Introduction
Ядерный фактор 90 (NF90) является мульти-изоформы белка с многочисленными функциями , включая ответ на вирусную инфекцию, регуляции интерлейкина-2 после транскрипции и регуляции миРНК биогенеза 1-3. RBM3 представляет собой РНК-связывающий белок, участвует в переводе и микроРНК биогенеза и могут быть вызваны различными стрессорами включая гипотермию и гипоксией 4-6. В последнее время мы нашли NF90 и RBM3 в белковом комплексе 7. Взаимодействие NF90 и RBM3 имеет важное значение для модуляции РНК-как эндоплазматический ретикулум киназы (PERK) активность протеинкиназы в развернутом ответе белка 7. Оба NF90 и RBM3 расположены преимущественно в ядре , но небольшая часть NF90 и челнока RBM3 в цитоплазму и связываются там друг с другом для определенных функций, например , для регулирования Перк активности. Поэтому, важно, чтобы визуализировать распределение NF90-RBM3 взаимодействий в субклеточном отсеке, что может указывать наих различные роли в соответствующем отсеке.
Несколько десятилетий назад, был разработан дрожжи двух гибридных (Y2H) для определения взаимодействия между двумя белками 8. Тем не менее, из-за искусственной конструкции слитых белков, ложноположительных результатов ограничили применение этого метода. В течение долгого времени, со-иммунопреципитации была основным методом для анализа белок-белковых взаимодействий, особенно в условиях эндогенными 9. Для анализа со-иммунопреципитации белкового комплекса, Вестерн-блот является наиболее удобным способом, в то время как масс-спектрометрия используется, когда супер чувствительность и точность желательны. В последние годы, близость Лигирование анализ был разработан в качестве нового способа выявления белок-белковых взаимодействий в обеих клетках и тканях на месте 10,11.
Здесь мы сравнили самый популярный метод совместного иммунопреципитации и относительно новое соседство перевязки метод анализа в захвате NF90-RBM3 взаимодействие в субклеточных фракциях. Мы также обсудили преимущества и недостатки обоих методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Со-иммунопреципитации
- Семенной НЕК293 в 2 х 10 5 клеток на лунку в одном 6-луночные планшеты в 2 мл модифицированной среде Игла (DMEM) добавка Дульбекко Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина (Pen-Strep) ,
- Рост клеток в течение 48 ч при 37 ° С с 5% CO 2.
- Промыть клетки с холодным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) в три раза. Урожай клетки центрифугированием при 500g в течение 5 мин при 4 ° С.
- Подготовка ядерных и цитоплазматических фракций с использованием коммерческих реагентов ядерных и цитоплазматических извлечения. Следуйте инструкциям изготовителя с некоторыми изменениями.
- С помощью 3 х 10 6 клеток для одного со-иммунопреципитации эксперимента (примерно с 90% сплошности из 3 -х скважин из одного 6-луночный планшет). Добавьте 300 мкл холодного цитоплазматический экстракционного раствора (CER I) и вихрь в течение 15 секунд при максимальной скорости.
- Инкубировать в течение 30 мин на льду. Во время инкубации, vorteх в течение 5 секунд каждые 10 мин.
- Добавить 16,5 мкл холодного цитоплазматический экстракции раствора II (CER II), вихревое течение 5 сек и инкубировать в течение 5 минут на льду.
- Вихревые в течение 5 секунд и центрифуге при 16000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
- Перенести супернатант (цитоплазматический экстракт) в новую предварительно охлажденной трубки, и держать на льду до использования.
- Вымойте нерастворимые гранулы (содержащие ядра) три раза с 1 мл холодного PBS каждый раз с помощью пипетки вверх и вниз в пять раз. Удалить PBS после мытья.
- Добавьте 150 мкл холодного раствора ядерной экстракции (NER), вихревое течение 15 сек и инкубировать 1 час на льду. Во время инкубации, вихревое течение 15 сек и пипеткой 10 раз с наконечником 200 мкл каждые 10 мин.
- Вихревые в течение 15 с и центрифуге при 16,000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Перенести супернатант (ядерный экстракт) в новую предварительно охлажденной трубки, держать на льду до использования.
- Возьмите 10% от объема ядерных и цитоплазматических экстрактов каждый в качестве входных данных.
