Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

doi: 10.3791/55219 Published: February 25, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nüfusu tek tek hücrelerin tek tip bir fizyolojik uyarıcı, 1, 2, 3, 4 çok farklı tepkiler gösterebilirler. Bir popülasyonda hücrelerin genetik varyasyonu bu tepkilerin çeşitli mekanizmalardan biri olmakla birlikte, daha hücre klonal popülasyonunda, yanıtların çeşitliliğini artırmak olmayan çeşitli genetik faktörler de vardır. Örneğin, tek tek proteinlerin ve diğer önemli sinyal molekülleri seviyeleri, aşağı doğru gen sentezleme profillerinin değişimine yol açan, bir hücre tarafından hücre bazında değişebilir. Buna ek olarak, gen aktivasyon kaymasının 7, 8, 9 her transkript, nispeten az sayıda sınırlı olabilir transkript 5, 6 kısa süreli patlamaları oluşabilir. böyleGen aktivasyon stochasticity büyük ölçüde biyolojik yanıt değişikliklere katkıda ve fizyolojik bir uyarıcıya yanıt mikroorganizmalar 10 ve memeli hücrelerinde 1 2 seçici bir avantaj sağlayabilir. Nedeniyle değişkenlik hem genetik hem de genetik olmayan kaynaklara, bir uyarıcıya tepki olarak belirli bir hücre gen tanımlama profili dökme yanıtın ölçülmesi elde edilen ortalama gen tanımlama profili büyük ölçüde farklılık gösterebilir. tek tek hücreler bir uyarıcıya tepki olarak değişkenlik göstermektedir ne ölçüde belirlenmesi tek tek hücrelerin izole edilmesi için teknikler gerektirir, ilgi konusu transkript için ekspresyon seviyelerinin ölçülmesi, ve elde edilen sentezleme verilerinin sayısal analizi.

maliyetleri geniş bir kaplama, tek bir hücre içinde gen ekspresyonunu analiz etmek için çeşitli yaklaşımlar bulunmaktadır transkriptlerin sayısı problanmış veölçümü doğruluğu. Örneğin, tek hücreli RNA Seq transkript içerisinde ve tek tek hücreler en yüksek ölçüde sentezlenen genler için farklı transkript binlerce ölçmek için yeteneği geniş bir derinliğe sahiptir; maliyetler düşmeye devam rağmen, ancak böyle bir sıralama derinliği ile ilişkili maliyet, engelleyici olabilir. Bunun aksine, in situ hibridizasyon (smRNA FISH), tek bir molekül, RNA floresan için transkriptlerin kesin miktarının sunar daha düşük ifade ilgili gen başına makul bir maliyetle genleri; Bununla birlikte, hedef genlerin sadece az sayıda bu yaklaşım, belirli bir hücre içinde analiz edilebilir. Bu protokol açıklanan kantitatif PCR bazlı deneyler, bu teknikler arasında bir orta yol sağlar. Bu deneyler kadar 96 hücrelerinde aynı anda ilgi 96 transkript kadar ölçmek için mikroakışkan gerçek-zamanlı PCR makinesi kullanmaktadır. Yukarıda bahsedilen yöntemlerin her biri, gerekli donanım maliyetlerini olsa da, herhangi bir tek tek qPCR tahlilinde maliyeti nispetendüşük. Bu protokol, mikroakışkan gerçek-zamanlı PCR makinesi üreticisi (Protokol ADP 41, Fluidigm) önerdiği bir uyarlanmıştır. PCR-temelli yaklaşımla her transkript mutlak sayısının tahmini etkinleştirmek için, birden fazla deneyler arasında kullanılabilir Hazırlanan hedef gen amplikonlarının iç kontrollerin faydalanmak için protokol genişlettik.

Bu tekniğin bir örneği olarak, MCF-7 insan göğüs karsinoma hücrelerinde tümör baskılayıcı p53'ün düzenlenen genlerin ifadesinin ölçümü 11 tarif edilmiştir. Hücreler DNA çift iplikli tatili uyaran bir kimyasal madde ile zorlanmaktadır. Daha önceki çalışmalar, DNA çift iplikli kırılmalara p53 yanıt hem de p53 seviyeleri 12 açısından ve farklı hedef genlerin 11 aktivasyonu tek tek hücrelerin heterojenlik büyük bir sergilediğini göstermiştir. Ayrıca, p53 100 ekspresyonunu düzenleyenHücre döngüsü tutuklama, apoptozi ve yaşlanma 13, 14 dahil olmak üzere birçok aşağı akış yolakları, yer alan hedef genlerin iyi karakterize edilir. Her bir hücrede p53 aracılı tepki kompleksi hem değişken hem de olduğu bir yaklaşım sistem faydaları analizi teknikleri, yaklaşık 100 hedef genler, aşağıda anlatıldığı gibi, tek tek hücrelerin, eş zamanlı olarak incelenebilir. (Örneğin, tek hücreli izolasyonu ve liziz alternatif yöntemler olarak) hafif değişiklikler, protokol kolaylıkla memeli hücre tipleri, transkriptlerin ve hücresel tepkilerin bir geniş bir çalışma için adapte edilebilir.

Uygun önceden hazırlık, hücre sıralama ve gen ifadesi ölçüm yuvarlak üç günlük bir süre boyunca bu protokole göre yapılabilir. Aşağıdaki zamanlama önerilmektedir: önceden, ilgi transkript seçin belirlemek ve bu TRANSCR cDNA yükseltmek primer çiftleri doğrulamakIPTS ve standartları ve bu primerler kullanılarak primer karışımları hazırlayın. Gün 1, hücre tedavisi, hasat takip ve hücreleri sıralamak, ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon gerçekleştirmek ve adi primerler kaldırmak için bir eksonükleaz ile örnekleri davranın. 2. Gün, qPCR kullanılarak sıralanır hücreleri üzerinde kalite kontrolünü yapmak. Son olarak, 3. gün, mikroakışkan qPCR kullanılarak sıralanır hücrelerinde gen ifadesini ölçün. Şekil 1 ilgili adımları özetlemektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ön Hazırlık

