Introduction
Nucleaire factor 90 (NF90) is een multi-isovorm eiwit met tal van functies, waaronder de reactie op virale infectie, regulering van interleukine-2 post-transcriptie en regulering van miRNA biogenese 1-3. RBM3 een RNA-bindend eiwit, die deze vertaling en miRNA biogenese en kan worden geïnduceerd door verschillende stressoren waaronder hypothermie en hypoxie 4-6. Onlangs vonden we NF90 en RBM3 in een eiwitcomplex 7. De interactie van NF90 en RBM3 essentieel eiwit kinase RNA-achtige endoplasmatisch reticulum kinase (PERK) moduleren in ongevouwen eiwit reactie 7. Zowel NF90 en RBM3 bevinden zich hoofdzakelijk in de kern, maar een klein deel van NF90 en RBM3 shuttle naar het cytoplasma en binden er elkaar voor specifieke functies, bijv PERK activiteit te reguleren. Daarom is het belangrijk om de distributie van NF90-RBM3 interacties visualiseren subcellulair compartiment die kunnen duidenhun verschillende rollen in respectievelijke compartimenten.
Decennia geleden, gist twee-hybride (Y2H) ontwikkeld om de interactie te detecteren tussen twee eiwitten 8. Echter, als gevolg van kunstmatige constructie van gefuseerde eiwitten, vals-positieve resultaten van de toepassing van deze methode beperkt. Lange tijd, co-immunoprecipitatie was hoofdtechniek analyseren eiwit-eiwit interacties, vooral bij endogene omstandigheden 9. Aan de gezamenlijk immunogeprecipiteerd eiwitcomplex analyseren Western blot is de meest geschikte techniek, terwijl massaspectrometrie wordt gebruikt bij super gevoeligheid en nauwkeurigheid gewenst. De laatste jaren heeft nabijheid ligatie assay ontwikkeld als een nieuwe methode om eiwit-eiwit interacties in zowel cellen en weefsels te detecteren in situ 10,11.
Hier hebben we de meest populaire co-immunoprecipitatie en relatief nieuwe methode nabijheid ligatie assay werkwijze vastleggen NF90-RBM3 interactie in subcellulaire fracties. We hebben ook gesproken over de voordelen en beperkingen van beide technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Co-immunoprecipitatie
- Zaad HEK293 cellen bij 2 x 10 5 cellen per putje in een 6-well plaat in 2 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) supplement met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U / ml penicilline-streptomycine (Pen-Strep) .
- Kweek cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Was de cellen met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) driemaal. Oogst de cellen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Bereid nucleaire en cytoplasmatische fracties behulp van commerciële nucleaire en cytoplasmatische extractie reagentia. Volg de instructies van de fabrikant met enkele wijzigingen.
- Gebruik 3 x 10 6 cellen voor een co-immunoprecipitatie-experiment (ongeveer 90% samenvloeiing van 3 putjes van een 6-wells plaat). Voeg 300 ul koude cytoplasmatische extractieoplossing (CER I) en vortex gedurende 15 seconden op de hoogste snelheid.
- Incubeer gedurende 30 min op ijs. Tijdens incubatie Vortex 5 sec elke 10 min.
- Voeg 16,5 ul koude cytoplasma extractie-oplossing II (CER II), vortex gedurende 5 seconden en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
- Vortex gedurende 5 seconden en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Transfer supernatans (cytoplasmatisch extract) in een nieuwe pre-gekoelde buis, en blijf op ijs tot gebruik.
- Wassen onoplosbare pellets (bevattende kernen) drie maal met 1 ml koude PBS telkens op en neer te pipetteren vijf keer. Verwijder PBS na het wassen.
- Voeg 150 ul koude nucleaire extractie-oplossing (NER), vortex gedurende 15 sec en incubeer 1 uur op ijs. Tijdens incubatie vortex gedurende 15 seconden en 10 maal pipet met een 200 ul tip elke 10 min.
- Vortex gedurende 15 s en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Transfer supernatant (kernextract) in een nieuwe voorgekoeld buis, houdt op ijs tot gebruik.
- Neem 10% van het volume van de nucleaire en cytoplasmatische extracten elk als ingangen.
