Introduction
Nükleer faktör 90 (NF90) interlökin-2 sonrası transkripsiyonu ve miRNA biogenez 1-3 düzenlenmesi viral enfeksiyona yanıt, yönetmelik dahil olmak üzere sayısız fonksiyonları ile çok izoformu proteindir. RBM3 bir RNA bağlayıcı protein, çeviri ve miRNA biyogenezine katılan ve hipotermi ve hipoksi 4-6 dahil olmak üzere çeşitli stres tarafından uyarılan edilebilir. Son zamanlarda, bir protein kompleksi 7 NF90 ve RBM3 bulundu. NF90 ve RBM3 etkileşimi katlanmamış bir protein tepki 7 protein kinaz RNA gibi endoplazmik retikulum kinaz (PERK) aktivitesini modüle etmek için gereklidir. NF90 ve RBM3 Hem çekirdekte ama sitoplazma içine küçük bir NF90 oranı ve RBM3 mekik ağırlıklı olarak bulunduğu ve PERK aktiviteyi düzenleyen, özel fonksiyonlar için birbirlerine orada örneğin bağlama vardır. Nedenle, yeni gösterebilir, hücre içi bölmeye NF90-RBM3 etkileşimleri dağılımını görselleştirmek için önemlidirİlgili bölmeye onların çeşitli rolleri.
Yıllar önce, maya iki hibrid (Y2H) iki protein 8 arasındaki etkileşimi saptamak için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, erimiş proteinleri yapay bir yapı için, yanlış pozitif sonuçlar, bu yöntemin uygulanmasını sınırlamıştır. Uzun bir süre, ko-immünopresipitasyon özellikle endojen koşullarda 9, protein-protein etkileşimleri analiz etmek ana tekniktir. Süper hassasiyet ve kesinlik arzu edildiğinde kütle spektrometresi kullanılır ise birlikte imüno-çökeltilmiştir protein kompleksi analiz etmek için, Batı benek, en uygun bir tekniktir. Son yıllarda, proksimite ligasyonu deney yerinde 10,11 hem hücre ve dokularda protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için yeni bir yöntem olarak geliştirilmiştir.
Burada, NF9 yakalayan en popüler ko-immünopresipitasyon yöntemi ve nispeten yeni yakınlık ligasyonu tahlil yöntemi karşılaştırıldısub-hücresel fraksiyonlarında, 0 RBM3 etkileşimi. Biz de avantajları ve her iki tekniğin sınırlamaları tartışılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ko-immünopresipitasyon
- Tohum bir 6-yuvalı plaka içindeki oyuk başına 2 x 10 5 hücre HEK293 hücreleri 2 mi,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ilave 100 U / ml penisilin-streptomisin (LTR yükseltici) durumunda .
- % 5 CO2 ile 37 ° C 'de 48 saat boyunca hücrelerin büyütün.
- soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez hücreleri yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri.
- ticari nükleer ve sitoplazmik çıkarma reaktifler kullanılarak nükleer ve sitoplazmik kesirler hazırlayın. bazı değişikliklerle üreticinin talimatı uygulayın.
- Bir ko-immünopresipitasyon deneyi (bir 6-yuvalı plaka 3 kuyu ile yaklaşık olarak% 90 oranında konfluent) 3 x 10 6 hücre kullanın. en yüksek hızda 15 saniye için 300 ul soğuk sitoplazmik ekstraksiyon çözeltisi (CER I) ve vorteks ekleyin.
- Buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. İnkübasyon, vorte sırasında5 s her 10 dakika için, x.
- 5 saniye boyunca 16,5 ul soğuk sitoplazmik ekstraksiyon çözeltisi II (CER II), girdap ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,000 x g'de 5 saniye ve santrifüj vorteksleyin.
- Yeni bir ön-soğutulmuş tüp içine süpernatant (sitoplazmik ekstresi) aktarın ve kullanılıncaya kadar buz üzerinde tutmak.
