Introduction
Nuklear faktor 90 (NF90) er en multi-isoform protein med mange funktioner, herunder respons på virusinfektion, regulering af interleukin-2 post-transskription og regulering af miRNA biogenese 1-3. Rbm3 er et RNA-bindende protein, der er involveret i oversættelse og miRNA biogenese og kan induceres af forskellige faktorer, heriblandt hypotermi og hypoxi 4-6. For nylig fandt vi NF90 og Rbm3 i et proteinkompleks 7. Interaktionen af NF90 og Rbm3 er vigtigt at modulere protein kinase RNA-lignende endoplasmatisk reticulum kinase (PERK) aktivitet i udfoldet protein reaktion 7. Både NF90 og Rbm3 ligger overvejende i kernen, men en lille del af NF90 og Rbm3 shuttle ind i cytoplasmaet og binder der for hinanden for specifikke funktioner, f.eks at regulere PERK aktivitet. Derfor er det vigtigt at visualisere fordelingen af NF90-Rbm3 samspil med subcellulært afsnit, hvilket kan tydederes forskellige roller i respektive rum.
Årtier siden blev gær to-hybrid (Y2H) udviklet for at detektere interaktion mellem to proteiner 8. Men på grund af kunstig konstruktion af fusionerede proteiner, har falske positive resultater begrænset anvendelsen af denne metode. I lang tid, co-immunpræcipitering var den vigtigste teknik til at analysere protein-protein interaktioner, især i endogene betingelser 9. For at analysere co-immunpræcipiteret proteinkompleks, Western blot er den mest bekvemme metode, mens massespektrometri anvendes når super følsomhed og nøjagtighed ønskes. I de senere år har nærhed ligeringsassayet blevet udviklet som en ny fremgangsmåde til påvisning af protein-protein interaktioner i begge celler og væv in situ 10,11.
Her har vi sammenlignet den mest populære co-immunopræcipitering fremgangsmåde og relativt ny nærhed ligering assaymetode fange NF90-Rbm3 interaktion i subcellulære fraktioner. Vi drøftede også de fordele og begrænsninger ved begge teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Co-immunopræcipitation
- Seed HEK293-celler ved 2 x 10 5 celler per brønd i en plade med 6 brønde i 2 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) supplere med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin-streptomycin (Pen-Strep) .
- Grow celler i 48 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Vask cellerne med kold phosphatpufret saltopløsning (PBS) tre gange. Harvest celler ved centrifugering ved 500 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Forbered nukleare og cytoplasmatiske fraktioner ved hjælp kommercielle nukleare og cytoplasmatiske udvinding reagenser. Følg fabrikantens anvisninger med nogle ændringer.
- Bruge 3 x 10 6 celler for en co-immunoprecipitation eksperiment (ca. 90% konfluens fra 3 brønde i en 6-brønds plade). Tilsæt 300 pi kold cytoplasmatisk ekstraktionsmiddel (CER I) og vortex i 15 sekunder ved den højeste hastighed.
- Der inkuberes i 30 minutter på is. Under inkubation vortex i 5 s hver 10 min.
- Tilføj 16.5 pi kold cytoplasmatisk ekstraktionsopløsning II (CER II), vortex i 5 sekunder og inkuberes i 5 minutter på is.
- Vortex i 5 sek og centrifugeres ved 16.000 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten (cytoplasmatisk ekstrakt) i en ny forkølet rør, og holde på is indtil anvendelse.
- Vask uopløselige pellets (indeholdende kerner) tre gange med 1 ml kold PBS hver gang ved pipettering op og ned fem gange. Fjern PBS efter vask.
- Tilsæt 150 pi kold ekstraktion nukleare løsning (NER), vortex i 15 sekunder, og der inkuberes 1 time på is. Under inkubation vortex i 15 sekunder og pipette 10 gange med en 200 pi tip hver 10 min.
- Vortex for 15 s og centrifugeres ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten (kerneekstrakt) i en ny forkølet rør, holde på is indtil brug.
- Tag 10% af mængden af nukleare og cytoplasmiske ekstrakter hver som input.
- ENdd kold PBS til de resterende ekstrakter til et endeligt volumen på 1 ml. Hold på is indtil brug.
