Introduction
الخلايا الفردية في عدد السكان يمكن أن تظهر استجابات متباينة على نطاق واسع لحافز موحد الفسيولوجية 1، 2، 3، 4. التباين الوراثي للخلايا في عدد السكان هو آلية واحدة لهذا التنوع من الردود، ولكن هناك أيضا العديد من العوامل غير الوراثية التي يمكن أن تزيد من تنوع الاستجابات، حتى في عدد السكان نسيلي من الخلايا. على سبيل المثال، يمكن للمستويات البروتينات الفردية وغيرها من الجزيئات يشير مهمة تختلف على أساس خلية من خلايا، مما أدى إلى اختلاف في ملامح التعبير الجيني المصب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحدث تنشيط الجينات في رشقات نارية قصيرة المدة من النصوص 5، 6 يمكن أن تقتصر على عدد قليل نسبيا من النصوص في انفجار 7، 8، 9. هذهstochasticity في تفعيل الجينات يمكن أن يساهم إلى حد كبير في التغير في الاستجابات البيولوجية ويمكن أن توفر ميزة انتقائية في الكائنات الحية الدقيقة 10 وفي خلايا الثدييات 1، 2 الاستجابة لحافز الفسيولوجية. بسبب كل من المصادر الوراثية وغير الوراثية من الاختلاف، والوضع التعبير الجيني في أي خلية معينة في استجابة لحافز قد تختلف كثيرا عن متوسط الشخصي التعبير الجيني تم الحصول عليها من قياس استجابة كبيرة. تحديد المدى الذي تظهر الخلايا الفردية التباين في استجابة لحافز يتطلب تقنيات لعزل الخلايا الفردية، وقياس مستويات التعبير عن نسخ من الفائدة، والتحليل الحسابي للبيانات التعبير الناتجة عن ذلك.
هناك عدة طرق لمعايرة التعبير الجيني في الخلايا واحد، وتغطي مجموعة واسعة من التكاليف، وعدد من النصوص سبر، ودقة القياس الكمي. على سبيل المثال، وحيدة الخلية RNA تسلسل يقدم عمق واسعة من تغطية نص والقدرة على تحديد الآلاف من النصوص المتميزة للجينات أكثر أعرب للغاية في الخلايا الفردية. ومع ذلك، فإن التكاليف المرتبطة بهذا العمق التسلسل يمكن أن تكون باهظة، على الرغم من أن تكاليف تستمر في الانخفاض. على العكس من ذلك، واحد جزيء RNA مضان في الموقع التهجين (smRNA FISH) يقدم الكمي الدقيق للنصوص حتى لأدنى مستوى في التعبير عن الجينات بتكلفة معقولة في الجينات في المصالح. ومع ذلك، سوى عدد قليل من الجينات المستهدفة يمكن يعاير في خلية معينة من قبل هذا النهج. الكمية المقايسات PCR القائم، وصفت في هذا البروتوكول، وتوفر حلا وسطا بين هذه التقنيات. هذه المقايسات توظف في الوقت الحقيقي PCR آلة الموائع الدقيقة لقياس ما يصل إلى 96 نسخ من الفائدة في وقت ما يصل الى 96 الخلايا. في حين أن كل الطرق المذكورة أعلاه لديها تكاليف الأجهزة المطلوبة، فإن تكلفة أي فحص QPCR الفردية هي نسبيامنخفض. ويتم تكييف هذا البروتوكول من واحد اقترح من قبل الشركة المصنعة للفي الوقت الحقيقي آلة PCR الموائع الدقيقة (بروتوكول ADP 41، Fluidigm). لتمكين تقدير العدد المطلق للكل نص في النهج القائم على PCR، قمنا بتوسيع بروتوكول للاستفادة من الضوابط الداخلية للamplicons الجين المستهدف مستعدة التي يمكن استخدامها عبر تجارب متعددة.
وكمثال على هذا الأسلوب، يتم وصف الكمي للتعبير عن الجينات التي تنظمها القامع البروتين p53 ورم في قدم مكعبة-7 خلايا سرطان الثدي البشرية 11. وتحدى الخلايا مع وكيل الكيميائية التي يدفع الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الاستجابة البروتين p53 على الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة يسلك قدرا كبيرا من عدم التجانس في الخلايا الفردية، سواء من حيث مستويات البروتين p53 12 و في تفعيل الجينات المستهدفة متميزة (11). وعلاوة على ذلك، البروتين p53 ينظم التعبير عن أكثر من 100تتميز جيدا الجينات المستهدفة المشاركة في العديد من مسارات المصب، بما في ذلك الاعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، والشيخوخة 13 و 14. لأن استجابة بوساطة البروتين p53 في كل خلية على حد سواء معقدة ومتغيرة، وتحليل فوائد النظام من توجه فيه ما يقرب من 100 الجينات المستهدفة يمكن سبر في وقت واحد في الخلايا الفردية، مثل تلك التي وصفها أدناه. مع تعديلات طفيفة (مثل طرق بديلة لعزل وحيدة الخلية وتحلل)، وبروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لدراسة مجموعة واسعة من أنواع الثدييات الخلية، والنصوص، والاستجابات الخلوية.
مع الإعداد المسبق السليم، ويمكن إجراء جولة من فرز الخلايا وقياس التعبير الجيني وفقا لهذا البروتوكول على مدى ثلاثة أيام. ويقترح توقيت التالية: مقدما، حدد نسخ من الفائدة، وتحديد والتحقق من صحة أزواج التمهيدي أن تضخيم [كدنا من تلك transcrIPTS، وإعداد المعايير ويمزج التمهيدي باستخدام تلك الاشعال. في يوم 1 بعد العلاج بالخلايا، والحصاد وفرز الخلايا، نفذ عكس النسخ ومحددة التضخيم الهدف، ومعالجة العينات مع نوكلياز خارجية لإزالة الاشعال الفردية. في يوم 2، نفذ مراقبة الجودة على خلايا فرز باستخدام QPCR. وأخيرا، في يوم 3، وقياس التعبير الجيني في الخلايا مرتبة باستخدام ميكروفلويديك QPCR. ويلخص الشكل 1 الخطوات المتبعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
References
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).
- Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).
- Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
- Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
- Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
- Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
- Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).
- PCR Technologies: A Technical Guide. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
- Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
- Flow Cytometry: Principles and Applications. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Real-time PCR. , Taylor & Francis. (2006).
- Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).
- Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
- Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
- Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
- Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