  1. kimin ifadesi ölçülecek ilgi 96 genlerine kadar seçin.
    Not: Bu genlerin en az bir tür ACTB ya GAPDH gibi, "ev bakıcısı geni", bir olmalıdır Bu deneyde kullanılan koşullar altında nispeten yüksek ve sabit bir seviyede eksprese edildiği bilinmektedir. Bu gen, pozitif kriteri kuyu (aşama 8.1) ve çoğaltılan örnekleri (aşama 10.1) belirlemek için kullanılır.
    Not: Bu örnek deney için, bilinen fonksiyonlar 11, 14 ve bir ev bakıcısı kontrol seçilir gibi GAPDH çeşitli p53, doğrudan hedeflerin yanı sıra ile karakterize edilir. hedef genlerin ve bu çalışmada kullanılan astar dizileri tam listesi için başvuru 11 bakınız.
  2. 15 (bilimsel literatürü veya astar tasarım aracı gibi Astar-BLAST olarak kullanan, örneğin) ilgi genlerine özgü potansiyel primer çiftleri belirleyin. astar varSentezlenecek ve nükleaz içermeyen su içinde 100 uM'lik bir stok konsantrasyonunda onları korumak.
    NOT: Bu primerler 15-25 baz uzunluğunda olmalıdır; bir amplikon uzun 90-130 baz çifti (bp) üretir; bir genomik DNA'yı olasılığını azaltmak için, varsa, bir ekson bağlantısını kapsayan; 60 ± 1 ° C erime sıcaklıklarına sahiptirler; ve en az bir ikincil yapı 16 vardır. Bu primerler ilgi transkript cDNA yı çoğaltmak ve boya bazlı qPCR DNA bağlama gen ekspresyonunu ölçmek, birinci ters transkripsiyonu için kullanılacaktır.
  3. Primerler doğrulayın.
    1. İlk olarak, ilgilenilen hücrelerden cDNA'nın elde edilmesi. Üreticinin talimatları veya standart moleküler biyoloji yöntemleri 17'ye göre bir RNA hasat kiti kullanılarak hücrelerden Hasat RNA. üreticinin talimatlarına veya standart metho göre-Ters uyarlamak rastgele heksamerlerie bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak cDNA içine RNAds 17.
    2. her bir primer çifti için DNA ileri, boya ustası karışımı bağlayıcı ve geri primerler ve önceki adımda cDNA, önerilen reaksiyon koşulları için master miks üreticinin önerilerini aşağıdaki qPCR kurmak. erime eğrisi edinimi içeren master miks üreticisi tarafından önerilen bir termal döngü protokolü kullanılarak bir real-time PCR makinede bu tepkileri çalıştırın.
    3. QPCR sonra,% 2 w / v agaroz jeli üzerinde yükseltilmiş DNA örnekleri çalıştırmak ve standart bir protokol 17 Aşağıdaki bir DNA araya eklenen boyanın ile DNA görselleştirmek.
    4. CDNA seri seyreltme standart bir eğri oluşturarak primer çifti etkinliğini belirlemek standart bir protokole 16 uyarınca (adım 1.3.1 yapılan).
      NOT: İyi bir primer çifti jel 16 beklenen konumda tek bir iyi tanımlanmış tepe ve tek bir grup ile bir erime eğrisi verecektir, class = "xref"> 17 (Şekil 2) yukarı. erime eğrisi ", omuz" çoklu zirveleri ya da bir sahip veya jel birden bantları ya da bir karalama varsa, astar bir off-hedef dizisi amplifiye ise. hedef dışı dizileri yükseltmek ve gerektiğinde önceki doğrulama adımları tekrarlayın gözlenmiştir herhangi primerler yeniden tasarlamanız. İyi bir primer çifti de standart eğri 16 R 2 ≥0.985 ile, 90-110% bir verimlilik olacak; Herhangi primerler yeniden tasarlamak olan bu aralıklar dışında etkinlik veya R2 sonbahar.
  4. Saflaştırılmış DNA amplikonlarının gelen standartları hazırlayın.
    1. Her valide primer çifti için:
      1. primeri ve şablon DNA konsantrasyonları, reaksiyon koşulları ve PCR çevrim koşulları ya da bir standart PCR protokolü kullanılarak polimeraz, üretici firmanın tavsiyelerine uygun olarak, yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanılarak cDNA'dan ilgili bölgeyi yükseltin"xref"> 17.
      2. % 2 w / v agaroz jeli üzerinde büyütülmüş cDNA çalıştırın ve boya 17 interkalasyon bir DNA yapısı ile bant görselleştirmek. Temiz bir jilet kullanarak amplikon temsil bandı tüketim ve mikrosantrifüj tüp jel parçasını yerleştirin.
      3. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bu tür bir agaraz bazlı ekstre 17 ya da bir eğirme sütunlu jel özütleme kiti gibi standart jel özütleme prosedürü kullanılarak jelden amplikon saflaştınlır.
      4. üreticinin talimatlarına göre bir floresans bazlı dsDNA miktar kiti kullanılarak amplikon konsantrasyonu ölçümü. ul başına amplikon moleküllerinin sayısını elde etmek için amplikon dizisine dayanan amplikon bilinen moleküler ağırlık ile ölçülen dsDNA konsantrasyonu bölün.
      5. 2.0 ml bir düşük bağlanma mikrofüj tüpe, DNA süspansiyon tamponu hacme saflaştırılmış amplikon 2 ul şekilde amp nihai konsantrasyonLICON 5 x 10 8 molekülleri / ml.
    2. Tüm amplikonlar saflaştırılmış edildiğinde, 2.0 ml düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüp her saflaştırılmış amplikonunu 18 ul birleştirir. 1800 ul toplam hacim yapmak için, DNA süspansiyon tamponu ekleyin; Böylece, her bir amplikon konsantrasyonu 5 x 10 6 molekülleri / ml.
      Not: Bilindiği eşit mol miktarlarında ilgi tüm genlerin cDNA amplikonları ihtiva eden bu karışım, tek hücreli qPCR bir standart olarak hizmet edecektir.
    3. Girdap bu "5E6" iyice standart, 2000 x g'de 10 saniye boyunca spin ve düşük-bağlayıcı PCR tüpleri 20 ul kısma ayrılır. -80 ° C'de alikot saklayın.
  5. Belirli hedef amplifikasyon (STA) primer karışımı (10x) hazırlayın.
    1. 15 ml konik tüp içinde, (192 kadar) her 100 mcM stok astar 25 ul birleştirir. 5000 ul toplam hacim yapmak için, DNA süspansiyon tamponu ekleyin.
      NOT:Bu karışımdaki her bir primer konsantrasyonu 500 nM. sıralanmış hücrelerin her plaka başbakan ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyonu bu primer karışımının 105.6 ul kullanacaktır. Burada verilen primer karışımının hacmi sıralamak için 45 tabak yapmak için yeterlidir. Yalnızca bir kez yapılması gerekmektedir, böylece primer karışımının yeterince büyük bir hacim yapmak için tavsiye edilir; Gerektiğinde hacimleri ölçek.
    2. 110 ul kısma bölmek, vorteks ile iyice karıştırın ve -20 ° C'de alikotları saklayın.
  6. Mikroakışkan çipli qPCR kullanım için, deney karışımları, her bir primer çifti için bir hazırlayın.
    1. 96 gözlü PCR plakanın her çukuruna, belirli bir genin karşılık gelen 100 uM ters primer 3.0 ul DNA süspansiyonu tampon 24.0 ul, 2x deney yükleme reajanı 30.0 ul 100 uM ileri primer 3.0 ul birleştirme .
    2. Girdap bu plaka, -20 ° C'de 10 ila 500 xg'de saniye, ve mağaza için sıkma.
  7. İki termal döngü programları oluşturma: RTSTA (transkripsiyonu ve belirli hedef amplifikasyon ters, Tablo 1) ve EXOI (eksonükleaz I tedavisi; Tablo 2).

2. Tedavi

  1. bu deneysel çalışma koşullarına bağlı olarak, muamele süresi istenen ortak akışa kadar büyümeye örneğin bir doku kültür tabağına, memeli hücreler plaka. Bu çalışmada sunulan örnekte, plaka 4 x 10 5, MCF-7, p53-Venus hücreler 18 RPMI 6 cm tabak başına,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve şurada 250 ng /, 50% konfluent ulaşana kadar% 5 CO2 ile 37 ° C 'de iki gün ml amfoterisin B inkübe hücreleri.
  2. Deneysel çalışmaya dayalı faiz koşulu kurmak için hücreleri tedavi. Bu çalışmada sunulan Örneğin, / ml neocarzino 400 ng MCF-7 p53-Venüs hücreleri inkübe3 saat, 8.5 saat, 14 saat, veya 24 saat statin.

