Introduction
Nukleär faktor 90 (NF90) är en multi-isoform protein med många funktioner, inklusive svar på virusinfektion, reglering av interleukin-2 efter transkription och reglering av miRNA biogenes 1-3. RBM3 är ett RNA-bindande protein, involverat i översättning och miRNA biogenes och kan induceras av olika stress inklusive hypotermi och hypoxi 4-6. Nyligen fann vi NF90 och RBM3 i ett proteinkomplex 7. Interaktionen mellan NF90 och RBM3 är viktigt att modulera proteinkinas RNA liknande endoplasmatiska retiklet kinas (PERK) aktivitet i ovikt protein svar 7. Både NF90 och RBM3 ligger främst i kärnan men en liten del av NF90 och RBM3 shuttle in i cytoplasman och binda det till varandra för specifika funktioner, till exempel för att reglera PERK aktivitet. Därför är det viktigt att visualisera fördelningen av NF90-RBM3 interaktioner i subcellulär avdelning, vilket kan tyda påderas olika roller i respektive fack.
Decennier sedan, jäst två hybrid (Y2H) utvecklats för att detektera växelverkan mellan två proteiner 8. Emellertid, på grund av artificiell konstruktion av sammansmälta proteiner, har falska positiva resultat begränsat tillämpningen av denna metod. Under en lång tid, co-immunoprecipitation var huvud teknik för att analysera protein-proteininteraktioner, särskilt i endogena förhållanden 9. För att analysera sam-immunoprecipiterade proteinkomplexet, är Western blot den lämpligaste tekniken, medan masspektrometri används när super känslighet och noggrannhet önskas. Under de senaste åren har närhet ligering analys utvecklats som en ny metod för att detektera protein-proteininteraktioner i både celler och vävnader in situ 10,11.
Här, vi jämförde mest populära co-immunoprecipitation metod och relativt ny närhet ligering analysmetod fånga NF90-RBM3 interaktion i subcellulära fraktioner. Vi diskuterade också de fördelar och begränsningar av båda teknikerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Co-immunoprecipitation
- Frö HEK293 celler vid 2 x 10 5 celler per brunn i en 6-brunnars platta i 2 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) komplettera med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 100 U / ml penicillin-streptomycin (Pen-Strep) .
- Odla cellerna under 48 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Tvätta cellerna med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tre gånger. Harvest cellerna genom centrifugering vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Förbered nukleära och cytoplasmiska fraktioner med hjälp av kommersiella kärn och cytoplasmiska extraktionsreagens. Följ tillverkarens anvisningar med några ändringar.
- Använd 3 x 10 6 celler för en co-immunoprecipitation experiment (ungefär med 90% konfluens från 3 brunnar i en 6-brunnar). Tillsätt 300 pl kall cytoplasma extraktionslösning (CER I) och virvel för 15 sekunder vid högsta hastighet.
- Inkubera i 30 minuter på is. Under inkubation, vortex för 5 s var 10 min.
- Lägg 16,5 l kall cytoplasma extraktionslösning II (CER II), virvel i 5 sekunder och inkubera under 5 min på is.
- Vortex under 5 sekunder och centrifugera vid 16.000 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Överför supernatanten (cytoplasmatiskt extrakt) till en ny pre-kyld rör och hålla på is tills den användes.
- Tvätta olösliga pellets (innehållande kärnor) tre gånger med 1 ml kall PBS varje gång genom att pipettera upp och ner fem gånger. Ta bort PBS efter tvätt.
- Tillsätt 150 pl kall kärn extraktionslösning (NER), virvel för 15 sekunder och inkubera 1 timme på is. Under inkubation virvel i 15 sek och pipett 10 gånger med en 200 l spets var 10 min.
- Vortex under 15 s och centrifugera vid 16.000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Överför supernatanten (kärnextrakt) i en ny pre-kyld rör, hålla på is fram till användning.
- Ta ut 10% av volymen av nukleära och cytoplasmiska extrakt var och en såsom insignaler.
- endd kall PBS till de kvarvarande extrakt till en slutlig volym av 1 ml. Håll på is tills användning.