- д.д. холодного PBS для оставшихся экстрактов до конечного объема 1 мл. Хранить на льду до использования.
Примечание: Предварительная очистка не является существенным при использовании G-протеина с сопряженными магнитных шариков. Тем не менее, если фон высокой, выполнить предварительную очистку путем инкубирования 40 мкл протеин G-конъюгированные магнитные гранулы (50% суспензии) и 1 мл разбавленного лизата от этого шага при температуре 4 ° С в течение 30 мин на ротатора. Отдельный супернатант (предварительно очищенного лизата) из бисера с магнитной стойкой. Откажитесь бусы. - Для пары первичного антитела с белком G-конъюгированные магнитные шарики, инкубировать 40 мкл белка G-конъюгированных магнитных шариков (50% суспензии) с 4 мкг кроличьи поликлональные анти-RBM3 антителом или кроличьих IgG (отрицательный контроль) в 200 мкл PBS плюс Tween 20 буфере (PBST, 0,02% твин-20) при комнатной температуре (КТ) в течение 40 мин на поворотное устройство.
- Отдельные антитела в сочетании бусинки и супернатанта с магнитной стойке, и отбросить супернатант. Вымойте бисером один раз 200 мкл PBST (0,02%).
- Добавьте 1мл разбавили лизатов (или в случае необходимости, предварительно очищен лизатов) к гранулам, и инкубировать на ротатор при 4 ° С в течение ночи.
- На следующий день, отделить бусинки и супернатант магнитной стойке, и отбросить супернатант. Промыть 3 х 10 мин с 0,5 мл PBST (0,02%) для каждой пробирки при температуре 4 ° C на поворотное устройство с фиксированной скоростью 20 оборотов в минуту.
- Элюции белки из шариков путем добавления 40 мкл буфера для образцов (1x коммерческого буфера для образцов и 50 мМ 1,4-дитиотреитола (DTT)). Нагревают при 70 ° С в течение 10 мин. Спин вниз и транспортировки жидкостей в новый 1,5 мл трубки.
- Развести входные лизатов в буфере для образцов (конечная концентрация: 1x коммерческого буфера для образцов и 50 мМ DTT) и высокую температуру при 70 ° С в течение 10 мин. Нагрузка входы и иммунопреципитации белки от последнего шага к сборного 4-12% бис-трис-гель. Объем загрузки каждой лунки не должна превышать 20 мкл. Выполните электрофорез в 1x коммерческого рабочего буфера на льду в течение 35 мин.
Примечание: Нагрузка ядерной и цитоплазматической экстрактs в соотношении 1: 2 (V / V), который отражает то же начальное количество клеток. - Перенос белков на PVDF мембрану в 1x коммерческий буфер передачи на 30 В, в течение 2 ч при 4 ° С.
- Блок мембрана с 5% обезжиренным молоком в PBST (0,1% Tween 20) при комнатной температуре в течение 40 мин на шейкере.
- Инкубируйте мембрану с первичными антителами (как разбавленный в соотношении 1: 1,000) в PBST (0,1%) при 4 ° С в течение ночи.
- Промыть 3 х 10 мин с помощью PBST (0,1%) при комнатной температуре на шейкере.
- Инкубируйте мембраны с пероксидазой хрена (HRP) против мышиных или анти-кроличий вторичными антителами (как разбавленный в соотношении 1: 5000) в PBST (0,1%) при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промыть 3 х 10 мин с помощью PBST (0,1%) при комнатной температуре на шейкере.
- С помощью 0,2 мл усиленной хемилюминесценции (ECL) субстратной смеси на см 2 мембраны, инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Избегайте весь свет от этого шага и далее, за исключением красных огней.
- Откажитесь жидкость и подвергать воздействию рентгеновской пленки в кассете пленки. Разработка фильма с использованием автоматического пр пленкиocessing машина.
2. Иммуноцитохимическая и Пробирной Расстояние Лигирование
- Семенной НЕК293 при 1,5 х 10 4 клеток на камеру в слайде с покрытием из 8-камера поли-D-лизина в 0,4 мл DMEM с добавлением 10% FBS и 100 ед / мл Pen-Strep.
- Рост клеток в течение 48 ч при 37 ° С с 5% CO 2.