Hücre sıralama 3. Lizis Tampon hazırlanması

NOT: liziz tamponu tek bir levhası yapmak yaklaşık 1 saat alır. Hücre sıralama verimsiz ve hiçbir saptanabilir hücrenin birçok kuyu sağlayabilir gibi, tabak yapmak için tavsiye ve sıralama katıdır.

  1. PCR için hazırlık DNA dekontaminasyonu çözeltisi ile tezgah, pipet, tüp raf, soğuk PCR plaka sahipleri ve eldiven temizleyin.
  2. nükleaz serbest su 1.5 ml tüp stok RNAse inhibitörü ekleyerek 2.64 U / ul RNAse inhibitörü sulandırmak.
    NOT: Bu RNAse önleyici alt ul hacimli pipetleme olmadan liziz tamponu ilave edilmesini sağlar.
  3. Tablo 3'te listelenen bileşenler birleştirilerek hücreleri için lizis tamponu sağlayın.
  4. Ayrı bir tüp içine hücreleri için liziz tamponu 92.4 ul transfer; Bu amplikon standartları için lizis tamponu olacak.
  5. Kullanımı low bağlayıcı pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpleri, DNA süspansiyon tamponu ile, 200 ul ve sırasıyla 3.1 pg / ml ve 6.2 ug / ul, seyreltilmiş E.coli DNA 500 ul hazırlar.
  6. Hücreler lizis tamponu ile 3.1 ug / ul E. coli DNA 184.8 ul ekle.
    NOT: E.coli taşıyıcı DNA spesifik olmayan astar bağlanma olanakları kapsamını genişletmek ve böylece primer dimerizasyon bir PCR ürününe yol açma olasılığını azaltmak için hizmet vermektedir.
  7. Standartları hazırlayın.
    1. 5E5, 5E4, ... 5E0 altı düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin.
    2. "5E5" tüp DNA süspansiyon tamponu 90 ul ekleyin.
    3. Diğer beş tüplerin her birine 6.2 ug / ul E. coli DNA 90 ul ekle. buz üzerinde tüm tüpleri tutun.
      NOT: standartları içine taşıyıcı DNA birleştirilerek 1-hücre kuyularda karşılaştırılabilir standart kuyularda DNA'nın toplam kütlesi yapar; Bu pr azaltırstandartların konsantrasyonu tüpler veya pipet uçları bağlanması DNA etkileneceği obability.
    4. Depolama (adım 1.4 hazırlanan her amplikonunu 5 x 10 6 molekülleri / ul) "5E6" standart bir kısım alın. Vortex kısaca ve kısaca döndürün (500 xg'de 5 sn) sıvı tüpün dibinde olduğundan emin olmak için.
    5. Düşük bağlayıcı bir pipet kullanarak, "5E5" tüp 5E6 standart 10 ul ekle. kısaca Vortex, spin (500 xg'de 5 saniye) ve buz üzerinde geri tüp koymak.
    6. "5E4" tüp içine "5E5" tüp pipetle 10 ul. kısaca Vortex, spin (500 xg'de 5 saniye) ve buz üzerinde geri koymak.
    7. tüm tüpler standart bir seyreltme sahip olana kadar, bir önceki tüpten 10 ul alan her tüp, bu seri dilüsyonları tekrarlayın.
  8. kapaklar 12 PCR tüpleri bir sıra hazırlayın. Her tüpe "hücre" lizis tamponu 67 ul dağıtın. (5 tüpleri Cap ve kısaca aşağı doğru döndürünsn) 500 xg'de gerekirse.
  9. 12 kanallı bir pipet kullanılarak, bir PCR plaka (Şekil 3), ilk 7 satır her kuyuya PCR tüplerine satırında "Hücre" lizis tamponu 9 ul dağıtın.
  10. Plakanın son satırın her kuyuya "standart" lizis tamponu 7 ul dağıtın (Şekil 3).
  11. Düşük bağlayıcı pipet uçları kullanılarak, plaka haritası (Şekil 3) 'e göre alt satırda her bir kuyu için standart 2 ul ekleyin.
    NOT: vb 10 moleküller, 5 x 10 0 moleküllerinin / ul standart miktarlar 2 ul
  12. 10 hücresi ve 100 hücre kuyulara 3.1 ug / ul E. coli DNA için 2 ul ekle; Hiçbir hücre kuyulara 6.2 pg / ml E.coli DNA 2 ul ekleyin.
    Not: her 1-hücre, 10-hücresi ve 100 hücre de tek bir insan hücresinde genomik DNA kütle yaklaşan, E. coli DNA'nın 6.2 pg sahiptir. Her standart ve hiçbir hücre de 12.4 pg o vardırf E. Coli DNA yaklaşık iki insan hücrelerinin değer.
  13. Hücreler sıralama için hazır olana kadar 4 ° C'de 5 500 xg'de saniye, ve mağaza için steril bir termal mühür, spin kullanarak plaka Seal.

4. Hücre Sıralayıcısı Kurulumu

  1. Plaka harita (Şekil 3) 'e göre bir 96-yuvalı plaka içine sıralama için floresan-aktive edilmiş hücre sıralayıcı programı; Hiçbir hücre Kuyular H1-H8 veya H11-H12 halinde sıralanır edilmelidir.
  2. Hücre sıralayıcı iyi bir PCR plaka içine sıralama için amaçlanmıştır olduğundan emin olun.
    1. mümkün olan en az sıralama akımının açısını ayarlamak; Bu ayar hücreleri tarafı vurmak yerine kuyuların dipleri içine sıralanır olacağını şansını artırır.
    2. Makineyi amaçlamak, makinenin 19 talimatlarına göre, boş bir PCR plaka mühür ve boş plaka mühür üzerine PBS "sıralama" damlacıklar test akışı kullanın; damlacıkları th karaya gerekiroyuk merkezi üzerinde bir pozisyonda contanın e yüzeyi. En iyi sonuçlar için, plakanın uzunluğu ve genişliği boyunca amacı edin.
    3. damlacıkları doğru konumda arazi yoksa, mühür yüzeyini onları silip makine üreticisinin talimatlarına göre hücre sıralayıcı recalibrate ve sıralama akışında damlacıkları doğru yatırılır kadar tekrarlayın.