OBS: Pre-clearing är inte nödvändigt vid användning av Protein G-konjugerade magnetiska pärlor. Men om bakgrunden är hög, utföra pre-clearing genom inkubering 40 pl Protein G-konjugerade magnetiska pärlor (50% suspension) och 1 ml utspätt lysat från detta steg vid 4 ° C under 30 min på en rotator. Separat supernatanten (pre-klarnat lysat) från pärlor med magnetisk rack. Kassera pärlorna. - Att koppla primära antikroppen med Protein G-konjugerade magnetiska pärlor, inkubera 40 | al Protein G-konjugerade magnetiska pärlor (50% uppslamning) med 4 | ig kanin polyklonal anti-RBM3 antikropp eller kanin-IgG (negativ kontroll) i 200 | il PBS plus Tween 20-buffert (PBST, 0,02% Tween 20) vid rumstemperatur (RT) under 40 min på en rotator.
- Separat antikropp-kopplade pärlor och supernatanten med en magnetisk rack, och kassera supernatanten. Tvätta pärlorna en gång med 200 ^ il PBST (0,02%).
- Tillsätt 1ml utspädd lysat (eller om nödvändigt, pre-rensas lysat) till pärlorna, och inkubera på en rotator vid 4 ° C över natten.
- På nästa dag, separera pärlorna och supernatanten genom en magnetställning, och kassera supernatanten. Tvätta 3 x 10 min med 0,5 ml PBST (0,02%) för varje rör vid 4 ° C på en rotator med en fast hastighet av 20 varv per minut.
- Eluera proteiner från kulorna genom tillsats av 40 ^ il provbuffert (1x kommersiella provbuffert och 50 mM 1,4-ditiotreitol (DTT)). Värm vid 70 ° C under 10 min. Spinn ner och överföra vätskor till ett nytt 1,5 ml rör.
- Späd ingångs lysat i provbuffert (slutkoncentration: 1x provbuffert kommersiella och 50 mM DTT) och värm vid 70 ° C under 10 min. Laddningsingångarna och immunoutfällda proteiner från det sista steget till en förgjuten 4-12% bis-Tris-gel. Lastvolym varje brunn bör inte överstiga 20 l. Utför elektrofores i 1x kommersiell drift buffert på is under 35 minuter.
OBS: Fyll kärn- och cytoplasma-extrakts i ett förhållande av 1: 2 (vol / vol), vilket återspeglar den samma initiala mängd celler. - Överföring proteiner till PVDF-membran i 1x kommersiellt överföringsbuffert vid 30 V under 2 h vid 4 ° C.
- Blocket membran med 5% skummjölk i PBST (0,1% Tween 20) vid RT under 40 min på en skakanordning.
- Inkubera membran med primära antikroppar (både utspädd i 1: 1000) i PBST (0,1%) vid 4 ° C över natten.
- Tvätta 3 x 10 min med PBST (0,1%) vid RT på en skakare.
- Inkubera membranet med pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad anti-mus eller anti-kanin-sekundära antikroppar (både utspädd i 1: 5000) i PBST (0,1%) vid RT under 1 timme.
- Tvätta 3 x 10 min med PBST (0,1%) vid RT på en skakare.
- Använd 0,2 ml förstärkt kemiluminescens (ECL) substratblandning per cm 2 membran, inkubera vid RT i 5 min. Undvik allt ljus från detta steg framåt utom rött ljus.
- Kasta vätska och utsättas för en röntgenfilm i en filmkassett. Utveckla film med hjälp av en automatisk film processing maskin.
2. Immuncytokemi och Proximity Ligation Assay
- Frö HEK293-celler på 1.5 x 10 4 celler per kammare i en 8-kammar poly-D-lysin belagda objektglas i 0,4 ml DMEM kompletterat med 10% FBS och 100 E / ml Pen-Strep.
- Odla cellerna under 48 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Aspirera medium och fixera cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA) under 10 min vid RT.
- Aspirera PFA och tvätta 3 x 10 min med 0,5 ml PBS per kammare.