- Her zaman yukarı pipetleme ve beş kat aşağı 1 ml soğuk PBS ile çözülmez topakları (içeren çekirdekleri) üç kez yıkayın. yıkamadan sonra PBS kaldırmak.
- 15 saniye süre ile 150 ul soğuk çekirdek ekstraksiyon çözeltisi (EŞ), girdap ekleyin ve buz üzerinde 1 saat inkübe edilir. İnkübasyon sırasında, 15 saniye ve pipet 200 ul ucu ile 10 kez, her 10 dakika boyunca vorteks.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de 15 saniye vorteksleyin ve santrifüjlenir.
- Yeni bir ön-soğutulmuş tüp içine süpernatant (nukleer extract) transfer kullanana kadar buz üzerinde tutmak.
- Her girdi olarak nükleer ve sitoplazmik özler hacminin% 10 çıkar.
- bir1 ml'lik bir son hacme kadar geri kalan özler, soğuk PBS dd. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin.
Not: Protein G-konjuge manyetik boncuklar kullanıldığında Ön temizleme gerekli değildir. Arka plan yüksek, ancak, 40 ul protein G-konjuge manyetik boncuk (% 50 bulamaç) ve, bir döndürücü üzerinde 30 dakika boyunca 4 ° C'de bu aşama lizat seyreltilmiş 1 ml inkübe edilerek ön temizleme yapar. Manyetik raf ile boncuklar ayrı süpernatant (önceden temizlenmiş lizat). boncuk atın. - Protein G-konjuge manyetik boncuklar ile çift primer antikor için, 4 ug tavşan poliklonal anti-RBM3 antikoru veya tavşan IgG (negatif kontrol), 200 ul PBS artı Tween 20 tamponu ile Protein G-konjuge manyetik boncuk (% 50 çamurlu) ul 40 inkübe (PBST,% 0.02 Tween 20) ile, bir döndürücü üzerinde 40 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT).
- Ayrı bir manyetik raf ile boncuk ve süpernatant antikor birleştiğinde, ve supernatant atın. 200 ul PBST (% 0.02) ile bir kez boncuk yıkayın.
- 1 eklemi tanelere lizatları (ya da gerektiğinde, önceden temizlenmiş lizatları halinde) ile seyreltildi ve gece boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
- Ertesi gün, bir manyetik raf boncuk ve süpernatant ayırın ve supernatant atın. 20 rpm sabit bir hızla, bir döndürücüde 4 ° C de, her bir tüp için 0.5 mi PBST (% 0.02) ile 3 x 10 dakika yıkanır.
- 40 ul numune tamponu (1 x ticari numune tamponu ve 50 mM 1,4-ditiyotreitol (DTT)) eklenerek boncuk proteinleri Zehir. 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtın. Yeni 1.5 ml tüp aşağı Spin ve taşıyıcı sıvılar.
- 10 dakika boyunca 70 ° C'de ve ısı (1 x ticari numune tamponu ve 50 mM DTT nihai konsantrasyon) numune tampon maddesi girdi lizatları seyreltilir. Bir prekast% 4-12 bis-Tris jel son adımdaki yük giriş ve immunoprecipitated proteinler. Her çukurun yükleme hacmi 20 ul aşmamalıdır. 35 dakika boyunca buz üzerinde 1 x ticari çalışan tamponu içinde elektroforez gerçekleştirin.
NOT: Yük nükleer ve sitoplazmik özühücrelerin aynı başlangıç miktarını yansıtır 2 (v / v), 1 bir oranda s. - 4 ° C'de 2 saat süre ile 30 V 1x ticari transfer tampon maddesi içinde PVDF membrana transfer proteinleri.
- % 5 blok membran bir karıştırıcıda 40 dakika boyunca oda sıcaklığında PBST süt (% 0.1 Tween 20) yağsız.
- gece boyunca 4 ° C'de PBST (% 0.1): Primer antikor ile membran (1000 de 1 seyreltilmiş) inkübe edin.
- bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında PBST (% 0.1) ile 3 x 10 dakika yıkanır.
- 1 saat boyunca oda sıcaklığında PBST (% 0.1): (5.000 iki 1'de seyreltilmiş) yaban turpu peroksidaz (HRP) ile membran inkübe anti-fare ya da anti-tavşan sekonder antikor ile konjüge edilmiş.
- bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında PBST (% 0.1) ile 3 x 10 dakika yıkanır.
- Cm2 zar başına 0.2 mi zenginleştirilmiş kimyasal aydınlatma (ECL) substrat karışımı kullanarak, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. kırmızı ışık hariç itibaren bu adımdan tüm ışık kaçının.
- Sıvı atın ve bir film kaseti içinde bir X-ışını filmine maruz kalmaktadır. Bir otomatik film pr kullanarak filmi geliştirmekocessing makinesi.
2. İmmünositokimya ve Proximity ligasyon Testi
- Tohum 0.4 ml DMEM içinde bir 8 bölmeli poli-D-lizin kaplı slayt bölme başına 1,5 x 10 4 hücre HEK293 hücreleri,% 10 FBS ve 100 U / ml Pen-Strep ile takviye edilmiştir.
- % 5 CO2 ile 37 ° C 'de 48 saat boyunca hücrelerin büyütün.
- Aspire ortamı ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) ile hücrelerin tespit.
- Aspire PFA ve odasının başına 0.5 ml PBS ile yıkama 3 x 10 dk.
- Permeabilize ve 1 saat oda sıcaklığında PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ve% 5 normal keçi serumu (NGS) blok hücreleri.
- gece boyunca 4 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ve% 5 NGS primer antikorlar ile inkübe edin. Fare monoklonal anti-NF90 antikoru ve tavşan poliklonal anti-RBM3 antikoru 1 seyreltin: PBS içinde 100 çift boyama. Negatif kontrol için, bağımsız bir şekilde, iki birincil antikor ya da ihmal ve üçüncü kontrol antikorları sayın.
NOT: Ticari engelleme ve seyreltilmesi reaktifleri kullanmayın. - bölme başına 0.5 ml PBS ile 3 x 10 dakika yıkanır.
- Immünsitokimya veya yakınlık ligasyon tahlil protokolleri tabi
- İmmünositokimya
- 1 ile inkübe: 500 seyreltilmiş, yeşil fluoresan boya-bağlı anti-fare ve kırmızı fluoresan boya-bağlı anti-tavşan sekonder antikor, oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. itibaren bu aşamada ışık kaçının.
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde 5000: 4 ', 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) ile karşıt çekirdekler 1 seyreltilmiştir.
- bölme başına 0.5 ml PBS ile 3 x 10 dakika yıkanır.
- cam slayt ve kuru gelen odaları çıkarın. slayt başına orta montaj, 250 mikronun ile monte edin.
- Yakınlık ligasyon tahlili
- yakınlık ligasyonu tahlil probları hazırlayın. Karıştır ve th lige farklı oligonükleotidler ile bağlı iki proksimite ligasyonu deney probları (anti-fare ve anti-tavşan sekonder antikor seyreltikBir 8 bölmeli slayt (cm2 başına yaklaşık 40 ul 320 ul toplam hacimde PBS içinde% 0.1 Triton X-100, 5 ile% 5 NGS): iki ligasyon çözeltisi içinde oligonükleotit), her iki 1 kaba ilaveli . 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- cam slayt odaları çıkarın ve sulandırılmış probları ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir inkübatörde inkübe edin.
- ligasyon çözeltisi hazırlayın. 8 ligaz ul karıştırın 64 ul 5 x ligasyonu stok ve 248 ul H 2 O
- slayt sıvıyı dokunun ve 1x Yıkama Tampon A 2 x 5 dakika yıkayın (takımla birlikte verilmektedir).
- Ligasyon çözeltisi ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de nemli bir inkübatörde inkübe.