5. Hücre Hasat ve Sıralama

  1. hücre hattı için uygun hücreler tripsinize. Örneğin, MCF-7 hücreleri için,% 0.05 tripsin, 1 ml hücre, durulama hücrelerden ortam aspire ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin, 2 ml hücreleri inkübe .
  2. tripsinize edilmiş hücre, hücre kültürü ortamının 8 ml ilave edilir ve 15 ml'lik bir tüp hücre süspansiyonu 10 ml aktarın. 400 x g, 4 dakika boyunca santrifüj.
  3. Süpernatant aspire ve PBS +% 2 FBS içinde hücre pelletini. <br /> Not: Daha küçük tabanda hacmi hücrelerini konsantreleri ve hücre sıralama kolaylaştırır; 500 ul yeniden süspansiyon hacmi olarak% 50 kaynaşması hücrelerin 6 cm tabak için çalışır.
  4. hücre kümeleri kaldırmak için 40 mikron filtre ile, tüp sitometri pipetlenmesini akış ml bir 5 hücre süspansiyonu aktarın.
  5. Sıvı kuyu alt olduğundan emin olmak için hücreler sıralamadan önce 4 ° C'de 30 saniye boyunca 400 x g'de lizis tamponu plaka santrifüjleyin.
  6. hücre sıralayıcı hücre süspansiyonu ile tüp yerleştirin. Lizis tamponu plaka üzerinde mühür açın ve dikkatlice hücre sıralayıcı üreticinin talimatlarına 19 plakalı haritasına aşağıdaki göre plakasına ilgi hücreleri sıralamak. Tek hücreler maksimum saflıkla sıralanır emin olmak için, "tek bir hücre" modunda makineyi çalıştırmak ve ileriye dayalı yolluk ve yan dağılım 19 sitometri standart akış kullanın.
    NOT: Inörnek deney, kapı tek tek hücrelerin 11 parlak% 15 izole etmek için p53-Venüs floresan dayalı hücreler.
  7. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 400 x g'de yeni steril ısı mühür ve santrifüj ile plaka kapatın. termal döngü plaka koyun ve RTSTA programı (adım 1.7 bakınız) çalıştırın.
    NOT: Bu sıralanmış hücrelerden mRNA üzerinde ters transkripsiyon yapar ve daha sonra ilgi transkript cDNA güçlendirir.

6. Ekzonükleaz Tedavisi

  1. Tablo 4'te listelenen bileşenler birleştirilerek inceltilmiş Ekzonükleaz I karıştırın. kapaklar 12 PCR tüpleri bir sıra hazırlayın. Her tüpe seyreltilmiş eksonükleaz I 30.5 ul dağıtın. tüpleri Cap ve sıvı tüpün dibinde olduğundan emin olmak için kısaca (500 xg'de 5 sn) dönerler.
  2. RTSTA bittiğinde, 500 x g'de 5 saniye boyunca örnek plaka döndürün. 12 kanallı bir pipet kullanılarak, seyreltik ekzonükleaz 3.6 ul dağıtmaPlaka her oyuğuna.
  3. Steril termal mühür ve spin kısaca (500 xg'de 5 sn) ile plaka mühür. termal döngü plaka koyun ve EXOI programı (adım 1.7 bakınız) çalıştırın.
    NOT: gelecekteki PCR engel olmaz böylece bu adım belirli hedef amplifikasyon sonra kalan primerler alçaltır.

7. Numune Sulandırma

  1. ekzonükleaz tedavisi tamamlandığında, numune plakasının her oyuğuna TE tamponu 32.4 ul; Bu, isteğe bağlı durma noktası, ve örnekler birkaç gün -20 ° C'de saklanabilir.

QPCR kullanılarak 8. Sıralama Kalite Kontrolü

NOT: Hücre sıralama mükemmel verimli olmadığından, bu adımı sıralı plaka kuyu aslında bir hücreyi aldığı tanımlamak gereklidir. Bu numuneler daha sonra analiz için kullanılabilir.

  1. QPCR her numunedeki ev bakıcısı geni ekspresyonunu ölçün.
  2. Aşama 1.1 seçilen hazırlık geninin biri için polimeraz, üretici firmanın protokolü kullanarak primerler göre 96 reaksiyonlar için DNA bağlama boyası qPCR ana karışımı 900 ul hazırlanması; Belirli bir polimeraz bağlıdır Bu reaksiyon için olan reaksiyon tamponu, polimeraz, primerlerin, tam konsantrasyon kullanılır.
  3. 96 oyuklu bir PCR plaka her oyuğuna ana karışımı 9 ul dağıtın. PCR plaka de karşılık gelen örnek plakadan örnek 1 ul ekle.
  4. Master miks üretici tarafından önerilen bir termal döngü protokolü kullanılarak ya da standart bir protokol 20 aşağıdaki bir real-time PCR makinesinde plakayı.
  • QPCR verileri 20 analiz; Aşağıda listelenen sıralama kalite kontrol adımlardan qPCR verilerinin bir örneği, Şekil 4'te gösterilmiştir.
    1. Hiçbir hücre kuyu ölçümleri düşük (arka plan) seviyesini gösterir doğrulayıngen ekspresyonu ya da hiç ifade.
    2. yüksek gen ifadesinde ve hiçbir hücre kuyulara benzer tüm ifade ya da hiç ifadenin arka plan seviyeleri ile negatif örneklerin pozitif örneklerin: 1-hücre kuyu ölçümleri iki gruba açıkça bölmek emin olun.
      NOT: Yüksek gen ifadesi ile numuneler gerçek sıralanmış hücreleri temsil eder; Arka plan ifadesi olan ileri analize dahil edilmelidir.
    3. 10-hücreli ve 100 hücre kuyu ölçümleri verimsiz sıralama istenenden daha bu kuyular daha az hücre olması neden olabilir olasılığı için izin olumlu 1-hücre kuyularda daha yüksek gen ifadesini yansıtır emin olun.
    4. Standart kuyulardan ölçümleri eşit (C t değerleri eşit olarak dağıtılmış olması, yani) logaritmik uzayda dağıtılır emin olun.
  • tüm olumlu 1-hücre örnekleri belirledikten sonra, pozitif 1-ce eşleştirmek için bir "örnek karışımlar" plaka harita yapmakYeni 96-yuvalı bir plaka uzerinde ll örnekleri. Bu plaka harita üzerinde standartlar için sekiz kuyu ekleyin. Örnek için Şekil 5'e bakınız.
  • Mikroakışkan QPCR kullanılarak 9. Gen İfadesi ölçüm

    NOT: Bu bölümdeki her adım için, sadece ilk durağı pipet reaktiflerin kabarcıklarının oluşumunu en aza indirir.