- Permeabilisera och blockera celler med 0,5% Triton X-100 och 5% normalt getserum (NGS) i PBS vid RT under 1 timme.
- Inkubera med primära antikroppar i 0,1% Triton X-100 och 5% NGS i PBS på en skakanordning vid 4 ° C över natten. Späd mus-monoklonal anti-NF90 antikropp och kanin-polyklonal anti-RBM3 antikropp 1: 100 i PBS under dubbel-färgning. För negativ kontroll, utelämna oberoende endera av de två primära antikropparna, och utelämnar både antikroppar i ett tredje kontroll.
OBS: Använd inte kommersiella blockering och utspädnings reagens. - Tvätta 3 x 10 min med 0,5 ml PBS per kammare.
- Med förbehåll för immunocytokemi eller närhetsligation analysprotokoll
- immunocytokemi
- Inkubera med 1: 500 utspätt grön fluorescerande färg-kopplad anti-mus och röda fluorescerande färgämneskopplade anti-kanin sekundära antikroppar vid RT i 1 h. Undvik ljus från detta steg framåt.
- Motfärg kärnor med 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) utspädd 1: 5000 i PBS vid RT under 10 min.
- Tvätta 3 x 10 min med 0,5 ml PBS per kammare.
- Ta kamrarna från glasskiva och torr. Montera med 250 μ, monteringsmedel per bild.
- Närhet ligering assay
- Förbered närhet ligering analyssonder. Blanda och späd två närhetsligation assay sonder (anti-mus och anti-kanin sekundära antikroppar kopplade med olika oligonukleotider som kan ligera thgrov tillägget av två andra oligonukleotider i ligeringslösning) båda 1: 5 i 0,1% Triton X-100 och 5% NGS i PBS, med en total volym av 320 | il för en 8-kammarobjektglas (omkring 40 | j, l per cm 2) . Inkubera vid RT i 20 min.
- Ta kamrarna från glasskivan och lägg de utspädda sonder. Inkubera i en fuktinkubator vid 37 ° C under 1 timme.
- Förbereda ligering lösning. Blanda 8 pl ligas, 64 pl 5 x splits lager och 248 pl H2O
- Knacka bort vätskan från bilden, och tvätta 2 x 5 min i 1x tvättbuffert A (medföljer satsen).
- Lägg ligering lösning och inkubera i en fuktinkubator vid 37 ° C under 30 min.
- Förbereda amplifiering lösning. Blanda 4 l-polymeras, 64 pl 5x förstärkning lager och 252 pl H2O Undvik ljus från detta steg framåt.
- Knacka bort vätska från bilden, och tvätta 2 x 2 min i 1x Wash Buffer A.
- Tillsätt amplification lösning och inkubera i en mörk fuktinkubator vid 37 ° C under 100 min.
- Knacka bort vätskan från bilden, och tvätta 2 x 10 min i 1x Wash Buffer B (medföljer satsen). Tvätta under 1 minut i 0.01x Wash Buffer B.
- Torka bilden och montera med 250 ul av en kommersiell monteringsmedium (med DAPI) per bild.
- immunocytokemi
- Undersök fluorescerande signaler under ett mikroskop med hjälp av en 10X okular lins och 20X objektiv. Förvärva bilder genom en CCD-kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar att NF90 och RBM3 är båda kärnproteiner och endast en liten fraktion är närvarande i cytoplasman. Noterbart är att det finns tre olika band färgade positivt för RBM3. Den minsta strax under 20 kDa visar rätt storlek på RBM3 (den förutsagda molekylvikt RBM3 är 17 kDa). Ursprunget för de två andra band återstår att undersöka. Co-immunoprecipitation experiment med RBM3 som betesproteinet avslöjade att NF90-RBM3 interaktioner är övervägande närvarande i kärnan och en minoritet i cytoplasman. Co-immunoprecipitation uppgifter stöder lokaliseringen av varje enskild protein.