- Отберите среда, и зафиксировать клетки с 4% параформальдегида (PFA) в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Отберите PFA и мыть 3 х 10 мин с 0,5 мл PBS в камере.
- Проницаемыми и блокировать клетки с помощью 0,5% Тритона Х-100 и 5% нормальной козьей сыворотки (NGS) в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Инкубируйте с первичными антителами в 0,1% Triton X-100 и 5% NGS в PBS на шейкере при температуре 4 ° С в течение ночи. Развести мышиное моноклональное анти-NF90 антитела и кроличье поликлональное антитело против RBM3 антитела 1: 100 в PBS для двойного окрашивания. Для отрицательного контроля, опускать независимо друг от друга либо из двух первичных антител, и опускать оба антитела в третьем контролем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте коммерческую блокировку и разбавление реагентов. - Вымойте 3 х 10 мин с 0,5 мл PBS в камере.
- С учетом иммуноцитохимию или близости протоколов анализа лигирования
- Иммуноцитохимическая
- Инкубируйте с 1: 500 разбавленный зеленый флуоресцентный краситель связью анти-мышь и красный флуоресцентный краситель связью анти-кроличьи вторичные антитела при комнатной температуре в течение 1 часа. Избегайте света от этого шага вперед.
- Проводят контрастное ядер с 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI), разбавленный 1: 5000 в PBS при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Вымойте 3 х 10 мин с 0,5 мл PBS в камере.
- Удалите из камеры предметного стекла и сухой. Крепление с 250 ц, монтаж среды на слайде.
- Близость анализа лигирования
- Приготовьте Пробирной Расстояние Лигирование зондов. Смешайте и разбавьте две Пробирной Расстояние Лигирование зондов (анти-мышь и анти-кроличьи вторичные антитела, прикрепленные с различными олигонуклеотидами, которые могут перевязывать тысгрубое сложение двух других олигонуклеотидов в лигирования растворе) оба 1: 5 в 0,1% Triton X-100 и 5% NGS в PBS, с общим объемом 320 мкл в течение одного 8-камеры горкой (примерно 40 мкл на см 2) , Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Удалите камеры из предметное стекло и добавляют разбавленные зондов. Инкубируют в термостате влажности при 37 ° С в течение 1 часа.
- Приготовьте раствор перевязки. Смешайте 8 мкл лигазы, 64 мкл 5 х лигирование запас и 248 мкл H 2 O.
- Отпайки жидкость из ползуна, и мыть 2 х 5 мин в 1x промывочного буфера А (поставляется с комплектом).
- Добавить лигирования раствор и инкубировать в термостате влажности при 37 ° С в течение 30 мин.
- Приготовьте раствор амплификации. Смешайте 4 мкл полимеразы, 64 мкл 5х амплификации состава и 252 мкл H 2 O. Избегайте света от этого шага вперед.
- Отпайки жидкость из слайде, и моют 2 х 2 мин в 1x промывочного буфера А.
- Добавьте усилительРешение lification и инкубировать в темном инкубаторе влажности при 37 ° С в течение 100 мин.
- Отпайки жидкость из ползуна и промывки 2 х 10 мин в 1x промывочного буфера В (входит в комплект). Промыть в течение 1 мин в 0.01x промывочного буфера B.
- Сушат слайд и смонтировать 250 мкл коммерческой монтажной среды (с DAPI) на слайд.
- Иммуноцитохимическая
- Проверьте флуоресцентные сигналы под микроскопом с использованием 10X окуляра и 20X объектив. Получение изображений с помощью ПЗС-камеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показано , что NF90 и RBM3 являются ядерные белки и лишь небольшая часть присутствует в цитоплазме. Следует отметить, что существуют три различные полосы окрашивали позитивно для RBM3. Наименьшее чуть ниже 20 кДа отражает правильный размер RBM3 (предсказанная молекулярная масса RBM3 составляет 17 кДа). Происхождение двух других групп остается предстоит исследовать. Co-иммунопреципитации эксперименты с RBM3 как белка приманки показали, что NF90-RBM3 взаимодействия преимущественно присутствуют в ядре и меньшинство в цитоплазме. Со-иммунопреципитации данных поддерживает локализацию каждого отдельного белка.