    1. 8 PCR tüpleri bir satır açın. Numunelerin birden plakaları varsa, 8 PCR tüpleri ikinci bir satır açmak ve tüpler 1-8 etiket. Bu satır birden plakaları standartları havuzu olacaktır.
    2. 1.5 ml tüp içinde, boya örnek yükleme ayıracı bağlayıcı DNA 36 ul DNA bağlanma boya qPCR ana karışımı 360 ul karıştırın. Vortex kısaca ve 2.000 x g 10 saniye sıkma. Her bir tüp içinde 48 ul yerleştirerek, 8 PCR tüpleri etiketsiz satıra bu karışımı (396 ul) bölün.
    3. 8 kanallı pipet kullanarak, her bir kuyunun içine master miks / numune yükleme reaktif karışımı 3.3 ul dağıtmakYeni 96-yuvalı PCR plaka. Bu plaka, etiket "Örnek karışımlar."
    4. Örneklerin her biri, PCR parçası:
      1. Vorteks 500 x g'de 10 sn için 10 saniye ve spin plaka. Kapağı çıkarın ve kuyu plaka harita üzerinde gösterilen 1-hücre için plaka karışımlar onun Numune üzerinde de karşılık gelen her pozitif 1-hücre örneği 2.7 ul transfer.
      2. örneklerin sadece bir tabak varsa, onun Numune üzerinde de karşılık gelen her güçlendirilmiş standardın 2.7 ul transfer plaka haritaya göre plaka karıştırır.
      3. Numunelerin daha çok tabakayı varsa, PCR tüpleri satırındaki karşılık gelen bir konumda her bir güçlendirilmiş standart 2.7 ul transfer. zaten orada herhangi standartlara örneklerin mevcut plakasından standartları ekleyin. bir sızdırmazlık filmi kullanılarak yapıldığında numunelerin plaka mühür.
    5. Numunelerin birden levhalar vardır, eğer şunlardır:
      1. standartlarını içeren PCR tüplerine satırını Vortex2,000 x g'de 10 saniye 10 saniye ve spin. iyi Numune üzerinde karşılık gelen karışık standartların her tüpten 2,7 ul transfer plaka haritaya göre plaka karıştırır.
    6. Plaka harita üzerinde gösterilen nükleaz içermeyen su 2,7 ul NTC kuyu yükleyin. kadar gerekli Numune 4 ° C'de plaka ve mağaza Mixes kapatılmalıdır.
    7. Yeni bir mikroakışkan qPCR çip altındaki kapalı etiketi soyun. Hala kapağı ile kontrol hattı sıvı bir şırınga kullanarak, gevşetmek için her akümülatör bahar aşağı doğru itin ve kontrol çizgisi sıvı 150-200 ul her akümülatör enjekte.
    8. Yükleme makinesinde yonga yerleştirin ve "Başbakan" komut dosyasını çalıştırın. Bu ~ 20 dakika sürer.
    9. astar, vorteks yapılır ve tahlil karışımları plakaları aşağı spin zaman ve örnek karışımları (adım 1.6 hazırlanmış).
    10. 8 kanallı pipet kullanarak, diyagramda göre olan mikro-akışkan qPCR çip sol tarafındaki her bir tahlil karışımı 4.5 ul transfer g> Şekil 6. Pipet çok dikkatli kuyu dibinde hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için. Bittiğinde, gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de tahlil karışımları ve mağaza plaka mühür.
    11. Şekil 6'ya göre mikro-akışkan qPCR çip sağ tarafına, her örnek karışımı 4.5 ul aktarın. Yükleme makinenin içine çip takın ve "Mix Yük" komut dosyasını çalıştırın. Bu ~ 90 dakika sürer.
    12. , Mikroakışkan real-time PCR Makineyi açın veri toplama yazılımını başlatmak ve bunu ısınmak için lambayı açmak. Bu ~ 20 dakika sürer.
    13. Yük Mix komut dosyası tamamlandığında, karşısında hiçbir satır olduğunu doğrulamak çip-bu bir yükleme sorunu işaret eder. Dikkatle Scotch bant veya laboratuar bant kullanarak çip herhangi bir toz parçacıkları kaldırmak. Mikroakışkan real-time PCR makinesine çipi takın ve veri toplama komut dosyasını çalıştırın. sonuçlarını incelemek ve daha fazla analiz için veri ihracat analiz yazılımı kullanın.
    _title "> 10. Veri Analizi

    1. QPCR amplifikasyon eğrileri 20 (eğriler standart sigmoid amplifikasyon eğrisi benzer olmayan yani) kalitesiz göstermek hangi ölçümleri kaldırın.
    2. 30 düşük kaliteli ya da sıfır ölçümleri ile veya buna ev bakıcısı geni ekspresyonu (adım 1.1) diğer numunelerin çoğunluğu çok daha düşüktür (Şekil 7) için örnekler çıkarın.
    3. Her gen için, her örnekten erime tepe yerlerde medyan olarak doğru eriyik pik konumu tahmin. Bir ölçüm medyan fazla 1 ° C bulunan bir erime zirve varsa, göz 20 o ölçümü kaldırın.
    4. Her gen için, bir tablo veya betik dili 20 kullanılarak her bir örnek mRNA sayısını tahmin etmek bir standart eğri oluşturmak.
      NOT: Bu deneyde standartları 10 oluşur, 100, 1000 veya 10.000 moleküllerdsDNA ilgi her transkript karşılık gelir. Ters transkripsiyon mükemmel etkili ise mRNA ve cDNA, tek dallı, çünkü, standartlar, 20, 200, 2000, ve mRNA 20.000 molekülüne karşılık gelir. Uygulamada, bu durum böyle değil, bu yüzden E RT ters transkripsiyon verimliliği olan E RT, × moleküllerin birimlerinde bir tahmin olarak ölçümleri ifade eder.
      1. Her bir standart oyuk, M, amplifikasyon öncesi ssDNA moleküllerinin sayısı (dsDNA moleküllerin iki katı) (örneğin, 20 moleküller, 200 moleküller gibi) göstermektedir.
      2. Her bir standart kuyu için, qPCR 20 C t değeri tanımlar.
      3. M ve C t değerleri ile, her gen için parametreler A ve B birlikte bir standart eğri oluşturmak için, aşağıdaki denklem kullanılarak bir doğrusal regresyon gerçekleştirmek ve şekilde R2 değeri bulmakuyum iyiliği n göstergesi:
        denklem 1
      4. Standart eğriden, her gen için PCR verimliliği E hesaplamak:
        denklem 2
        Not: 1.0 (örneğin, e> 1.1) fiziksel gerçekçi değildir çok daha büyük E değeri; Doğrusal regresyon için bir R2 değeri çok daha az 1,0 (örneğin, R2 <0.985) standartlarına güvenilir çalışma anlamına gelir. Bu sorunlar genellikle en düşük amplikon standart güvenilir ölçümü bir eşiğin altına düştüğünde, ve böylece en düşük standart lineer regresyon dışında gerektiğini göstermektedir. yeterli bir lineer regresyon en az üç özel standartlar kullanılarak yapılamaz ise genin ekspresyon ölçümleri atın.
      5. Lineer regresyon yeterli değilse, ortaya çıkan uyum parametreleri a ve b kullanın <mRNA sayısını tahmin etmek için, her gen için / em> ölçülen CT değeri, her tek hücre örneğinde ilgili gen (E RT x molekül birimi olarak) m est molekülleri:
        denklem 3
      6. Herhangi bir ölçüm m est tayin <1 m est = Ayrıca 0 olarak, qPCR hiçbir amplifikasyon ve böylece m est = 0 olarak hiçbir C t değeri ile herhangi bir ölçüm belirler.
        NOT: est en düşük veya daha az gerileme kullanılan yüksek standart daha büyük bir m ölçümler standart eğriden extrapolasyon tarafından bulunmuştur. Bu tahminler geçersiz olması gerekmez ama dikkatli değerlendirilmelidir.
    5. Tek hücreli gen ifadesi verileri görselleştirmek.
      1. Bir beeswarm arsa (Dorn, J. ve Kutsal, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/filee olunHer bir nokta belirli bir hücre içinde gen ekspresyonunu temsil eder xchange / 37105); bir örneği Şekil 8'de gösterilmektedir.
      2. "Keman" genişliği belirli bir seviye etrafında gen ifadesi ölçüm sıklığını temsil ettiği bir keman arsa (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661) Marka analiz hücre popülasyonu; bir örneği Şekil 8'de gösterilmektedir.
        NOT: Daha sofistike analizler genler 21, 22 çiftleri arasında ifadesinde ilişkileri prob ve gen ifadesi ağlarını çıkarabiliriz.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Protokol genel bir bakış hücre tedavisi, FACS ile tek hücrelerin izolasyonu için adımları da dahil olmak üzere Şekil 1 'de gösterilen üretim ve tek hücre lizatları, tek hücreli bir cDNA kütüphanelerinin onay cDNA kütüphanelerinin ön amplifikasyon sıralı oyuklar ve qPCR gen ifadesinin ölçümü.

