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Biochemistry

通过免疫共沉淀在核质馏分蛋白质相互作用的可视化和 Published: January 16, 2017 doi: 10.3791/55218

Introduction

核因子90(NF90)是一个多同种型蛋白质与许多功能,包括白细胞介素-2的后转录和miRNA生物发生1-3的调节响应于病毒感染,调节。 RBM3是一种RNA结合蛋白,参与翻译和miRNA生物发生,并且可以通过各种紧张,包括低温和缺氧4-6诱导。最近,我们发现NF90和RBM3的蛋白复合物7。 NF90和RBM3的相互作用是必不可少的调节在折叠蛋白反应7蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)活性。无论NF90和RBM3主要位于细胞核中,但NF90的一小部分,并RBM3航天飞机进入细胞质并结合有彼此为特定的功能, 调节PERK活动。因此,可视化NF90-RBM3相互作用的分布在亚细胞区室,其可以指示是很重要它们在各自的舱室各种角色。

几十年前,酵母双杂交(Y2H)的开发,以检测两种蛋白质8之间的相互作用。然而,由于融合蛋白的人工建造,假阳性结果限制了这种方法的应用。很长一段时间,免疫共沉淀是分析蛋白质-蛋白质相互作用,特别是在内源性条件9的主要技术。为了分析共同免疫沉淀的蛋白质复合物,蛋白质印迹是最方便的技术,而当超灵敏性和精确性期望使用质谱法。近年来,接近连接测定已发展为一种新的方法来检测在原位 10,11在两个细胞和组织中蛋白-蛋白相互作用。

在这里,我们比较捕捉NF9菌株最流行的免疫共沉淀法和相对新颖的接近结扎测定方法在亚细胞组分0 RBM3互动。我们还讨论的优点和两种技术的局限性。

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Protocol

1.免疫共沉淀

  1. 种子HEK293细胞以每孔2×10 5个细胞在一6孔板的2ml Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中的补充有10%胎牛血清(FBS)和100U / mL的青霉素-链霉素(青霉素-链霉素) 。
  2. 生长细胞48小时,在37℃,5%的CO 2。
  3. 洗涤细胞用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的三倍。收获细胞,在500×g离心5分钟,离心在4℃下。
  4. 使用商业细胞核和细胞质提取试剂准备细胞核和细胞质分数。按照制造商的一些修改指令。
    1. 用3×10 6细胞对一种共免疫沉淀实验(来自3个孔一个6孔板的约90%汇合)。加入300微升冷的细胞质提取液(CER I),涡旋15秒的最高速度。
    2. 孵育在冰上30分钟。孵化期间,vortex对于5秒,每10分钟。
    3. 添加16.5微升冷的细胞质萃取液II(CER II),涡旋5秒,并培育冰上5分钟。
    4. 涡流在4℃下5秒并离心16,000×g离心5分钟。
    5. 转移上清液(胞浆提取物)到一个新的预冷的管,并保持在冰上直到使用。
    6. 通过每次上下吹打五次用1ml冷的PBS洗涤不溶性颗粒(含核)三次。后洗净除去PBS。
    7. 加入150微升冷的核提取液(NER),涡旋15秒,冰上孵育1小时。在孵化,涡旋15秒和吸管10次用200微升末端每隔10分钟。
    8. 涡旋15秒并离心16,000 xg离心在4℃下10分钟。
    9. 转移上清液(核抽提物)到一个新的预冷的管,保持在冰上直到使用。
  5. 取出核和细胞质提取物的体积的10%的每个作为输入。
  6. 一个DD冷PBS到剩余提取物1毫升的最终体积。置于冰上直至使用。
    注:使用蛋白G偶联的磁珠时预结算不是必需的。然而,如果背景是高,通过温育将40μl蛋白G偶联的磁珠(50%浆液)和1ml这个步骤在4℃下在旋转器上30分钟稀释溶胞产物进行预清除。从与磁性架珠粒分离上清液(预澄清的溶胞产物)。丢弃的珠子。
  7. 与蛋白G偶联的磁珠夫妇初级抗体,孵育40微升蛋白G偶联的磁珠(50%浆液)与4微克兔多克隆抗RBM3抗体或在200μlPBS中兔IgG(阴性对照)加Tween 20缓冲液(PBST,0.02%吐温20)在室温(RT)下在旋转器上40分钟。
  8. 单独的抗体 - 偶联珠和上清液用磁力架,并弃去上清液。用200μlPBST(0.02%)洗珠一次。
  9. 加1毫升稀释裂解物(或者如果需要的话,预澄清的溶胞产物)的珠,并在4℃下在旋转器上孵育过夜。
  10. 在第二天,用磁力架分离珠和上清液,并弃去上清液。在4℃下在旋转器上洗3×10分钟用0.5ml PBST(0.02%)为每个管20 rpm的固定速度。
  11. 通过加入40微升样品缓冲液(1×商业样品缓冲液和50mM 1,4-二硫苏糖醇(DTT))洗脱从珠蛋白。热,在70℃下进行10分钟。降速和传输液体到新的1.5 ml管。
  12. 稀释样品缓冲输入裂解物(最终浓度:1×商业样品缓冲液和50mM DTT)和加热在70℃下进行10分钟。从最后一步到一个预制4-12%的Bis-Tris凝胶负载输入和免疫沉淀的蛋白质。每口井的装载量不宜超过20微升。在1×商业运行缓冲液进行电泳在冰上35分钟。
    注:加载细胞核和细胞质提取物S IN 1:2的比例(V / V),这反映了细胞的相同的初始量。
  13. 转移蛋白至PVDF膜在1×商业转印缓冲液中在30伏2小时,在4℃。
  14. 用5%的块膜在RT脱脂在PBST乳(0.1%吐温20),用于在振荡器上40分钟。
  15. 孵育初级抗体膜(在1都稀释:1,000)在PBST(0.1%),在4℃下过夜。
  16. 在RT在摇床上洗涤3×10分钟用PBST(0.1%)。
  17. 孵育辣根过氧化物酶(HRP)缀合的膜的抗小鼠或抗兔次级抗体(在1都稀释:5,000)在PBST(0.1%)在RT 1小时。
  18. 在RT在摇床上洗涤3×10分钟用PBST(0.1%)。
  19. 使用0.2毫升增强的化学发光(ECL)基板平方厘米膜混合物,孵育在室温下5分钟。避免这一步,除了起红灯全亮。
  20. 丢弃液体并暴露于X射线胶片的胶片盒。使用自动薄膜PR开发薄膜ocessing机。

2.免疫细胞化学和接近结扎分析

  1. 种子补充有10%FBS和100U / ml的青霉素-链霉素的HEK293细胞以每室1.5×10 4个细胞在一个8腔聚D-赖氨酸涂覆的滑动0.4毫升DMEM中。
  2. 生长细胞48小时,在37℃,5%的CO 2。
  3. 抽吸培养基,并修复用4%多聚甲醛(PFA)在室温10分钟的细胞。
  4. 抽吸PFA,并与每室0.5毫升的PBS洗涤3×10分钟。
  5. 通透和嵌段细胞用在PBS中的0.5%的Triton X-100和5%正常山羊血清(NGS)在RT 1小时。
  6. 在4℃下在0.1%的Triton X-100和5%NGS的PBS中的一抗在振荡器上孵育过夜。稀释的小鼠单克隆抗NF90抗体和兔多克隆抗RBM3抗体1:在PBS 100为双重染色。为阴性对照,独立地省略或两个初级抗体,而在第三控制省略两种抗体。
    注:请不要使用商业阻塞和稀释试剂。
  7. 洗3×10分钟用0.5毫升PBS中每室。
  8. 受免疫或接近连接试验协议
    1. 免疫细胞化学
      1. 用1孵育:500稀释绿色荧光染料 - 偶联的抗 - 小鼠和红色荧光染料偶联的抗 - 兔二级抗体在RT 1小时。从这一步起,避免了光。
      2. 在PBS 5000在RT 10分钟:用4',6- diamidin -2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核稀释1。
      3. 洗3×10分钟用0.5毫升PBS中每室。
      4. 移除载玻片和干燥腔室。 250μ安装,安装每张幻灯片中。
    2. 接近结扎法
      1. 准备接近结扎分析探针。混合和稀释附着有不同的寡核苷酸,可以结扎日两个接近连接测定探针(抗小鼠和抗兔二级抗体粗加在结扎溶液中的其它两个寡核苷酸)两者1:5的0.1%的Triton X-100和5%NGS的PBS,用320微升的总体积为一个8腔室滑动件( 平方厘米约40微升) 。孵育在室温20分钟。
      2. 从载玻片移除腔室,并添加稀释探针。孵育在湿度培养箱中于37℃进行1小时。
      3. 准备连接解决方​​案。混合8微升连接酶,64微升5×连接股票和248微升H 2 O.
      4. 分接从滑动的液体,并在1×洗涤缓冲液洗涤2×5分钟(由试剂盒提供)。
      5. 添加连接溶液,并在37℃的湿度培养箱温育30分钟。
      6. 准备扩增溶液。混合4微升聚合酶,64微升5倍放大的股票和252微升H 2 O.从这一步起,避光。
      7. 从滑动轻按脱液,并在1×洗涤缓冲液A洗涤2×2分钟
      8. 添加耳放lification溶液,并在黑暗湿度培养箱孵育在37℃下为100分钟。
      9. 分接从滑动的液体,并在1×洗涤缓冲液B洗2×10分钟(由试剂盒提供)。洗在0.01X洗涤液B. 1分钟
      10. 擦干幻灯片,每张幻灯片250微升商业安装介质(用DAPI)的安装。
  9. 检查用10X目镜透镜和20X物镜的显微镜下的荧光信号。通过CCD照相机获得的图像。

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Representative Results

图1表明,NF90和RBM3都是核蛋白和只有一小部分是存在于细胞质中。值得注意的是,存在用于RBM3染色阳性三个不同的频带。最小的正下方的20kDa反映RBM3的正确大小(RBM3的预测分子量为17 kDa的)。其他两个波段的起源还有待调查。与RBM3作为诱饵蛋白共免疫沉淀实验表明NF90-RBM3相互作用是主要存在于核和细胞质少数。免疫共沉淀的数据支持每个单独的蛋白质的本地化。

如图2A所示,NF90和RBM3主要位于细胞核而且在原位细胞质中。这两种蛋白质表现出在两个隔室完美的共定位。接近结扎测定显示模式的NF90-RBM3相互作用,这是非常类似于传统免疫细胞化学,在大多数细胞中细胞核大多数相互作用。只有细胞的一小部分证明NF90-RBM3相互作用的主要细胞质分布。

加在一起,共免疫沉淀和邻近连接测定技术反映基本上在核和细胞质区室的蛋白质 - 蛋白质相互作用的相同的分布图案。

图1
图1:NF90和RBM3及其在HEK293细胞的核质馏分相互作用的免疫印迹分析。核和细胞质提取物装载到SDS-PAGE凝胶中的一个比为1:2(V / V),反映细胞的相同量的在提取协议说明。拉明和GAPDH用作核和细胞质的标记,分别为。免疫共沉淀,用抗RBM3抗体或兔IgG作为阴性对照。核和细胞质提取物还用抗RBM3抗体孵育在1:2的比例(V / V)分别。在NF90印迹上带指示110 kDa的长同种型NF110。 N:核提取物; C:细胞质提取物,IP:免疫沉淀。蛋白质标记物标记为RBM3阳性条带。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:免疫组化和HEK293细胞接近结扎分析。 (A)的HEK293细胞与抗NF90(绿色)和抗RBM3(红色)的抗体的双染色。箭头显示细胞NF9菌株明确细胞质共定位0和RBM3。细胞核用DAPI(蓝色)复染色。 (B)中邻近连接测定用抗NF90和在HEK293细胞中的抗RBM3抗体。红色荧光斑点表明NF90-RBM3相互作用。箭头显示在细胞质NF90-RBM3相互作用。细胞核用DAPI(蓝色)复染色。阴性对照1(NC 1):初级抗体省略。只有RBM3单一的初级抗体:阴性对照2(NC 2)。阴性对照3(NC 3):NF90单个主只有抗体。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

有几个好处,以及这两种方法的缺点。作为一个相对较新的技术中,邻近连接测定的一个明显的优点是阐明在单细胞水平,而不是一个批次异质细胞蛋白质 - 蛋白质相互作用的可行性。具有较高的幅度和分辨率( 例如 ,通过共聚焦显微镜)图像提供了通过计算单荧光斑点进行量化的可能性。相反,用Western印迹免疫共沉淀技术的常规组合只能半定量蛋白质条带,这主要是因为一个合适的负载控制是难以确定的IP样品。此外,当蛋白质-蛋白质相互作用是弱或短暂,大量的生物材料, 例如细胞或组织,需要共免疫沉淀或与熔融标签的人工过度表达系统的应用,以提高检测的相互作用的机会。另外,检测Ť具有高灵敏度echniques如质谱可以提高实验质量。但是,在相对于起始物质的量的邻近连接测定方法具有明显的优势。只有少数细胞是必需的,提供的抗体的高品质中给出。另外,组织样品中, 不同的组织结构和细胞类型的蛋白质-蛋白质相互作用的原位可视可通过邻近连接测定实现的,在类似的模式为正常免疫组织化学。相比之下,共免疫沉淀是通过其性质不适于显示蛋白质 - 蛋白质相互作用的空间分布。

在大核小,但细胞质车厢细胞,接近结扎测定方法只限于在分析核质分布和传统的免疫共沉淀有其自身的优势。例如,在T淋巴细胞的细胞系, 例如 Jurkat细胞,核细胞质DISTRI通过邻近连接测定技术NF90-RBM3相互作用butions受到限制,因为核占据在细胞内几乎整个空间,并且难以识别细胞质隔室的边界。这可以是在一般的免疫细胞化学一个共同的问题,当核 - 细胞质比率极不平衡。然而,共免疫沉淀在这种情况下,不受此限制。

关于邻近连接测定一个特殊的问题是来自接近连接测定的信号是否表示直接或间接的蛋白质 - 蛋白质相互作用。无论NF90和RBM3具有RNA结合特性及其相互作用是依赖于RNA,在我们以前的研究7日报道。因此,用RNase细胞裂解物的预处理溶解NF90和RBM3并没有什么之间的相互作用是通过共免疫沉淀法7检测的。然而,接近连接测定信号不受影响即使RNA依赖性蛋白质 - 蛋白质相互作用失去RNA种类,因为当两个蛋白质之间的距离小于40纳米,这通常被认为是作为一个直接相互作用它产生。邻近连接测定的这种性质可以克服从共免疫沉淀的技术问题,如核糖核酸酶释放在细胞裂解物中,可能取消要求的RNA调解的相互作用。然而,在另一方面,邻近连接测定方法还可以产生假阳性信号,如果RNA依赖性蛋白质 - 蛋白质相互作用实际上并不由于缺乏的在生理条件下特异性RNA存在。