BEMÆRK: Pre-clearing er ikke afgørende, når du bruger Protein G-konjugerede magnetiske perler. Men hvis baggrunden er høj, udføre præ-clearing ved inkubering 40 pi Protein G-konjugerede magnetiske perler (50% opslæmning) og 1 ml fortyndet lysat fra dette trin ved 4 ° C i 30 minutter på en rotator. Separat supernatant (præ-ryddet lysat) fra perler med magnetisk rack. Kassér perlerne. - Til at koble primære antistof med protein G-konjugerede magnetiske perler, inkuber 40 pi Protein G-konjugerede magnetiske perler (50% opslæmning) med 4 ug kanin polyklonalt anti-Rbm3 antistof eller kanin IgG (negativ kontrol) i 200 pi PBS plus Tween 20 puffer (PBST, 0,02% Tween 20) ved stuetemperatur (RT) i 40 minutter på en rotator.
- Separat antistof-koblede perler og supernatanten med en magnetisk rack, og kassér supernatanten. Vask perlerne en gang med 200 pi PBST (0,02%).
- Tilsæt 1ml fortyndet lysater (eller om nødvendigt på forhånd blokerede lysater) til perlerne, og inkuber på en rotator ved 4 ° C natten over.
- På den næste dag, adskille perler og supernatant af en magnetisk stativ, og kassér supernatanten. Vask 3 x 10 min med 0,5 ml PBST (0,02%) for hvert rør ved 4 ° C på en rotator med en fast hastighed på 20 omdrejninger i minuttet.
- Eluere proteiner fra perlerne ved at tilsætte 40 pi prøvepuffer (1x kommerciel prøve buffer og 50 mM 1,4-dithiothreitol (DTT)). Opvarm ved 70 ° C i 10 min. Spin ned og overføre væsker til et nyt 1,5 ml rør.
- Fortynd input lysater i prøvebuffer (slutkoncentration: 1x kommerciel prøve buffer og 50 mM DTT) og opvarm til 70 ° C i 10 min. Load input og immunopræcipiterede proteiner fra det sidste trin til en præfabrikeret 4-12% Bis-Tris-gel. Lastning volumen af hver brønd bør ikke overstige 20 pi. Udfør elektroforese i 1 x kommerciel drift puffer på is i 35 min.
BEMÆRK: Load nukleare og cytoplasmatisk ekstrakts i et forhold på 1: 2 (V / V), der afspejler den samme oprindelige mængde celler. - Overførsel proteiner til PVDF-membran i 1 x kommerciel erhvervelse buffer ved 30 V i 2 timer ved 4 ° C.
- Blok membran med 5% skummetmælk i PBST (0,1% Tween 20) ved stuetemperatur i 40 min på et rysteapparat.
- Inkuber membranen med primære antistoffer (både fortyndet i 1: 1.000) i PBST (0,1%) ved 4 ° C natten over.
- Vask 3 x 10 min med PBST (0,1%) ved stuetemperatur på en ryster.
- Inkuber membranen med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-muse- eller anti-kanin sekundære antistoffer (begge fortyndet i 1: 5.000) i PBST (0,1%) ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask 3 x 10 min med PBST (0,1%) ved stuetemperatur på en ryster.
- Brug 0,2 ml forøget kemiluminescens (ECL) substrat blanding pr cm2 membran, inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter. Undgå alt lys fra dette trin fremefter undtagen rødt lys.
- Kassér væske og udsættes for en røntgenfilm i en film kassette. Udvikle film ved anvendelse af en automatisk film processing maskine.
2. Immuncytokemi og Proximity ligeringsassayet
- Seed HEK293-celler ved 1,5 x 10 4 celler pr kammer i en 8-kammer poly-D-lysin belagt objektglas i 0,4 ml DMEM suppleret med 10% FBS og 100 U / ml Pen-Strep.
- Grow celler i 48 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Aspirer medium, og løse celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer PFA, og vask 3 x 10 min med 0,5 ml PBS pr kammer.
- Permeabilisere og blokere celler med 0,5% Triton X-100 og 5% normalt gedeserum (NGS) i PBS ved stuetemperatur i 1 time.
- Inkuber med primære antistoffer i 0,1% Triton X-100 og 5% NGS i PBS på en ryster ved 4 ° C natten over. Fortynd monoklonalt muse-anti-NF90-antistof og kanin polyklonalt anti-Rbm3 antistof 1: 100 i PBS i dobbelt-farvning. For negativ kontrol udelade uafhængigt en af de to primære antistoffer, og udelade begge antistoffer i en tredje kontrol.
BEMÆRK: Brug ikke kommerciel blokering og fortynding reagenser. - Vask 3 x 10 min med 0,5 ml PBS pr kammer.
- Med forbehold for immuncytokemi eller nærhed ligeringsassayet protokoller
- immuncytokemi
- Inkuber med 1: 500 fortyndet grønt fluorescerende farvestof-koblede anti-muse og røde fluorescerende farvestof-koblede anti-kanin sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time. Undgå lys fra dette trin fremefter.
- Kontrastfarve kerner med 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) fortyndet 1: 5.000 i PBS ved stuetemperatur i 10 min.
- Vask 3 x 10 min med 0,5 ml PBS pr kammer.
- Fjern kamrene fra objektglasset og tørre. Monter med 250 μ, montering medium per dias.
- Nærhed ligeringsassayet
- Forbered nærhed ligering assayprober. Bland og fortyndes to nærhed ligering assayprober (anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer fastgjort med forskellige oligonukleotider, der kan ligerer thru tilføjelsen af to andre oligonucleotider i ligering opløsning) både 1: 5 i 0,1% Triton X-100 og 5% NGS i PBS, med et samlet volumen på 320 pi for en 8-kammer slide (ca. 40 pi per cm2) . Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Fjern kamrene fra objektglas og tilsæt de fortyndede prober. Inkuber i en fugtighed inkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Forbered ligering opløsning. Bland 8 pi ligase, 64 pi 5 x ligation lager og 248 pi H 2 O.
- Tap fra væsken fra slide, og vask 2 x 5 min i 1X vaskebuffer A (forsynet med kittet).
- Tilføj ligering opløsning og inkuber i en fugtighed inkubator ved 37 ° C i 30 minutter.
- Forbered amplifikation opløsning. Bland 4 pi polymerase, 64 pi 5x forstærkning lager og 252 pi H 2 O. Undgå lys fra dette trin og frem.
- Tap off væske fra slide, og vask 2 x 2 min i 1X vaskebuffer A.
- Tilsæt amptil forbehold opløsning og inkuber i et mørkt fugtighed inkubator ved 37 ° C i 100 min.
- Tap fra væsken fra slide, og vask 2 x 10 min i 1X vaskebuffer B (forsynet med kittet). Vask i 1 min i 0.01x Wash Buffer B.
- Tør dias og montere med 250 pi af en kommerciel montering medium (med DAPI) pr dias.
- immuncytokemi
- Undersøg fluorescerende signaler under et mikroskop ved hjælp af en 10X okular linse og 20X objektiv. Anskaf billeder ved et CCD-kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser, at NF90 og Rbm3 er begge kerneproteiner og kun en lille fraktion er til stede i cytoplasmaet. Navnlig er der tre forskellige bånd farvet positive for Rbm3. Den mindste lige under 20 kDa, afspejler den korrekte størrelse Rbm3 (den forudsagte molekylvægt Rbm3 er 17 kDa). Oprindelsen af de to andre bands mangler at blive undersøgt. Co-immunopræcipitationsforsøg med Rbm3 som agn protein afslørede, at NF90-Rbm3 interaktioner er overvejende til stede i kernen og et mindretal i cytoplasmaet. Co-immunopræcipitering data understøtter lokalisering af hvert enkelt protein.
Som vist i figur 2A, er NF90 og Rbm3 hovedsageligt placeret i kernen, men også i cytoplasmaet in situ. Begge proteiner viser perfekte co-lokalisering i begge rum. Nærhed ligeringsassayet afslørede mønsteraf NF90-Rbm3 interaktioner, hvilket er meget lig konventionel immuncytokemi, med de fleste interaktioner i nucleus i størstedelen af cellerne. Kun en lille andel af celler viste overvejende cytoplasmatisk fordeling af NF90-Rbm3 interaktioner.