    tek hücre izolasyonu ve gen ekspresyon analizi için hazırlanırken, ilk önce her bir ilgi hedef genin geçerli oligonükleotid primer çiftleri tespit için gereklidir. Şekil 2 primer kalite kontrol yöntemlerinin iki örnek gösterilmektedir. Eritin eğrileri primer çifti test edilen qPCR aşağıdaki oluşturulur. Geçerli primerleri tek bir tepe noktası (Şekil 2A, yeşil eğri) sahip bir erime eğrisi ile sonuçlanır. Birden çok tepe (Şekil 2A, mavi eğri) ya da belirgin bir omuz olan bir eğri (Figür Eğere Şekil 2A, kırmızı eğri) Bu, birden çok PCR ürünlerinin varlığını gösterir, bu, ve primerler yeniden dizayn edilmelidir. İkinci bir kalite kontrol metodu olarak, agaroz jel elektroforezi, görsel, doğru boyutta tek bir bant (Şekil 2B), test edilen her primer çifti mevcut olduğundan emin olmak için kullanılabilir. Çoklu bantları ya da yanlış boyutta bantları primerleri (Şekil 2B) geçerli olmadığını göstermektedir.

    Primer doğrulama ve doğru amplikonların gelen qPCR standartları kütüphanelerin oluşturulmasına sonra, hücre sıralama yapılabilir. Bir örnek ayırma şeması, Şekil 3'te gösterilmektedir. Her bir kriteri plaka her bir hedef amplikonun 10, 100, 1000 ya da 10000 kopya, amplikon aykırı bir seyreltme serisi ihtiva eden kuyular içermelidir. Ayrıca, herhangi bir hücre, 10 hücre, ya da 100 hücreleri, tek hücreli gözlere ilave olarak, sıralanır içine kuyu dahil edilmesi önerilmektedir.verimsizliği ayırma nedeniyle, tek hücreler başarıyla tevdi edildiği levhanın tespit etmek gerekli olabilir. Ters transkripsiyon ve spesifik hedef amplifikasyonu için prosedür takip bu doğrulama adımı için qPCR bir ev bakıcısı geni (Şekil 4) ekspresyonunu ölçmek için gerçekleştirilmelidir. Amplikon standartları için kuyular (Şekil 4, siyah eğrileri) eşit aralıklı amplifikasyon eğrileri göstermesi gerekir. (; Kırmızı eğrileri Şekil 4), "10 hücreli" kuyular (Şekil 4; mavi eğrileri) ve "100-hücre" kuyular (Şekil 4 de "hayır-hücre" kuyulara gelen virajlarda net bir ayrım olmalıdır ; mor eğrileri). Net bir ayrılık da başarılı hücre birikimi (Şekil 4 tekabül "1-hücre" Kuyular için gerçekleşmesi gereken, daha az hiçbir hücre kontrolleri ama g için daha C t değerleri ile yeşil amplifikasyon eğrileriHiçbir hücre kontrolleri için bu yakın C t değerleri) ile yeşil eğrileri; başarısız hücre birikimi (Şekil 4 karşı 10-hücre kontrolleri için olanlar) daha reater. Tek bir hücre lizatı ile kuyu belirlendikten sonra, (potansiyel olarak birden fazla plakalardan) kuyu cDNA de başına bir tek hücre lizatı ile, mikroakışkan qPCR çip aktarılabilir. Örneğin, Şekil 5, üç farklı qPCR analizi için tek bir yeni plaka, 96 gözlü levhalar kriteri gelen tek hücre cDNA birleştiren hayali bir dizi gösterilmektedir.

    Birçok eksik veya sıfır gen ekspresyon ölçümleri (Şekil 7, oklarla gösterilen satır) veya alışılmadık şekilde düşük ev bakıcısı geni ifadesi ile belirtildiği gibi mikro-akışkan qPCR sonuçlarını analiz etmek için, büyük olasılıkla bir hücre almadı örnekleri önce çıkarılmalıdır. Her bir deney için, erime zirveleri olan bir ölçüm olduğunu tasarımlarıyla kişilerce eşleşmeyenAynı tahlilde R örnekleri de çıkarılmalıdır. Kötü örnekleri ve ölçümler çıkarılmasından sonra, lineer regresyon her bir hücre numunesinde her bir ilgi transkriptin sayının tahmin etmek amplikon standartlarına tekabül eden ölçümler yapılabilir. Şekil 8, beeswarm ve viyola araziler gibi ters transkripsiyon randımanını x molekül birimi ile ölçülür, bu gen ekspresyonu tahminleri, bir görselleştirme göstermektedir. Bu örnekte, işlem görmemiş hücreler birçok hücre hiç CDKN1A ifade etmeyen ve iki büyüklük kapsayan seviyelerde gen ifade diğerleri, CDKN1A sentezleme seviyelerinin geniş bir aralığı gösterir. 3 saat neokarzinostatin (NCS) ile işlendikten sonra, en hücreler daha yüksek seviyelerde CDKN1A ifade eder ve değişkenliği büyüklük yaklaşık tek bir düzene azalır. Tedavi süresi arttıkça, CDKN1A ifade ortalama seviyesi azalır ve değişkenlik içinde ifadesi genişletir.

    Şekil 1
    Şekil 1: Tek hücreli gen ifadesi profili adımların bakış. Tedavi edilen hücreler hasat edilmiştir ve doğrudan liziz tamponuna FACS ile sıralanır. ilgi mRNA türlerinin ters transkribe edilmiştir ve elde edilen cDNA, PCR ile amplifiye edilir. Her bir numune içinde Kat gen ekspresyon örnekleri aslında hücre almış belirlemek için qPCR ölçülür. Bu kalite kontrol testi geçen örneklerinde en fazla 96 genlerin ifade mikroakışkan qPCR kullanılarak ölçülür. Bu rakam bir önceki yayın 11 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    19 / 55219fig2.jpg "/>
    Şekil 2: Primer test örnek gösterilmiştir. (A) qPCR gelen eğriler eritin. mavi erime eğrisi (TNFRSF10D) birden zirveleri vardır ve kırmızı erime eğrisi (TRIM22) yakın ilk zirve ikinci zirve tutarında bir "omuz" vardır. Bu, bu reaksiyonlarda kullanılan primerler çoklu hedefleri yükseltmek ve tasarlanması gereken göstermektedir. Yeşil erime eğrisi (SCN3B) tek bir hedef yükseltmek primerler ile tutarlı tek bir pik vardır. (B) bir agaroz jel üzerinde DNA çalışmasına Güçlendirilmiş. SCN3B, TRIM22 ve TRPM2 şeritlerinin birden bantlar içerir; Bu DNA amplıkonları yapmak için kullanılan primerler çoklu hedefleri yükseltmek ve yeniden tasarlanması gerekmektedir. TNFRSF10D için kuşak tek bir hedef amplifiye primerler ile uyumlu tek bir bant bulunur. Bu TNFRSF10D için bu jel testi geçmek ancak eriyik eğrisi başarısız olurken SCN3B için primerler, erime eğrisi testi geçmek ancak jel testi başarısız dikkati çekiyorÖlçek; Primer doğrulama bu iki yöntem tamamlayıcı niteliktedir. Bu örnekte, bir dört primer setleri yeniden dizayn edilmesi gerekir sonucuna varabiliriz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil 3: hücre sıralama için Plaka haritası. Bu plaka haritası 1-hücre kuyuları (kırmızı), 10- ve 100-hücre kuyuları (koyu kırmızı), standartlar (yeşil) ve hiçbir hücre kuyuları (beyaz) içerir. Her bir plaka üzerinde, her bir standart iki uygulama da dahil olmak üzere aykırı değişkenlik kompanse etmeye yardımcı olur. 10-hücresi ve 100 hücre yuvasının dahil gen ifadesi için bir sağlamlık kontrol olarak yararlıdır. Resim hücre kuyu negatif kontrol olarak hizmet etmektedir. T büyük halini görmek için buraya tıklayınızOnun rakam.