Как показано на фигуре 2А, NF90 и RBM3 в основном расположены в ядре , но и в цитоплазме на месте. Оба белка показывают идеальную совместную локализацию в обоих отсеках. Бесконтактный анализ лигирования показал образециз NF90-RBM3 взаимодействий, что очень похожи на обычные иммуноцитохимию, при этом большинство взаимодействий в ядре в большинстве клеток. Лишь небольшая часть клеток продемонстрировали преимущественно цитоплазматический распределение NF90-RBM3 взаимодействий.
Взятые вместе, совместно иммунопреципитации и близость лигирования методы анализа отражают в основном ту же картину распределения белок-белковых взаимодействий в ядерных и цитоплазматических отсеков.
Рисунок 1: Вестерн - блот анализ NF90 и RBM3 и их взаимодействия в ядерных и цитоплазматических фракций из НЕК293 клеток. Ядерные и цитоплазматические экстракты были загружены в SDS-PAGE гель в соотношении 1: 2 (V / V), что отражает такое же количество клеток, как указано в протоколе экстракции. Ламин и GAPDH были использованы в качестве ядерногои цитоплазматический маркеры, соответственно. Co-иммунопреципитации проводили с анти-RBM3 антителом, или кролика IgG в качестве отрицательного контроля. Ядерные и цитоплазматические экстракты также инкубировали с анти-антителом RBM3 в соотношении 1: 2 (об / об) соответственно. Верхняя полоса в NF90-блоттинга показывает 110 кДа длинные изоформ NF110. N: ядерный экстракт; C: цитоплазматический экстракт, IP: иммунопреципитация. Белковые маркеры были помечены для RBM3 положительных полос. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Иммуноцитохимическая и Пробирной Расстояние Лигирование из НЕК293 клеток. (A) Дважды окрашивание НЕК293 клеток с анти-NF90 (зеленый) и анти-RBM3 (красный) антител. Стрелка показать клетки с четким цитоплазматическим совместно локализации NF90 и RBM3. Ядра контрастно с DAPI (синий). (B) Близость лигирование анализа с анти-NF90 и анти-RBM3 антител в клетках HEK293. Красные флуоресцентные пятна указывают на NF90-RBM3 взаимодействий. Стрелки показывают NF90-RBM3 взаимодействий в цитоплазме. Ядра контрастно с DAPI (синий). Отрицательный контроль 1 (NC 1): как первичные антитела были опущены. Отрицательный контроль 2 (NC 2): RBM3 одного первичного антитела только. Отрицательный контроль 3 (NC 3): NF90 один основной только антитела. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько преимуществ, а также недостатки обоих методов. Будучи относительно новой технологии, очевидное преимущество близости лигирования анализа является возможность выяснить белок-белковых взаимодействий на уровне одной клетки, а не партии разнородных клеток. Изображения с высоким разрешением и величиной (например , с помощью конфокальной микроскопии) обеспечивают возможность количественной оценки путем подсчета одиночных флуоресцирующих пятен. В отличие от этого, обычный сочетание техники совместно иммунопреципитации Вестерн-блоттинга может только полу-количественного определения белковых полос, в основном потому, что подходящая управления загрузкой трудно определить для образцов IP. Кроме того, когда взаимодействие белок-белок является слабым или транзиторную, большое количество биологического материала, например, клетки или ткани, необходим для совместной иммунопреципитации или искусственной системы с гиперэкспрессией спекшимся тег применяется для повышения возможности обнаружения взаимодействий , В качестве альтернативы, обнаружение тechniques с высокой чувствительностью, такие как масс-спектрометрии может повысить качество эксперимента. Тем не менее, в отношении к количеству исходного материала, близость метод лигирования анализ имеет явные преимущества. Лишь несколько ячеек требуется, при условии, высокое качество антител дается. Кроме того, в образцах ткани, визуализации на месте белок-белковых взаимодействий в различных тканевых структур и типов клеток в может быть достигнуто путем лигирования близости анализа, в аналогичной схеме , как и обычная иммуногистохимии. В противоположность этому, со-иммунопреципитации по своей природе неподходящими для отображения пространственного распределения белок-белковых взаимодействий.
В клетках с крупными ядрами, но небольшими цитоплазматических отсеков, близость метод лигирования анализа ограничен в анализе ядерно-цитоплазматического распределения и традиционное совместное иммунопреципитации имеет свое собственное превосходство. Например, в Т - клеточных линий лимфоцитов, например , Jurkat клетки, ядерно-цитоплазматический Distriпределения взаимодействия NF90-RBM3 близостью методике лигирование анализа ограничена, так как ядро занимает почти все пространство внутри клетки, и поэтому трудно определить границу цитоплазматической отсека. Это может быть общей проблемой для иммуногистохимии в целом, когда отношение ядро-цитоплазма крайне несбалансированным. Тем не менее, со-иммунопреципитации в этой ситуации не подпадает под это ограничение.
Одна особую озабоченность по поводу близости лигирования анализа является сигналы от анализа близости лигирования представляют собой прямые или косвенные взаимодействия белок-белок. Оба NF90 и RBM3 имеют РНК-связывающие свойства и их взаимодействие зависит от РНК, как сообщалось в нашем предыдущем исследовании 7. Таким образом, предварительная обработка клеточных лизатов с РНКазы растворяется взаимодействие между NF90 и RBM3 , и ничто не может быть обнаружено методом со-иммунопреципитации 7. Тем не менее, сигнал анализа близость Лигирование не влияетдаже если взаимодействие белок-белок РНК-зависимой теряет вид РНК, так как она генерируется, когда расстояние между двумя белками составляет менее 40 нм, что, как правило, рассматривается в качестве прямого взаимодействия. Это свойство лигационную анализа близости может преодолеть технические проблемы от сотрудничества иммунопреципитации, такие как релиз РНКазы в лизата клеток, которые могут упразднить взаимодействия, требующие РНК посредничества. Тем не менее, с другой стороны, метод анализа близость Лигирование может также генерировать ложные положительные сигналы, если взаимодействие белок-белок РНК-зависимой фактически не существует из-за отсутствия специфической РНК в физиологических условиях.
Еще один вопрос, заслуживающий особого внимания, специфика первичных антител и возможность белковых изоформ, прекурсоров и белковых агрегатов. Мы наблюдали с помощью Вестерн - блоттинга , что длинная NF90 изоформы, NF110, гораздо менее обширна , как в ядре и цитоплазме в клетках HEK293 по сравнению с NF90 (Fi1 цифра). Тем не менее, со-иммунопреципитации разгадали более высокую аффинность связывания с NF110 RBM3 особенно в ядре. Три основные полосы были обнаружены в RBM3 помарки в ядре, но только нормальная RBM3 полоса 20 кДа, в основном, наблюдается в цитоплазме. Является ли два других 50 и 100 кДа полосы отражают RBM3 изоформы, предшественники, белковые агрегаты со связанными RBM3 или были связаны с неспецифической фоне, остаются невыясненными. Вместо этого, поскольку анализ близости лигирования основан на иммунном окрашивании, анализ близости перевязка не может различать разницу между различными изоформы белка, предшественники, агрегаты или неспецифическое окрашивание, в то время как со-иммунопреципитации может предоставить более подробную информацию о антител специфичности или изоформы белка и прекурсоров, чем близость анализа лигирование при исследовании белок-белковых взаимодействий. Что касается RBM3, при рассмотрении всех трех RBM3 полос, наблюдаемых в ядре, Вестерн-блот результат согласуется с преимущественным ядрами localizatiна RBM3 из наблюдали иммунным окрашиванием.
В заключение, как со-иммунопреципитации и близость лигирования методы анализа имеют собственные преимущества и ограничения. Во многих случаях они дают стабильные результаты, но это полезно использовать оба метода, когда систематически исследуя определенный белок-белковых взаимодействий. Тем не менее, в особых случаях или с определенной цели, можно было бы показать превосходство, чем другой. В последнее время , близость Лигирование анализ используют для скрининга белок-белковых взаимодействий в разработке новых прогностических маркеров 12. белок-белкового взаимодействия рассматривается как более надежный биомаркер, чем одного белка. В дальнейшем анализ близость Лигирование потенциально может стать быстрым и надежным способом анализа белок-белковых взаимодействий в качестве диагностических и прогностических биомаркеров в клиниках, хотя идентификация и характеристика этих биомаркеров все еще требует традиционного сотрудничества immuoprecipication мнеThOD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
