektion (i denna alternativa metod, oocyterna måste överföras till injektionsplattor medan hålls i in vitro-mognadsmedium) och ii ) låta oocyterna att förbli fäst vid den ovarian massa, som kan hållas med pincett under injektionen för att undvika kontakt med den injicerade oocyten (i detta tillvägagångssätt bör oocyterna dissocieras efter injektionen för att både underlätta DHP exponering och för att tillåta deras defolliculation , i sig väsentligt för IVF). Trots denna specifika utmaning, kan steg IV oocyter lätt penetreras med en injektionsnål, sannolikt eftersom den chorionic membranet vid detta stadium inte är fullt utvecklad 9.
En begränsning av den aktuella mognadsprotokollet är att in vitro mognads förhållanden som främjar korrekt äggcellen utvecklingkan inte skapas när oocytmognad initieras vid steg tidigare än steg IV. Oocyter bli behöriga att svara på DHP genom att genomgå mognad när de når en diameter av 520 um, som sker under steg III (vitellogenesis, motsvarande den 340-till-690-pm-området) 9. Men kultur stadium III oocyter resulterar i oocyter som inte är behörig för befruktning 3. Endast oocyter vars in vitro-odling initieras vid steg IV (Figur 2B) kan utvecklas till mogna, stadium V oocyter (Figur 2C och D). Detta kan bero på det faktum att steg III är viktigt för vitellogenesis och äggcellen tillväxten 9. Sålunda bör den vitro förfarande oocytmognad in presenteras i denna artikel endast användas med en utgångspopulation av steg IV oocyter (B), och inte med oocyter vid tidigare stadier (stadium I - III; Figur e
En annan begränsning i det presenterade förfarandet är att defolliculation, som är väsentlig för de efterföljande stegen som involverar befruktning, är för närvarande ett hastighetsbegränsande steg i förfarandet. Den follikulära membranet är ett transparent skikt som omger den utveckla oocyt, och borttagning kan vara långtråkig. Om detta membran inte är helt bort, kommer ägget inte bli helt aktiverad och befruktas. Detta görs tydligt genom misslyckandet med chorion att expandera och utveckla oregelbundet placerade, fåra liknande structures (pseudocleavages), som är karakteristiska för obefruktade embryon 11. Enzymatiska defolliculation metoder såsom kollagenas, som användes i Xenopus har prövats. Men i våra händer, denna teknik har inte varit framgångsrik, och förlitar vi därför manuellt defolliculation. Eftersom manuell defolliculation är arbetsintensivt och tidskrävande, är det svårt att få stora partier av befruktade ägg efter in vitro oocytmognad. På grund av den tidsmässiga begränsningen genom manuell defolliculation vi för närvarande befrukta några defolliculated, mogna ägg i taget, i små partier av 5-10 ägg. Införlivandet av enzymatisk defolliculation med detta förfarande skulle sannolikt avsevärt öka dess utbyte och allmänt enkel användning.
Även embryon som producerats efter befruktning in vitro -matured äggceller kan bli livskraftiga vuxna, kan vi konstatera att efter provrörsbefruktning, en bråkdel av embryon gör inte dela normalt eller i tid. Vi för närvarande väljer för linjer vilkas förökning inkluderar omgångar av in vitro oocytmognad, vilket kan resultera i mer robusta utvecklingsmönster i embryon härledda genom denna metod.
Förfarandet har möjliggjort för den klara räddnings- eller visualisering av proteinlokalisering för ett antal mutationer 24, 25. För vissa gener, kan regleringen av produktexpression vara avgörande, så att produkterna uttryckta av injicerade mRNA kan leda till olika resultat 26. Det är också viktigt att vara uppmärksam på alla kontroller (t ex embryon som injicerats med reagens som har liknande egenskaper som de som används i experimentet ännu förutspås att inte producera en effekt, såsom kontroll MO eller RNA som kodar för inerta proteiner enbart, såsom som GFP), som underliggande variation kan leda till felaktiga slutsatser.
nt "> Ett tillvägagångssätt involverar in vitro-manipulation, följt av befruktning är särskilt användbar i fallet med maternellt deponerade produkter där standardmetoden för att injicera RNA, MO, eller protein i det befruktade ägget kan inte effektivt minska produkter som redan ackumulerats i ägget. andra nyligen utvecklade metoder, såsom CRISPR-mutant generation, är också effektiva på att generera mutanta förhållanden för matern uttryckta gener 26. emellertid kräver denna metod tillväxten av flera generationer av fisk. in vitro oocytmognad teknik medger snabb funktionell manipulation för att studera funktionen av maternellt uttryckta gener, inklusive räddningen och phenocopy av mödrars effekt mutationer, såväl som uttryck av RNA och proteiner i det tidiga embryot.Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Pelegri lab och fisk anläggning ledande personal, som var avgörande för att underlätta detta projekt. Stöd för detta projekt från NIH R56 GM065303 och NIH två T32 GM007133 till ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 och NIH två T32 GM007133 till CCE och NIH RO1 GM065303 till FP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO2-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO2 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4 - 5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 mL | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| beakers, 250 mL (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| 17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
| gentamicin | Sigma | G1272 | |
| Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
| Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
| Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips | any maker | ||
| Conical tubes 15 mL | any maker | ||
| Conical tubes 50 mL | any maker | ||
| plastic pipette 10 mL with bulb | any maker | ||
| plastic pipette 20 mL with bulb | any maker | ||
| Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
| Reagents for fish water: | |||
| Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
| Reagents for E3 medium: | |||
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| KCl | Sigma | P5405-500G | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
| MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
| Fish Food: | |||
| Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
| Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |
References
- Lindeman, R., Pelegri, F. Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish. Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).
- Abrams, E. W., Mullins, M. C. Early zebrafish development: it's in the maternal genes. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).
- Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).
- Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement. Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).
- Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho. Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).
- Patiño, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker. Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development. Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).
- Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
- Kanagaraj, P., et al. Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis. PLoS Genet. 10 (6), e1004449 (2014).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish,Zebrafish - A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Pelegri, F., Mullins, M. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. J Vis Exp. , (2016).
- Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development in the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology. Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).
- Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).
- Pelegri, F., Mullins, M. C. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 135, (2016).
- Lindeman, R. E., Pelegri, F. Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote. Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).
- Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo. PLoS Genetics. 9 (4), e1003448 (2013).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).