Såsom visas i fig 2A, är NF90 och RBM3 huvudsakligen belägna i kärnan, utan också i cytoplasman in situ. Båda proteinerna visar perfekt samlokalisering i båda facken. Närhet ligation assay visade mönstretav NF90-RBM3 interaktioner, som är mycket lik konventionell immunocytokemi, med de flesta interaktioner i kärnan i majoriteten av celler. Endast en liten andel av celler visade övervägande cytoplasmisk fördelning av NF90-RBM3 interaktioner.
Sammantaget co-immunoprecipitation och närhet ligering analystekniker speglar i stort sett samma fördelning mönster av protein-proteininteraktioner med nukleära och cytoplasmiska fack.
Figur 1: Western blot-analys av NF90 och RBM3 och deras interaktioner i nukleära och cytoplasmiska fraktioner av HEK293-celler. Nukleära och cytoplasmiska extrakt laddades till SDS-PAGE-gel i ett förhållande av 1: 2 (volym / volym), vilket återspeglar den samma mängd celler såsom anges i extraktionen-protokollet. Lamin och GAPDH användes som kärnoch cytoplasmiska markörer, respektive. Sam-immunutfällning utfördes med anti-RBM3 antikropp eller kanin-IgG som negativ kontroll. Nukleära och cytoplasmiska extrakt inkuberades också med anti-RBM3 antikropp i ett förhållande av 1: 2 (vol / vol), respektive. Övre band i NF90 blot indikerar 110 kDa lång isoform NF110. N: kärnextrakt; C: cytoplasmatiskt extrakt, IP: immunoprecipitation. Proteinmarkörer märktes under RBM3 positiva band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Immunocytochemistry och Proximity Ligation Assay av HEK293-celler. (A) Dubbel färgning av HEK293-celler med anti-NF90 (grön) och anti-RBM3 (röd) antikroppar. Pil visar celler med klar cytoplasma samlokalisering av NF90 och RBM3. Kärnor motfärgades med DAPI (blå). (B) Läge i ligering-analys med anti-NF90 och anti-RBM3 antikroppar i HEK293-celler. Röda fluorescerande fläckarna indikerar NF90-RBM3 interaktioner. Pilar visar NF90-RBM3 interaktioner i cytoplasman. Kärnor motfärgades med DAPI (blå). Negativ kontroll 1 (NC 1): både primära antikroppar utelämnades. Negativ kontroll 2 (NC 2): RBM3 enda primär antikropp bara. Negativ kontroll 3 (NC 3): NF90 enda primär endast antikropp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera fördelar liksom brister för båda metoderna. Som en relativt ny teknik, är en uppenbar fördel av närheten ligation assay möjligheten att belysa protein-proteininteraktioner vid encelliga nivå i stället för en sats av heterogena celler. Bilder med hög magnitud och upplösning (t.ex. genom konfokalmikroskop) ger möjlighet för kvantifiering genom att räkna enskilda fluorescerande fläckar. I motsats härtill den konventionella kombinationen av co-immunoprecipitation tekniken med Western blöt kan endast semi-kvantifiera proteinband, främst eftersom en lämplig laddningskontroll är svårt att avgöra om IP-prover. Dessutom, när protein-proteininteraktion är svag eller transient, en stor mängd biologiskt material, t.ex., celler eller vävnader, krävs för sam-immunfällning eller ett artificiellt överuttrycksystem med smält tagg appliceras för att öka chansen att detektera växelverkningar . Alternativt, upptäckt techniques med hög känslighet, såsom masspektrometri kan förbättra experimentet kvaliteten. Men i förhållande till mängden utgångsmaterial närhets ligering analysmetoden har klara fördelar. Endast ett fåtal celler erfordras, förutsatt att en hög kvalitet på antikroppar ges. Vidare i vävnadsprov in situ visualisering av protein-proteininteraktioner i olika vävnadsstrukturer och celltyper kan uppnås genom närhets ligering assay, i ett liknande mönster som normal immunohistokemi. Däremot är co-immunoprecipitation genom sin natur inte lämpar att visa den rumsliga fördelningen av protein-proteininteraktioner.