- amplifikasyon çözüm hazırlayın. Itibaren bu aşamada ışık kaçının 4 ul polimeraz, 64 ul 5x büyütme stok ve 252 ul H 2 O karıştırın.
- slayt sıvıyı dokunun ve 1x Yıkama Tamponu A'da 2 x 2 dk yıkama
- amp eklelification çözeltisi ve 100 dakika için 37 ° C 'de karanlık bir nem inkübatöründe inkübe edin.
- slayt sıvıyı dokunun ve 1x Yıkama Tamponu B 2 x 10 dakika yıkayın (takımla birlikte verilmektedir). 0.01x Yıkama Tamponu B'de 1 dakika yıkayın
- slayt kurutun ve slayt başına (DAPI ile) ticari bir montaj orta 250 ul monte edin.
- İmmünositokimya
- 10X mercek lens ve 20X objektif lens kullanarak bir mikroskop altında floresan sinyalleri inceleyin. CCD kamera ile görüntüler elde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, NF90 ve RBM3 hem çekirdek proteinleridir ve sadece küçük bir fraksiyonu sitoplazmada mevcut olduğunu ortaya koymaktadır. Özellikle, RBM3 için pozitif boyandı üç farklı bant vardır. sadece 20 kDa altında küçük RBM3 doğru boyutunu yansıtır (RBM3 tahmin molekül ağırlığı 17 kDa olan). iki bant kökeni araştırılması devam etmektedir. yem protein olarak RBM3 ile ko-immünopresipitasyon deneyleri NF90-RBM3 etkileşimleri çekirdek ve sitoplazmada bir azınlık ağırlıklı mevcut olduğunu göstermiştir. Ko-immünopresipitasyon verileri her tek bir proteinin lokalizasyonu destekler.
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, NF90 ve RBM3 özellikle çekirdekte değil, aynı zamanda in situ sitoplazmada yer almaktadır. Her iki protein de, her iki bölme mükemmel birlikte-lokalizasyonunu göstermektedir. Yakınlık ligasyon tahlil deseni ortayahücrelerin çoğunda çekirdeğin en etkileşimleri ile geleneksel immünsitokimya çok benzer NF90-RBM3 etkileşimlerin. Sadece bir hücre küçük bir oranı NF90-RBM3 etkileşimlerinin ağırlıklı sitoplazmik dağılımını gösterdi.
Birlikte ele alındığında, ko-immünopresipitasyon ve yakınlık ligasyon tahlili yöntemleri temel olarak, nükleer ve sitoplazmik bölmelerde protein-protein etkileşimleri aynı dağıtım desenini göstermektedir.
Şekil 1: NF90 ve RBM3 ve HEK293 hücreleri nükleer ve sitoplazmik kesirleri de Etkileşimleri Western Blot Analizi. Çekirdek ve sitoplazmik ekstreler bir oranda SDS-PAGE jeli ile yüklenmiştir 1: 2 (hacim / hacim), ekstraksiyon protokolü belirtildiği gibi hücrelerin aynı miktarda yansıtmaktadır. Lamin ve GAPDH çekirdek olarak kullanıldısırasıyla ve sitoplazmik belirteçler. Ko-immünopresipitasyon negatif kontrol olarak anti-RBM3 antikor veya tavşan IgG ile gerçekleştirildi. Çekirdek ve sitoplazmik ekstreleri 1 bir oranda bir anti-RBM3 antikoru ile inkübe edilmiştir: 2 (hacim / hacim), sırasıyla,. NF90 blot üst bant 110 kDa uzun izobiçimi NF110 gösterir. N: çekirdek özü; C: sitoplazmik özü, IP: immünopresipitasyon. Protein belirteçleri RBM3 pozitif bantları için işaretlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: İmmünositokimya ve HEK293 Hücrelerinin Proximity ligasyon Testi. (A) anti-NF90 (yeşil) ve anti-RBM3 (kırmızı) antikorları ile HEK293 hücreleri çift boyama. NF9 açık sitoplazmik ko-lokalizasyonu ile gösteri hücreleri ok0 ile RBM3. Çekirdekler DAPI (mavi) ile zıt. Anti-NF90 ve HEK293 hücrelerinde anti-RBM3 antikorları ile (B) 'Proksimite ligasyonu deneyi. Kırmızı floresan lekesi NF90-RBM3 etkileşimleri gösterir. Oklar sitoplazmada NF90-RBM3 etkileşimleri gösterir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile zıt. Negatif kontrol 1 (NC 1): Her iki birincil antikorlar ihmal edildi. Negatif kontrol 2 (NC 2): RBM3 tek primer antikor sadece. Negatif kontrol 3 (NC 3): NF90 tek primer antikor sadece. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her iki yöntem için çeşitli faydalar yanı sıra eksiklikler vardır. nispeten yeni bir teknik olarak, yakınlık ligasyon tahlili açık bir avantajı, tek hücre düzeyinde yerine heterojen bir hücre yığın protein-protein etkileşimlerini aydınlatmak için fizibilite olup. Yüksek büyüklükte ve (konfokal mikroskop ile) çözünürlükte Görüntüler tek floresan noktalar sayarak ölçümü için olanak sağlamaktadır. Buna karşılık, Western Blot ile ko-immünopresipitasyon tekniğinin geleneksel kombinasyonu sadece uygun bir yükleme kontrol IP örnekleri için belirlemek zordur başlıca nedeni, protein bantları yarı ölçmek olabilir. Buna ek olarak, protein-protein etkileşimi ko-immünopresipitasyon veya erimiş etiketiyle yapay aşırı ifade sistemi için gerekli olan biyolojik madde, örneğin, hücre ya da doku, büyük miktarda etkileşimlerini tespit etmek için bir şans arttırmak için uygulanır, zayıf ya da geçici olduğunda . Seçenek olarak ise, tespit tBöyle kütle spektrometresi gibi yüksek hassasiyet ile tekniki deneme kalitesini artırabilir. Bununla birlikte, başlangıç malzemesinin miktarına göre yakınlık ligasyon deney yöntemi çok avantaja sahiptir. Sadece birkaç hücre gerekmektedir antikorların yüksek kalitede verilir sağladı. Bundan başka, doku örneklerinde, dokuları ve hücre türleri farklı protein-protein etkileşimleri, in situ görselleştirme normal immünohistokimya ile benzer bir model olarak, proksimite ligasyonu tahlili ile elde edilebilir. Bunun aksine, ko-immünopresipitasyon, protein-protein etkileşimlerinin dağılımını görüntülemek için uygun olmayan doğası gereğidir.
Büyük çekirdeklerin ama küçük sitoplazmik bölmeleri olan hücrelerde, yakınlık ligasyonu tahlil metodu nükleer sitoplazmik dağılımları ve geleneksel eş-immunoprecipitation analiz kendi üstünlüğünü vardır sınırlıdır. Örneğin T lenfosit hücre çizgilerinde, örn Jurkat hücreleri, nükleer sitoplazmik distriçekirdek hücre içinde neredeyse bütün yer kaplar çünkü yakınlık ligasyon tahlili tekniği ile NF90-RBM3 etkileşim rı payı, sınırlıdır ve sitoplazmik bölmesinin sınırını belirlemek zordur. çekirdek-sitoplazma oranı son derece dengesiz olduğunda, genel olarak immünsitokimya için ortak bir sorun olabilir. Bununla birlikte, bu durumda ko-immünopresipitasyon Bu sınırlamaya tabi değildir.