- EENdd koude PBS om de resterende fragmenten tot een eindvolume van 1 ml. Blijf op ijs tot gebruik.
OPMERKING: Pre-clearing niet essentieel is bij het gebruik van Proteïne G-geconjugeerde magnetische korrels. Echter, als de achtergrond hoge Voer pre-clearing door het incuberen van 40 pl Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels (50% suspensie) en 1 ml verdunde lysaat van deze stap op 4 ° C gedurende 30 minuten op een rotator. Aparte supernatant (pre-geklaard lysaat) uit kralen met magnetische rek. Gooi de kralen. - Te koppelen primair antilichaam met Proteïne G-geconjugeerde magnetische korrels, incubeer 40 ul Proteïne G-geconjugeerde magnetische korrels (50% slurry) met 4 ug konijn polyklonaal anti-RBM3 antilichaam of konijnen IgG (negatieve controle) in 200 pl PBS plus Tween 20 buffer (PBST, 0,02% Tween 20) bij kamertemperatuur (KT) gedurende 40 minuten op een rotator.
- Aparte antilichaam-gekoppelde kralen en supernatant met een magnetische rek, en gooi de supernatant. Was de parels eenmaal met 200 pi PBST (0,02%).
- Voeg 1ml verdunde lysaten (of eventueel vooraf geklaard lysaten) aan de korrels, en incubeer op rotator bij 4 ° C overnacht.
- Op de volgende dag, scheiden de kralen en supernatant door een magnetisch rek, en gooi de supernatant. Was 3 x 10 min met 0,5 ml PBST (0,02%) voor elke buis bij 4 ° C op een rotator met een vaste snelheid van 20 rpm.
- Elueer eiwitten van de bolletjes door toevoeging 40 pl monsterbuffer (1x commerciële monsterbuffer en 50 mM 1,4-dithiothreitol (DTT)). Verhit bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Spin down en overdracht vloeistoffen naar een nieuwe 1,5 ml buis.
- Verdun ingang lysaten in monsterbuffer (eindconcentratie: 1x commerciële monsterbuffer en 50 mM DTT) en verwarm bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Load input en immunologisch neergeslagen eiwitten van de laatste stap een prefab 4-12% bis-Tris gel. Het laadvolume van elk putje mag niet meer dan 20 pl. Voeren elektroforese in 1 x loopbuffer commerciële op ijs gedurende 35 min.
LET OP: Load nucleaire en cytoplasmatische extracts in een verhouding van 1: 2 (V / V), die dezelfde oorspronkelijke hoeveelheid cellen weerspiegelt. - Transporterende eiwitten op PVDF membraan 1x commerciële overdracht buffer bij 30 V gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Blok membraan met 5% magere melk in PBST (0,1% Tween 20) bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten op een schudapparaat.
- Incubeer het membraan met primaire antilichamen (zowel verdund in 1: 1000) in PBST (0,1%) bij 4 ° C overnacht.
- Was 3 x 10 minuten met PBST (0,1%) bij kamertemperatuur op een schudinrichting.
- Incubeer membraan met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-muis of anti-konijn secundaire antilichamen (zowel verdund in 1: 5000) in PBST (0,1%) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was 3 x 10 minuten met PBST (0,1%) bij kamertemperatuur op een schudinrichting.
- Gebruik 0,2 ml versterkte chemiluminescentie (ECL) substraatmengsel per cm2 membraan geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Vermijd alle licht van deze stap verder met uitzondering van rode lichten.
- Gooi vloeistof en blootstellen aan een röntgenfilm in een filmcassette. Ontwikkel film met behulp van een automatische film prHOUTBEWERKINGS machine.
2. Immunocytochemie en Proximity Ligatie Assay
- Zaad HEK293 cellen bij 1,5 x 10 4 cellen per kamer in één 8-kamer poly-D-lysine gecoate dia in 0,4 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 100 U / ml Pen-Strep.
- Kweek cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Aspireren medium en vast de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspireren PFA, en wassen 3 x 10 min met 0,5 ml PBS per kamer.