I celler med stora kärnor men små cytoplasmiska fack är närhetsligation analysmetoden begränsad analys av kärn cytoplasma distributioner och traditionell co-immunoprecipitation har sin egen överlägsenhet. Till exempel, i T-lymfocytsvar cellinjer, t.ex. Jurkat celler, kärn cytoplasma distribubutions av NF90-RBM3 interaktion av närhet ligering analysteknik är begränsad, eftersom kärnan upptar nästan hela utrymmet inne i cellen, och det är svårt att identifiera gränsen för den cytoplasmatiska avdelningen. Detta kan vara ett vanligt problem för immuncytokemi i allmänhet, när kärnan-cytoplasman förhållandet är extremt obalanserad. Dock är co-immunoprecipitation i denna situation inte är föremål för denna begränsning.
En särskild oro närhet ligering analysen är om signalerna från närhetsligation assay representerar direkta eller indirekta protein-proteininteraktioner. Både NF90 och RBM3 har RNA-bindande egenskaper och deras interaktion är beroende av RNA, som rapporterats i vår tidigare studie 7. Således, förbehandling av cellysat med RNas löser interaktion mellan NF90 och RBM3 och ingenting kan detekteras genom samtidig immunoprecipitation metod 7. Dock är närheten ligation assay signal påverkas inteäven om ett RNA-beroende protein-proteininteraktion förlorar de RNA-slag, som det genereras när avståndet mellan två proteiner är mindre än 40 nm, som vanligtvis betraktas som en direkt interaktion. Denna egenskap hos närhetsligation assay kan lösa tekniska problem från co-immunoprecipitation, såsom RNas release i cellysat som kan avskaffa de interaktioner som kräver RNA medling. Men å andra sidan, närheten ligering analysmetoden kan också generera falska positiva signaler, om RNA-beroende protein-proteininteraktion faktiskt inte existerar på grund av bristen av specifik RNA i fysiologiska betingelser.
En annan fråga som förtjänar särskild uppmärksamhet är specificiteten av primära antikroppar och möjligheten att proteinisoformer, prekursorer och proteinaggregat. Vi observerade genom Western blöt att den långa NF90 isoformen, NF110, är mycket mindre rikligt förekommande i både kärnan och cytoplasman i HEK293 celler jämfört med NF90 (Figur 1). Men co-immunoprecipitation avslöjad en högre bindningsaffiniteten för NF110 att RBM3 särskilt i kärnan. Tre huvudsakliga band upptäcktes i RBM3 blöts i nucleus, men endast den 20 kDa normala RBM3 bandet huvudsakligen observerats i cytoplasman. Om de andra två 50 kDa och 100 kDa band reflekterar RBM3 isoformer, prekursorer, proteinaggregat med bunden RBM3 eller berodde på ospecifik bakgrund återstår att belysas. I stället, eftersom närhet ligering analysen är baserad på immunfärgning, närhet ligering analysen kan inte skilja mellan olika proteinisoformer, prekursorer, aggregat eller ospecifik färgning, medan co-immunoprecipitation kan ge mer information om antikroppsspecificitet eller proteinisoformer och prekursorer än närhet ligering analys för att utreda protein-proteininteraktioner. Beträffande RBM3, när man överväger alla tre RBM3 band observerades i kärnan, är Western blot resultat överensstämmer med en dominerande kärnor localizatipå av RBM3 observerats av immunfärgning.
Sammanfattningsvis, både co-immunoprecipitation och närhet ligering analystekniker har inneboende fördelar och begränsningar. I många fall, de producerar konsekventa resultat, men det är fördelaktigt att använda båda teknikerna när systematiskt undersöka vissa interaktion protein-protein. Men i särskilda fall eller med speciellt syfte, kan man visa överlägsenhet än den andra. Nyligen har närhet ligering analys använts för att skärm protein-proteininteraktioner för att utveckla nya prognostiska markörer 12. Protein-proteininteraktion är att betrakta som en mer tillförlitlig biomarkör än ett enda protein. I framtiden kan närhetsligation assay potentiellt bli en snabb och tillförlitligt sätt att analysera protein-proteininteraktioner som diagnostiska och prognostiska biomarkörer i kliniker, även om identifiering och karakterisering av dessa biomarkörer kräver fortfarande den konventionella co-immuoprecipication migThOD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