Tilsammen co-immunopræcipitation og nærhed ligeringsassayet teknikker afspejler grundlæggende den samme fordeling mønster af protein-protein-interaktioner med nukleare og cytoplasmiske rum.
Figur 1: Western blot analyse af NF90 og Rbm3 og interaktion i nukleare og Cytoplasmiske Fraktioner af HEK293 Cells. Nukleare og cytoplasmiske ekstrakter blev påsat SDS-PAGE-gel i et forhold på 1: 2 (V / V), hvilket afspejler den samme mængde celler som anført i ekstraktionsprotokol. Lamin og GAPDH blev anvendt som nuklearog cytoplasmatiske markører hhv. Co-immunfældning blev udført med anti-Rbm3 antistof eller kanin-IgG som negativ kontrol. Nukleare og cytoplasmiske ekstrakter blev også inkuberet med anti-Rbm3 antistof i et forhold på 1: 2 (v / v), henholdsvis. Øverste bånd i NF90 blot indikerer 110 kDa lang isoform NF110. N: kerneekstrakt; C: cytoplasmatisk ekstrakt, IP: immunopræcipitation. Proteinmarkører blev mærket i Rbm3 positive bands. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Immunocytokemi og Proximity Ligation Assay af HEK293-celler. (A) Dobbelt-farvning af HEK293-celler med anti-NF90 (grøn) og anti-Rbm3 (rød) antistoffer. Pil viser celler med klar cytoplasmatisk co-lokalisering af NF90 og Rbm3. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). (B) Proximity ligeringsassayet med anti-NF90 og anti-Rbm3 antistoffer i HEK293-celler. Røde fluorescerende pletter indikerer NF90-Rbm3 interaktioner. Pile viser NF90-Rbm3 interaktioner i cytoplasma. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Negativ kontrol 1 (NC 1): både primære antistoffer blev udeladt. Negativ kontrol 2 (NC 2): Rbm3 primære antistof alene. Negativ kontrol 3 (NC 3): NF90 primære kun antistof. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere fordele såvel som mangler for begge metoder. Som en relativt ny teknik, en indlysende fordel ved nærhed ligeringsassayet er muligheden for at belyse protein-protein interaktioner på enkeltcelle-niveau i stedet for en batch af heterogene celler. Billeder med høj størrelsesorden og opløsning (fx ved konfokal mikroskop) giver mulighed for kvantificering ved at tælle enkelte fluorescerende pletter. I modsætning hertil kan den konventionelle kombination af co-immunoudfældning teknik med Western blot kun semi-kvantificere proteinbånd, hovedsagelig fordi en egnet ladningskontrol er vanskeligt at bestemme for IP prøver. Hertil kommer, når protein-protein-interaktion er svag eller forbigående, en stor mængde biologisk materiale, fx celler eller væv, der kræves til co-immunopræcipitation eller et kunstigt overekspression systemet med smeltet tag træffes for at øge chancen for at detektere interaktioner . Alternativt, afsløring techniques med høj følsomhed, såsom massespektrometri kan forbedre eksperimentet kvalitet. Men i forhold til mængden af udgangsmateriale nærhed ligeringsassayet metode har klare fordele. Kun er påkrævet nogle få celler, forudsat en høj kvalitet af antistoffer er givet. Endvidere i vævsprøver in situ visualisering af protein-protein-interaktioner i forskellige vævsstrukturer og celletyper kan opnås ved nærhed ligeringsassayet, i et lignende mønster som normalt immunhistokemi. I modsætning hertil co-immunofældning er ved sin karakter er uegnet til at vise den rumlige fordeling af protein-protein interaktioner.
I celler med store kerner men små cytoplasmatiske rum, er nærhed ligeringsassayet metode begrænset i at analysere nukleare-cytoplasmatisk fordelinger og traditionel co-immunpræcipitering har sin egen overlegenhed. For eksempel i T lymfocyt-cellelinier, fx Jurkat celler, nuklear-cytoplasmatisk distridrag af NF90-Rbm3 interaktion ved nærhed ligeringsassayet teknik er begrænset, fordi kernen optager næsten hele rummet inde i cellen, og det er vanskeligt at identificere grænsen af det cytoplasmatiske rum. Dette kan være et fælles problem for immuncytokemi i almindelighed, når kernen-cytoplasma forholdet er yderst ubalanceret. Men co-immunoudfældning i denne situation er ikke omfattet af denne begrænsning.
En særlig bekymring nærhed ligeringsassayet er, om signalerne fra nærhed ligeringsassayet repræsenterer direkte eller indirekte protein-protein interaktioner. Både NF90 og Rbm3 har RNA-bindende egenskaber og deres interaktion er afhængig RNA, som rapporteret i vores tidligere undersøgelse 7. Således forbehandling af cellelysater med RNase opløser interaktion mellem NF90 og Rbm3 og intet er detekterbar ved co-immunoudfældning metode 7. Imidlertid er nærhed ligeringsassayet signal ikke påvirketselv om en RNA-afhængig protein-protein-interaktion mister de RNA-species, som det er genereret, når afstanden mellem to proteiner er mindre end 40 nm, hvilket er normalt betragtes som en direkte interaktion. Denne egenskab af nærhed ligeringsassayet kan overvinde tekniske problemer fra co-immunopræcipitation, såsom RNase-frigivelse i cellelysat, som kan ophæve de interaktioner, der kræver RNA mægling. Men på den anden side nærhed ligeringsassayet metode kan også generere falske positive signaler, hvis den RNA-afhængige protein-protein-interaktion ikke faktisk eksisterer på grund af mangel på specifik RNA i fysiologiske betingelser.
Et andet spørgsmål, der fortjener særlig opmærksomhed, er specificiteten af primære antistoffer og muligheden for proteinisoformer, forstadier og proteinaggregater. Vi observerede ved Western blot, at den lange NF90 isoform, NF110, er meget mindre rigelige i både kerne og cytoplasma i HEK293-celler sammenlignet med NF90 (Figur 1). , Co-immunpræcipitering unraveled dog en højere bindingsaffinitet NF110 at Rbm3 især i kernen. Tre vigtigste bånd blev opdaget i Rbm3 blots i nucleus, men kun 20 kDa normal Rbm3 bånd blev hovedsageligt observeret i cytoplasmaet. Hvorvidt de to andre 50 kDa og 100 kDa afspejler Rbm3 isoformer, prækursorer, proteinaggregater med bundet Rbm3 eller skyldtes uspecifikke baggrund mangler at blive belyst. I stedet idet tilstedeværelse ligering assay er baseret på immunfarvning, nærhed ligeringsassayet kan ikke skelne forskellen blandt forskellige protein-isoformer, prækursorer, aggregater eller uspecifik farvning, mens co-immunofældning kan give mere information om antistofspecificitet eller proteinisoformer og prækursorer end nærhed ligeringsassayet i efterforskningen protein-protein interaktioner. Med hensyn Rbm3, når de overvejer alle tre Rbm3 bands observeret i kernen, Western blot resultat er i overensstemmelse med en fremherskende kerner localizatipå af Rbm3 observeret ved immunfarvning.
Afslutningsvis begge co-immunfældning og nærhed ligeringsassayet teknikker har iboende fordele og begrænsninger. I mange tilfælde, de producerer ensartede resultater, men det er fordelagtigt at anvende begge teknikker, når systematisk at undersøge visse protein-protein-interaktion. Men i særlige tilfælde eller med særligt formål, kunne man vise overlegenhed end den anden. For nylig har nærhed ligeringsassayet blevet anvendt til screening af protein-protein-interaktioner til at udvikle hidtil ukendte prognostisk markører 12. Protein-protein-interaktion anses som en mere pålidelig biomarkør end et enkelt protein. I fremtiden kan nærhed ligeringsassayet potentielt blive en hurtig og pålidelig måde at analysere protein-protein-interaktioner som diagnostiske og prognostiske biomarkører i klinikker, selv om identifikation og karakterisering af disse biomarkører stadig kræver den konventionelle co-immuoprecipication migThOD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