yakınlık ligasyon tahlili ile ilgili özel bir endişe yakınlık ligasyon tahlili gelen sinyaller doğrudan veya dolaylı protein-protein etkileşimleri temsil olup olmadığıdır. NF90 ve RBM3 hem RNA bağlayıcı özelliklere sahiptir ve daha önceki çalışmamızda 7'de belirtildiği gibi etkileşimleri, RNA bağlıdır. Bu nedenle, RNase ile hücre lizatlarının ön-muamele NF90 ve RBM3 ve hiçbir şey arasındaki etkileşim ko-immünopresipitasyon yöntemi 7 ile tespit edilebilen çözünür. Ancak, yakınlık ligasyonu tahlil sinyali etkilenmezRNA'ya bağlı bir protein-protein etkileşimi, iki protein arasındaki mesafe genellikle doğrudan etkileşim olarak kabul edilir en az 40 nm, olduğunda oluşturuldukça RNA türlerini kaybetse bile. proksimite ligasyonu Analizin bu özelliği, RNA ilaçlara ihtiyaç etkileşimleri ortadan kaldırabilir, hücre lizatında RNaz serbest bırakma gibi ko-immünopresipitasyon teknik sorunların üstesinden gelmek için. RNA-bağımlı protein-protein etkileşimi, aslında fizyolojik şartlar spesifik RNA olmaması nedeniyle mevcut değildir, ancak, diğer taraftan, proksimite ligasyonu deney yöntemi de, yanlış pozitif sinyalleri üretebilir.
özel dikkat hak bir diğer konu da, birincil antikor spesifikliği ve protein izoformlarının öncüler ve protein agregatları olasılığıdır. Bu NF90 ile karşılaştırıldığında uzun NF90 izoformu, NF110, (Fi daha az bol HEK293 hücrelerinde hem de çekirdek ve sitoplazmada olduğu Batı lekesi ile gözlenenşekil 1). Bununla birlikte, ko-immünopresipitasyon NF110 daha yüksek bir bağlanma afinitesi, özellikle çekirdekte RBM3 için açığa çıkardı. Üç temel bant çekirdekte RBM3 blotlar keşfedilmiştir, ancak yalnızca 20 kDA, normal RBM3 grubu esas olarak sitoplazmada gözlenmiştir. Diğer iki 50 kDa ve 100 kDa bantlar bağlı RBM3 ile RBM3 izoformları, öncüleri, protein agrega yansıtan veya bağlı spesifik olmayan arka plan olup olmadığını araştırılmasına ihtiyaç vardır. yakınlık ligasyonu tahlil immün dayalı olduğu ko-immünopresipitasyon daha antikor özgüllüğü veya protein izoformlarının ve öncüleri hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir süre yerine, yakınlık ligasyon tahlili, protein izoformu, öncüleri, agrega veya belirsiz boyama farklı arasındaki farkı ayırt edemez protein-protein etkileşimleri soruşturmada yakınlık ligasyon tahlili. çekirdeğin gözlenen üç RBM3 bantları göz önüne alındığında RBM3 ile ilgili olarak, Western lekeleme sonucu baskın çekirdekleri ile tutarlıdır localizatiRBM3 on immün ile gözlemlenmiştir.
Sonuç olarak, her ikisi de ko-immünopresipitasyon ve yakınlık ligasyonu tahlil teknikleri içsel avantaj ve kısıtlamaları vardır. Bir çok durumda, bu tutarlı sonuçlar fakat sistematik olarak belirli bir protein-protein etkileşimi araştırılırken her iki tekniği de kullanmak faydalıdır. Bununla birlikte, bazı özel durumlarda veya belirli bir amaç ile, bir diğerinden daha üstün gösterebilir. Son zamanlarda, yakınlık ligasyonu tahlil yeni prognostik belirteçler 12 geliştirmek için ekran protein-protein etkileşimleri için kullanılır olmuştur. Protein-protein etkileşimi, tek bir protein daha güvenilir bir belirteç olarak kabul edilir. Bu biyomarkerların tanımlanması ve karakterizasyonu hala bana geleneksel eş-immuoprecipication gerektirir rağmen Gelecekte, yakınlık ligasyon tahlili potansiyel kliniklerde tanı ve prognostik biyolojik olarak protein-protein etkileşimleri analiz etmek için hızlı ve güvenilir bir şekilde olabilirmetod ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