    Şekil 4,
    Şekil 4: GAPDH ifade ölçme sıralama kalite kontrolden qPCR amplifikasyon eğrileri örneği. No-hücre örnekleri (kırmızı) ifade arkaplan seviyesini gösterir. iki ayrı grup, yüksek bir ifade ile bir ve herhangi bir hücre örnekleri içindeki düşük ekspresyon içine 1-hücre örnekleri (yeşil) bölün. Yüksek ifade örnekleri büyük olasılıkla sıralama sırasında gerçek bir hücreyi aldı; Düşük ifade örnekleri büyük olasılıkla vermedi. 10-hücreli (mavi) ve 100-hücre (mor) numuneleri 1-hücre örneklerinin daha yüksek ifade göstermek; 10-hücre örnekleri nedeniyle sıralama verimsizliğin en yüksek ifade 1-hücre örneklerinin yakındır. beklendiği gibi (siyah) Standartlar eşit, dağıtılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. </ P>

    Şekil 5,
    Şekil 5: Numune örneği plaka haritasını karıştırır. Bu plaka haritası qPCR (H11-H12 için 1-hücre üç farklı plakalar (satır AG) örnekler, her üç tabak (H1-H8), hiçbir hücre kontrolleri (H9-H10), gelen karışık standartları ve hiçbir şablon kontrolleri içerir ). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 6,
    Şekil 6: yükleme (1, 2, 3 ...) emriyle mikroakışkan qPCR çip diyagramı. çentik (A1) plakanın sol üst köşesidir. Thi büyük halini görmek için buraya tıklayınızs rakam.

    Şekil 7,
    Şekil 7: qPCR sonuçları ısı haritası. Her satır bir 1-hücre örneği, standart ya da kontrol temsil eder; her sütun ölçülü transkript temsil eder. siyah kareler veya Xs (oklar) alışılmadık bir sayı ile Satırlar olasılıkla gerçek bir hücreyi almadı örnekleri göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 8,
    Şekil 8: Beeswarm ve keman araziler. Bir beeswarm arsa (mavi noktalar) 'de, her bir nokta belirli bir hücre içinde gen ekspresyonunu temsil eder. Bir keman arsa (gri şekli) ise, "keman" genişliği gen ifadesi ölçme işlemi sıklığını temsilanaliz hücrelerin nüfus belirli bir düzeyde etrafında rements. Açık mavi çubuklar en düşük standart temsil eder. mavi çubukların içindeki ölçümler hesaplanmıştır ise mavi çubukların üzerinde ölçümler, standartlar arasında interpolasyon edilir. Burada gösterilen veriler DNA çift kordonlu kırılmaları uyarmak için belirtilen zamanlar için neokarzinostatin (NCS) ile muamele Venüs-etiketli p53 ekspres eden MCF-7 hücreleri içinde CDKN1A ifade ölçümleridir. Bu rakam, bir önceki yayının 11 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şart Sıcaklık Zaman
    Ambar 50 ° C 15 dakika
    Ambar 95 ° C 2 dakika
    20 devir 95 ° C 15 sn
    60 ° C 4 dakika
    Ambar 4 ° C

    Tablo 1: Ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon (RTSTA) termal döngü programı.

    Şart Sıcaklık Zaman
    Ambar 37 ° C 30 dk
    Ambar 80 ° C 15 dakika
    Ambar 4 ° C

    Tablo 2: Ekzonükleaz I tedavisi (EXOI) termal döngü programı.

    Bileşen Cilt / kuyu (ul) /% 10 tutarı düşmek w 96 hacimleri (ul)
    2x Reaksiyon karışımı 5.00 528.00
    Ters transkriptaz / polimeraz karışımı 0.20 21.12
    10x STA primer karışımı 1.00 105.60
    2.64 U / ul (sulandırılmış) sprey RNaz inhibitörü 0.02 2.00
    Nükleaz içermeyen su 0.78 82,48
    Genel Toplam 7.00 739,20

    Tablo 3: hücreler için lizis tamponu Bileşenleri.

    Bileşen Cilt / kuyu (ul) /% 10 tutarı düşmek w 96 hacimleri (ul)
    Nükleaz içermeyen su 2.52 266,00
    Ekzonükleaz I reaksiyon tamponu (10x) 0.36 38.00
    Ekzonükleaz I (20 U / ul) 0.72 76.00
    Genel Toplam 3.60 380.00

    Tablo 4: eksonükleaz Bileşenleri çoğaltılmış cDNA örnekleri tedavi karıştırın.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Bu kültür içinde yetiştirilen yapışan hücreler popülasyonundan tek tek memeli hücrelerini izole etmek için, her hücrede yaklaşık 96 gen ekspresyonunu analiz etmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem iyi çalışması için iyi bir ön hazırlık çok önemlidir. primerler tek hücreli ölçümlerin kalitesini belirlemek olarak, özellikle ilgi transkriptleri (1.2-1.3 adımlar) özgü tasarımı ve test primer çiftleri, zaman alıcı ama önemli adımlardır. güvenilir bir primer çiftleri elde edildikten sonra, bu ilgi transkript cDNA yı çoğaltmak için kullanılır; amplikonlar daha sonra standart (1.4 adım) yapmak için eşit molar miktarlarda bir araya kombine edilir. standartlar mutlak transkript sayılarını tahmin etmek gerekli olduğu gibi bu adım, kritik; standartları, bir kez yapılan numune alınır ve hücre sıralama ve gen sentezleme ölçümlerinin tüm sonraki tur için kullanılmalıdır. Aynı şekilde, hücreler sıralanır o gün, özellikle importan olduğunut lizis tamponu plakaları (3.7 ve 3.11 adımlar) yaparken dikkatli düşük bağlayıcı pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpler kullanılarak standartları sulandırmak için. (Adım 4.2) hücre sıralayıcı amaçlayan bir başka kritik bir adımdır; Hücreler başarılı bir PCR plakasında lizis tamponu 9 ul hedefe ulaşmak için bu sırayla çok dikkatli yapılmalıdır.