- Doorlaatbaar en blok cellen met 0,5% Triton X-100 en 5% normaal geit serum (NGS) in PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Incubeer met primaire antilichamen in 0,1% Triton X-100 en 5% NGS in PBS op een schudder bij 4 ° C overnacht. Verdunde monoklonaal anti-NF90-antilichaam en konijn polyklonaal anti-RBM3 antilichaam 1: 100 in PBS dubbele kleuring. Voor negatieve controle, onafhankelijk weglaten van beide primaire antilichamen en weglaten beide antilichamen in een derde controle.
NB: Gebruik geen commerciële blokkeren en verdunnen van reagentia. - Was 3 x 10 min met 0,5 ml PBS per kamer.
- Onderworpen aan immunocytochemie of proximity ligation assay protocols
- immunocytochemie
- Incuberen met 1: 500 verdund groene fluorescente kleurstof gekoppeld anti-muis en rode fluorescerende kleurstof-gekoppelde anti-konijn secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Vermijd het licht van deze stap verder.
- Tegenkleuring kernen met 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) verdund 1: 5000 in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Was 3 x 10 min met 0,5 ml PBS per kamer.
- Verwijder de kamers van het glasplaatje en droog. Monteer met 250 μ, montage medium per slide.
- Proximity ligation assay
- Bereid nabijheid ligatie assay probes. Meng en verdun twee proximity ligation assay probes (anti-muis en anti-konijn secundaire antilichamen bevestigd met verschillende oligonucleotiden die th kan ligerenruwe toevoeging van twee andere oligonucleotiden ligatie oplossing) zowel 1: 5 in 0,1% Triton X-100 en 5% NGS in PBS, met een totaal volume van 320 ui voor een 8-kamer schuif (ongeveer 40 pi per cm 2) . Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Verwijder de kamers van het glasplaatje en voeg de verdunde probes. Incubeer in een vochtige incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Bereid ligatie oplossing. Meng 8 ui ligase, 64 ui 5 x ligatie voorraad en 248 ul H 2 O.
- Tik de vloeistof af van de glijbaan, en was 2 x 5 min in 1x Wash Buffer A (geleverd bij de kit).
- Voeg ligatie-oplossing en incubeer in een vochtige incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Bereid amplificatie oplossing. Mix 4 pl polymerase, 64 pi 5x versterking voorraad en 252 ul H 2 O. Vermijd licht van deze stap verder.
- Tik off vloeistof van de glijbaan, en was 2 x 2 min in 1x Wash Buffer A.
- Voeg de amplification oplossing en incubeer in het donker vochtigheid incubator bij 37 ° C gedurende 100 min.
- Tik de vloeistof af van de glijbaan, en was 2 x 10 minuten in 1 x Wash Buffer B (geleverd bij de kit). Was gedurende 1 minuut in 0.01x Wash Buffer B.
- Droog de glijbaan en monteer met 250 pi van een commercieel montage medium (met DAPI) per slide.
- immunocytochemie
- Onderzoek fluorescentiesignalen onder een microscoop met een 10x oculair en 20X objectief. Acquire beelden van een CCD-camera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont aan dat NF90 en RBM3 zowel kerneiwitten en slechts een kleine fractie aanwezig in het cytoplasma. Met name zijn er drie verschillende banden gekleurd positief voor RBM3. De kleinste net onder 20 kDa geeft de juiste maat van RBM3 (het voorspelde molecuulgewicht van RBM3 is 17 kDa). De oorsprong van de twee andere banden nog worden onderzocht. Co-immunoprecipitatie experimenten met RBM3 als lokaas eiwit bleek dat NF90-RBM3 interacties overwegend in de kern en een minderheid in het cytoplasma. Co-immunoprecipitatie gegevens ondersteunen de lokalisatie van elk afzonderlijk eiwit.
Zoals getoond in figuur 2A, worden NF90 en RBM3 voornamelijk in de nucleus, maar ook in het cytoplasma in situ. Beide eiwitten tonen perfecte co-localisatie in beide compartimenten. Proximity ligation assay onthulde het patroonvan NF90-RBM3 interacties, die sterk lijkt op gebruikelijke immunocytochemie meeste interacties in nucleus meeste cellen. Slechts een klein deel van de cellen toonde overwegend cytoplasmatische verdeling van NF90-RBM3 interacties.
Samen genomen, co-immunoprecipitatie en nabijheid ligatie assay technieken tijdens principe hetzelfde verspreidingspatroon van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische compartimenten.
Figuur 1: Western Blot Analyse van NF90 en RBM3 en hun interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties van HEK293 cellen. Kern- en cytoplasma-extracten werden geladen op SDS-PAGE gel in een verhouding van 1: 2 (V / V), dat volgens dezelfde hoeveelheid cellen zoals in de extractie protocol. Lamine en GAPDH werden als nucleaireen cytoplasmatische markers respectievelijk. Co-immunoprecipitatie werd uitgevoerd met anti-RBM3 antilichaam of konijn IgG als negatieve controle. Kern- en cytoplasma-extracten werden ook geïncubeerd met anti-RBM3 antilichaam in een verhouding van 1: 2 (v / v), respectievelijk. Bovenste band in NF90 vlek geeft 110 kDa lange isovorm NF110. N: nucleair extract; C: cytoplasma-extract, IP: immunoprecipitatie. Eiwit markers werden gelabeld voor RBM3 positieve bands. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: immunocytochemie Proximity Ligatie Assay van HEK293 cellen. (A) dubbel-kleuring van HEK293 cellen met anti-NF90 (groen) en anti-RBM3 (rood) antilichamen. Pijl tonen cellen met heldere cytoplasmatische co-lokalisatie van NF90 en RBM3. Kernen werden tegengekleurd met DAPI (blauw). (B) Proximity ligatie assay met anti-NF90 en anti-RBM3 antilichamen in HEK293 cellen. Rode fluorescerende vlekken geven NF90-RBM3 interacties. Pijlen geven NF90-RBM3 interacties in cytoplasma. Kernen werden tegengekleurd met DAPI (blauw). Negatieve controle 1 (NC 1): zowel de primaire antilichamen werden weggelaten. Negatieve controle 2 (NC 2): RBM3 enkele primaire antilichaam alleen. Negatieve controle 3 (NC 3): NF90 enkele primaire alleen antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende voordelen evenals tekortkomingen voor beide methoden. Als relatief nieuwe techniek, een duidelijk voordeel van nabijheid ligatie assay is het haalbaar om eiwit-eiwit interacties op single-cell level in plaats van een partij van heterogene cellen helderen. Beelden met een hoge resolutie en omvang (bijvoorbeeld door confocale microscoop) de mogelijkheid voor de kwantificering door het tellen van enkele fluorescerende vlekken. Daarentegen kan de conventionele combinatie van co-immunoprecipitatie techniek Western blot enige semi-kwantificeren eiwitbanden, vooral omdat een geschikte beladingscontrole moeilijk te bepalen IP monsters. Bovendien, als eiwit-eiwit interactie zwak of kortstondige, een grote hoeveelheid biologisch materiaal, bijvoorbeeld cellen of weefsels, vereist co-immunoprecipitatie of artificiële overexpressie systeem met vergroeide tag wordt toegepast om de kans om de interacties te detecteren verbeteren . Als alternatief, detectie techniques met een hoge gevoeligheid, zoals massaspectrometrie kan het experiment kwaliteit te verbeteren. Echter, met betrekking tot de hoeveelheid uitgangsmateriaal de nabijheid ligatie assay methode heeft duidelijke voordelen. Slechts weinig cellen nodig, voorzien van een hoge kwaliteit van antilichamen gegeven. Verder in weefselmonsters, in situ visualisatie van eiwit-eiwit interacties in verschillende weefselstructuren en celtypes kan door nabijheid ligatie assay, wordt een vergelijkbaar patroon als normaal immunohistochemie. Daarentegen, co-immunoprecipitatie van nature niet past bij de ruimtelijke verdeling van eiwit-eiwit interacties tonen.
In cellen met grote kernen maar klein cytoplasmatische compartimenten, wordt de nabijheid ligatie assay methode beperkt de analyse nucleaire cytoplasmatische verdeling en traditionele co-immunoprecipitatie zijn eigen superioriteit. Bijvoorbeeld in T-lymfocyt cellijnen, Jurkat-cellen zoals nucleaire-cytoplasmatische distributions van NF90-RBM3 interactie door de nabijheid ligatie assay techniek is beperkt, omdat de kern beslaat nagenoeg de gehele ruimte binnen de cel, en het is moeilijk om de grens van het cytoplasmatische compartiment identificeren. Dit kan een gemeenschappelijk probleem voor immunocytochemie in het algemeen, wanneer de kern-cytoplasma verhouding is zeer onevenwichtig. Echter, co-immunoprecipitatie in deze situatie niet onder deze beperking.
Een bijzondere zorg omtrent nabijheid ligatiebepaling of de signalen van de nabijheid ligatie assay vertegenwoordigen directe of indirecte eiwit-eiwit interacties. Zowel NF90 en RBM3 hebben RNA-bindende eigenschappen en hun interactie afhankelijk RNA, zoals beschreven in onze vorige studie 7. Aldus voorbehandeling van cellysaten met RNase lost interactie tussen NF90 en RBM3 en niets detecteerbaar is door co-immunoprecipitatie methode 7. Echter, de nabijheid ligatiebepaling signaal niet beïnvloedzelfs als een RNA-afhankelijke eiwit-eiwit interacties verliest het RNA species, zoals wordt gegenereerd wanneer de afstand tussen twee eiwitten is kleiner dan 40 nm, die gewoonlijk als een directe interactie beschouwd. Deze eigenschap van de nabijheid ligatie assay kan technische problemen van co-immunoprecipitatie, zoals RNase release in cellysaat dat de interacties vereisen RNA mediation kan afschaffen overwinnen. Echter, anderzijds, de nabijheid ligatie assay werkwijze kan ook leiden tot vals positieve signalen, indien het RNA-afhankelijke eiwit-eiwit interacties niet werkelijk bestaan vanwege het ontbreken van specifieke RNA in fysiologische omstandigheden.
Een andere kwestie die bijzondere aandacht verdient is de specificiteit van primaire antilichamen en de mogelijkheid van eiwit isovormen, precursoren en eiwitcomplexen. We waargenomen door Western blot dat de lange isovorm NF90, NF110, veel minder overvloedig in zowel kern en cytoplasma in HEK293 cellen in vergelijking met NF90 (Fifiguur 1). Echter, co-immunoprecipitatie ontrafeld een hogere bindingsaffiniteit van NF110 te RBM3 name kern. Drie hoofdbanden werden ontdekt in RBM3 blots in nucleus, maar alleen het 20 kDa normale RBM3 band werd voornamelijk gezien in cytoplasma. Of de twee andere 50 kDa en 100 kDa tijdens RBM3 isovormen, voorlopers, eiwitaggregaten met gebonden RBM3 of waren door onspecifieke achtergrond nog worden opgehelderd. In plaats daarvan, omdat de nabijheid ligatie assay is gebaseerd op immunokleuring, de nabijheid ligatie assay kan geen onderscheid te maken tussen verschillende proteïne isovormen, voorlopers, aggregaten of niet-specifieke kleuring, terwijl co-immunoprecipitatie meer informatie over antilichaamspecificiteit of eiwit isovormen en precursors dan kan bieden nabijheid ligatie assay onderzoeken eiwit-eiwit interacties. Met betrekking tot RBM3, bij het overwegen van alle drie RBM3 bands waargenomen in de kern, de Western Blot resultaat is consistent met een overheersende kernen localizatieen van RBM3 waargenomen door immunokleuring.
De conclusie die co-immunoprecipitatie en nabijheid ligatie assay technieken intrinsieke voordelen en beperkingen. Vaak veroorzaken ze consistente resultaten, maar het is voor beide technieken bij systematisch onderzoek bepaalde eiwit-eiwit interactie. In bijzondere gevallen of bepaald doel, kon superioriteit dan de andere tonen. Onlangs heeft nabijheid ligatie assay gebruikt voor het screenen van eiwit-eiwit interacties op nieuwe prognostische markers 12 ontwikkelen. Eiwit-eiwit interacties wordt beschouwd als een biomarker betrouwbaarder dan een enkel eiwit. In de toekomst kan de nabijheid ligatie assay mogelijk geworden een snelle en betrouwbare manier om eiwit-eiwit interacties als diagnostische en prognostische biomarkers in klinieken analyseren, hoewel de identificatie en karakterisering van deze biomarkers nog de gebruikelijke co-immuoprecipication me vereistThOD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