值得特别注意的另一个问题是初级抗体的特异性和蛋白同种型,前体和蛋白聚集的可能性。我们观察到免疫印迹,长期NF90亚型,NF110,在这两个细胞核和细胞质在HEK293细胞更丰富相比,NF90(FI古尔1)。然而,免疫共沉淀解开NF110的较高结合亲和力RBM3特别是在细胞核中。三个主要带中RBM3印迹发现在细胞核中,但只有20 kDa的正常RBM3带在细胞质主要观察到。是否另外两个50 kDa和100 kDa的条带反映RBM3同种型,前体,具有结合的RBM3蛋白质聚集体或是由于非特异性背景仍有待阐明。相反,由于邻近连接测定是基于免疫染色,邻近连接测定不能区分之间不同的蛋白质同种型,前体,聚集体或非特异性染色的差异,而共免疫沉淀可以提供抗体特异性或蛋白同种型和前体比的详细信息邻近连接测定调查蛋白质 - 蛋白质相互作用。关于RBM3,考虑到核观察到的所有三个RBM3波段时,印迹结果是一个主要的核一致localizati在RBM3由免疫观察。

总之,这两种免疫共沉淀和邻近连接测定技术具有内在的优点和限制。在许多情况下,它们产生一致的结果,但它是有益的是使用这两种技术,当系统地研究某些蛋白质 - 蛋白质相互作用。然而,在特殊情况下,或具有特定的目的,人们可以显示优势比其他。最近,接近连接测定已用于屏幕蛋白质-蛋白质相互作用,以开发新的预后标志物12。蛋白 - 蛋白相互作用被认为是更可靠的生物标记物比单个蛋白质。在未来,邻近连接测定可潜在成为分析蛋白质 - 蛋白质相互作用中诊所的诊断和预后标志物快速和可靠的方法,虽然这些生物标志物的鉴定和表征仍然需要传统的共immuoprecipication箱的ThOD。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) Sigma D6429 High glucose
4,500 mg/L
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific 10270106
Penicillin-Streptomycin (PenStrep) BioConcept 4-01F00-H
NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Thermo Fisher Scientific 78833
1,4-Dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908.3
Dynabeads Protein G Novex, Thermo Fisher Scientific 10003D
DRBP76 (NF90/NF110) antibody BD Transduction Laboratories 612154 use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA
RBM3 antibody ProteinTech 14363-1-AP use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA
Lamin A/C antibody Cell Signaling Technology #2032 use 1:1,000 for WB 
anti-GAPDH antibody Abcam ab8245 use 1:1,000 for WB 
normal rabbit IgG Santa Cruz sc-2027
anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody Cell Signaling Technology #7074 use 1:5,000 for WB 
anti-mouse HRP secondary antibody Carl Roth 4759.1 use 1:5,000 for WB 
Clarity Western ECL Blotting Substrate Bio-Rad #1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel Novex, Thermo Fisher Scientific NP0321BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP00061
Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane GE Healthcare Life Sciences 10600021
Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide Corning BioCoat 354632
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Normal goat serum (NGS) Gibco, Thermo Fisher Scientific PCN5000
Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific A-11001
Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate Thermo Fisher Scientific A-11011
4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma D9542
Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS Sigma DUO92001
Duolink PLA  probe Anti-rabbit MINUS Sigma DUO92005
Duolink Detection Reagents Red Sigma DUO92008
Duolink Wash Buffers Fluorescence Sigma DUO82049
Duolink Mounting Medium with DAPI Sigma DUO82040
Mowiol 4-88 Sigma 81381
Microscope Olympus AX-70
CCD camera SPOT Insight 2MP Firewire
X-ray film Fujifilm Super RX
Film processing machine Fujifilm FPM-100A

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References

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生物化学,第119,物理相互作用,荧光,圆聚合酶链反应,RNA结合,贩卖,压力颗粒
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Zhu, X., Zelmer, A., Wellmann, S.More

Zhu, X., Zelmer, A., Wellmann, S. Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (119), e55218, doi:10.3791/55218 (2017).

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