    Araştırma çeşitli ihtiyaçları uyarlamak için yapılabilir protokol için çeşitli değişiklikler vardır. Burada, gen ifadesinin ölçülmesi için nispeten uygun fiyatlı bir yöntem sağlar boya bazlı qPCR yaklaşımı, bir DNA bağlanma üzerinde duruldu. Bununla birlikte, bu yöntem, bir flüoresan sinyal, bir amplifiye DNA için, hedef dışı dizilerinin sonuç bile yüksek bir arka plan sinyali oluşturmak için bir potansiyele sahiptir. Böyle bir arka plan belli bir hedefe amplifiye etmek için kullanılan primer çift tek bir tepe noktası ve doğru boyutta tek bir PCR ürününün (Şekil 2 bir erime eğrisi elde edilir sağlayarak en aza indirilebilir). Arka plan hala bu tür kalite kontrol yöntemleri kullandıktan sonra bir endişe ise, bir prob tabanlı qPCR yaklaşım reaktif büyük bir maliyetle de olsa, hedef dışı algılama en aza indirmek için kullanılabilir. Başka bir seçenek, primer bir set-ters transkripsiyonunu ve transkriptin büyük bölge ve bu büyük bölge içinde yer alan daha küçük bir bölgeyi amplifiye primerler ikinci bir set, yükseltmek için RTSTA aşamada kullanılır olan bir içiçe PCR yaklaşımı, olurdu , qPCR gen ekspresyonunu ölçmek için kullanılır. Bu yaklaşım, boya bazlı qPCR 23 DNA bağlanma özgüllüğünü geliştirmek için gösterilmiştir.

    Çeşitli yöntemler, gen ekspresyon analizi için tek tek hücrelerin izole edilmesi için kullanılabilir. hücre izolasyon yönteminin seçimi, hücre kaynağı (örneğin, bir dokudan birincil hücreler karşısında yerleşik hücre çizgileri gibi) değerlendirilir (örneğin, bir flüoresan-aktifleştirilmiş hücre sıralayıcı gibi) donanım durumunu dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır, veHücreler izole gereken hız. Bu protokol sunulan örnekte, açık bir şekilde tespit edilebilir flüoresan etiketli proteini ifade eden bir hücre hattı FACS kullanılır. FACS nadir hücre algılama yetenekleri ve nispeten hızlı hücre izolasyon faydaları vardır. yöntemin bir zorluk, bir 96-yuvalı PCR plaka liziz tamponu gerekli küçük bir hacim halinde ilgi hücreleri yerleştirme etkisiz olabilir ve başarılı bir izolasyon sağlamak için hücre sıralama geometri optimizasyon gerektirebilir olmasıdır. Düşük hızlarda ve / veya daha yüksek maliyetlerle hücre izolasyonu daha fazla hassasiyet yol açabilir alternatif yaklaşımlar tek tek hücrelerin micropipetting, bir tümör örneğinden belirli hücrelerin lazer yakalama mikrodiseksiyon veya mikroakışkan sistemlerin kullanılmasını (örneğin, Fluidigm C1 dahil sistemi).

    Burada tarif edilen protokolün bir büyük yararı, iç kontrol olarak arıtılmış PCR amplikonların bir seyreltme serisi, örn Her bir hücredeki her transkript mutlak sayısının tahminini nable. Bu standartlar olmadan, gen ekspresyonunun yalnızca görece seviyeleri CT değerleri, elde edilen hesaplamalara göre elde edilebilir. Ancak, bu standartlarla, mutlak transkript sayımları ideal tam sayısallaştırılmış amplikon standartlarına (Şekil 8) aralığında enterpolasyon yoluyla, tahmin edilebilir. gen ekspresyon miktarının herhangi bir PCR bazlı yöntem ile de, doğru ve eksiksiz miktar ters transkripsiyon da dahil olmak üzere, her işlemin verimliliği hakkında bilgi gerektirir.

    Tek hücrelerde transkript seviyelerini miktarının bir mevcut zorluk birçok yöntem için tespit limiti transcriptome önemli oranda güvenilir miktarının önlenmesi, hücre 24 10-100 mRNA'ların olduğu tahmin edilmektedir olmasıdır. alternatif bir yaklaşım olarak, belirli bir ilgi hedefleri ölçmek için smRNA FISH kullanabilirsinizÇok az transkript ile olanlar dahil olmak üzere eşek = "xref"> 25, 26,. SmRNA FISH gelişmeler uygun ekipman verilmiş bir kez 27 tespit edilebilir ayrı transkript sayısını ve bir kez 28 yaşında profilli olabilir hücrelerin sayısını, genişlettik. smRNA BALIK kendi sınırlamaları olmasına rağmen (potansiyel-yalancı pozitif ve yalancı negatif transkript tespiti, hücre başına sadece bir kaç hedef genlerin kısıtlamalar, ekipman ve reaktiflerin maliyeti), bir sonuçlarını tamamlayacak ve doğrulamak için güçlü bir yöntem sağlayabilir ilgi hedef genlerin bir alt kümesi qPCR tabanlı analizi.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Biz bu protokolün geliştirilmesi sırasında hücre sıralama yapmadan onu yardım için CCR ETIB Sitometrisi Core V. Kapoor teşekkür etmek istiyorum. Biz de bu protokolün geliştirilmesi sırasında qPCR performans onların yardım M. Raffeld ve CCR LP Moleküler Tanı Ünitesi ve J. Zhu ve NHLBI DNA Dizilimi ve Genomik Çekirdek teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH İntramural Programı tarafından desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
    High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor ThermoFisher 4374966
    Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530S
    QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
    Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit ThermoFisher Q33120 
    2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes USA Scientific 1420-2600
    DNA Suspension Buffer Teknova T0221
    Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning PCR-02-L-C
    GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm 100-3415
    HyClone RPMI 1640 media GE Healthcare Life Sciences SH30027.01
    Fetal Bovine Serum, Certified (US) ThermoFisher 16000-044
    Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30-004-CI
    Neocarzinostatin Sigma N9162
    ELIMINase Decon Labs 1101
    SUPERase-In ThermoFisher AM2696
    CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher 11753500
    E. coli DNA Affymetrix 14380 10 MG
    ThermalSeal Sealing Film, Sterile Excel Scientific STR-THER-PLT
    BD FACSAria IIu BD Biosciences
    HyClone Trypsin 0.05% GE Healthcare Life Sciences SH30236.01
    PBS, 1x Corning 21-040-CV
    Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
    Exonuclease I New England BioLabs M0293S
    SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad 172-5210
    96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) Fluidigm BMK-M-96.96
    IFC Controller HX (loading machine) Fluidigm
    BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) Fluidigm
    Real-Time PCR Analysis software  Fluidigm
    MATLAB software MathWorks

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321, (5892), 1081-1084 (2008).
    2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459, (7245), 428-432 (2009).
    3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2, (1), (2006).
    4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
    5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158, (2), 314-326 (2014).
    6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4, (10), e309+ (2006).
    7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8, (1), 75-83 (2014).
    8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11, (5), 806+ (2015).
    9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, (43), 17454-17459 (2012).
    10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167, (1), 523-530 (2004).
    11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2, (4), 272-282 (2016).
    12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36, (2), 147-150 (2004).
    13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9, (10), 749-758 (2009).
    14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (5), 402-412 (2008).
    15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13, (1), 134 (2012).
    16. PCR Technologies: A Technical Guide. Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
    17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
    18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30, (3), 277-289 (2008).
    19. Flow Cytometry: Principles and Applications. Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
    20. Real-time PCR. Taylor & Francis. (2006).
    21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13, (1), 328 (2012).
    22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7, (Suppl 1), (2006).
    23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3, (6), 332-337 (1994).
    24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
    25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
    26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, (10), 877-879 (2008).
    27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9, (7), 743-748 (2012).
    28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10, (11), 1127-1133 (2013).
    İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).More

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter