Introduction
Einzelne Zellen in einer Population kann zu einem einheitlichen physiologischen Reiz 1, 2, 3, 4 sehr unterschiedliche Reaktionen zeigen. Die genetische Veränderung der Zellen in einer Population eines Mechanismus für diese Vielzahl von Antworten, aber es gibt auch einige nicht-genetischen Faktoren, die die Variabilität von Antworten erhöhen können, selbst in einer klonalen Population von Zellen. Zum Beispiel können die Ebenen der einzelnen Proteine und andere wichtige Signalmoleküle variieren auf einer Zelle-für-Zelle-Basis, was zu geben Variation in nachgeschalteten Genexpressionsprofilen. Zusätzlich können kurzzeitige Bursts von Transkripten 5 treten Genaktivierung in 6, der 7 auf eine relativ kleine Anzahl von Transkripten pro Burst begrenzt sein kann, 8, 9. Eine solchestochasticity in Genaktivierung kann stark von Schwankungen der biologischen Reaktionen beitragen und einen selektiven Vorteil in Mikroorganismen 10 und in Säugetierzellen 1, 2 reagiert auf einen physiologischen Reiz bieten kann. Aufgrund beiden genetischen und nicht-genetischen Variationsquellen kann das Genexpressionsprofil eines beliebigen gegebenen Zelle in Reaktion auf einen Reiz deutlich vom Durchschnitt Genexpressionsprofil unterscheiden sich von der Messung der Massenantwort erhalten. Das Ausmaß, in dem einzelne Zellen Variabilität in Reaktion auf einen Reiz zeigen, erfordert Techniken zur Isolierung von einzelnen Zellen, die Messung der Expressionsspiegel für Transkripte von Interesse, und die Computeranalyse der resultierenden Expressionsdaten.
Es gibt mehrere Ansätze zur Untersuchung der Genexpression in einzelnen Zellen, eine breite Palette von Kosten abdeckt, die Anzahl der Transkripte sondiert, undGenauigkeit der Quantifizierung. So bietet zum Beispiel Single-Cell-RNA-Seq eine große Tiefe transcript Abdeckung und der Möglichkeit, Tausende von verschiedenen Transkripte für den am höchsten exprimierten Gene in einzelnen Zellen zu quantifizieren; jedoch verbunden sind die Kosten, die mit solchen Sequenzierungstiefe kann unerschwinglich sein, auch wenn die Kosten weiter sinken. Im Gegensatz dazu bietet Einzelmolekül RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH smRNA) genaue Quantifizierung von Transkripten für sogar Low-Expression von Genen zu vernünftigen Kosten pro Gen von Interesse; jedoch nur eine geringe Anzahl von Zielgenen können durch diese Vorgehensweise in einer gegebenen Zelle untersucht werden. Quantitative PCR-basierten Assays, in diesem Protokoll beschrieben, einen Mittelweg zwischen diesen Techniken bereitzustellen. Diese Assays verwenden eine mikrofluidische Echtzeit-PCR-Maschine zu einem Zeitpunkt, zu 96 Transkripte von Interesse zu quantifizieren bis in bis zu 96 Zellen. Während jedes der vorgenannten Verfahren erforderliche Hardwarekosten hat, sind die Kosten eines einzelnen qPCR Assay relativniedrig. Dieses Protokoll wird von einem durch den Hersteller eines mikrofluidischen Echtzeit-PCR-Maschine (Protokoll ADP 41, Fluidigm) vorgeschlagen angepasst. Um die Abschätzung der absoluten Nummer jedes Transkript in einem PCR-basierten Ansatz zu ermöglichen, haben wir das Protokoll erweitert, um die Verwendung von internen Kontrollen vorbereiteter Zielgen Amplikons machen, die über mehrere Experimente verwendet werden kann.
Als ein Beispiel für diese Technik ist 11 beschrieben die Quantifizierung der Expression von Genen durch den Tumorsuppressor p53 in menschlichen MCF-7 - Brustkarzinomzellen reguliert. Die Zellen werden mit einem chemischen Mittel in Frage gestellt, die DNA-Doppelstrangbrüche induziert. Frühere Studien haben gezeigt , dass die p53 - Antwort auf DNA - Doppelstrangbrüchen eine große Heterogenität in einzelnen Zellen aufweist, sowohl in Bezug auf p53 Ebenen 12 und bei der Aktivierung verschiedener Zielgene 11. Darüber hinaus reguliert p53 die Expression von mehr als 100gut charakterisierten Zielgene in zahlreichen Downstream Wegen beteiligt, einschließlich Zellzyklusarrest, Apoptose und Seneszenz 13, 14. Da die p53-vermittelte Reaktion in jeder Zelle sowohl komplex und variabel ist, kann die Analyse des Systems profitiert von einem Ansatz, bei dem nahezu 100 Zielgene gleichzeitig in einzelnen Zellen werden untersucht, wie das unten beschrieben wird. Mit leichten Modifikationen (wie alternative Verfahren zur Einzelzellisolierung und Lyse), kann das Protokoll leicht ein breites Spektrum von Säugerzelltypen, Protokolle und zelluläre Antworten zu untersuchen angepasst werden.
Mit der richtigen rechtzeitige Vorbereitung kann eine Runde der Zellsortierung und Genexpressionsmessung durchgeführt werden, gemäß diesem Protokoll über einen Zeitraum von drei Tagen. Das folgende Zeit wird vorgeschlagen: im Voraus, die Transkripte von Interesse auswählen, zu identifizieren und die Primerpaare zu validieren, die die cDNA von jenen transcr verstärkenIPTS und bereite die Standards und Zündmittelmischungen diese Primer verwendet. Am Tag 1 nach Zellbehandlung, Ernte und sortieren Sie die Zellen, führen die reverse Transkription und spezifische Ziel-Amplifikation und Behandlung der Proben mit einer Exonuklease unincorporated Primer zu entfernen. Am Tag 2, führen an der sortierten Zellen Qualitätskontrolle mit qPCR. Schließlich, am Tag 3, messen die Genexpression in den sortierten Zellen mikrofluidischen qPCR verwendet wird. In Abbildung 1 sind die Schritte beteiligt.
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Protocol
1. Eine frühzeitige Vorbereitung
- Wählen Sie bis zu 96 Gene von Interesse, deren Expression gemessen wird.
HINWEIS: Mindestens eines dieser Gene sollte ein "housekeeping Gens" sein, wie zum Beispiel ACTB oder GAPDH, dass bekannt ist, bei einer relativ hohen und konstanten Niveau unter den Bedingungen in dem Experiment verwendet exprimiert wird. Dieses Gen wird verwendet, um positiv sortiert Vertiefungen (Schritt 8.1) und die amplifizierten Proben (Schritt 10.1) zu identifizieren.
HINWEIS: Für das Beispiel Experiment gut charakterisierte, direkte Ziele von p53 mit einer Vielzahl von bekannten Funktionen 11, 14 und GAPDH als Housekeeping Kontrolle ausgewählt wurden. Bitte siehe Referenz 11 für die komplette Liste von Zielgenen und Primersequenzen in dieser Studie verwendet. - Identifizieren Sie potenzielle Primerpaare spezifisch für die Gene von Interesse (zB mit Hilfe der wissenschaftlichen Literatur oder ein Primer - Design - Tool wie Primer-BLAST) 15. Lassen Sie die Grundierungs synthetisiert und sie bei einer Stoffkonzentration von 100 & mgr; M in nukleasefreiem Wasser halten.
HINWEIS: Diese Primer sollten 15-25 Basen lang sein; ein Amplikon 90-130 Basenpaare (bp) lang produzieren; umspannen ein Exon-Übergang, falls vorhanden, die Chance zur Verstärkung der genomischen DNA zu verringern; Schmelztemperaturen von 60 ± 1 ° C haben; und haben minimale Sekundärstruktur 16. Diese Primer werden prime reverse Transkription verwendet werden, verstärken cDNA aus den Transkripten von Interesse, und messen die Genexpression in der DNA-bindenden Farbstoff-basierte qPCR. - Überprüfen Sie die Primer.
- Zunächst erhalten cDNA aus den Zellen von Interesse. Ernte RNA aus den Zellen eine RNA Ernte Kit nach den Anweisungen des Herstellers oder molekularbiologischen Standardverfahren 17. Revers transkribiert die RNA in cDNA eine reverse Transkription-Kit mit zufälligen Hexameren unter Verwendung entsprechend den Anweisungen des Herstellers oder Standard-methods 17.
- Für jedes Primerpaar eingesetzten qPCR mit Farbstoff Master-Mix DNA-Bindung, Vorwärts- und Reverse-Primer, und die cDNA aus dem vorherigen Schritt, im Anschluss an die Master-Mix Herstellerempfehlungen vorgeschlagen Reaktionsbedingungen. Führen Sie diese Reaktionen auf einer Echtzeit-PCR-Maschine mit einem thermischen Zyklus Protokoll, das vom Master-Mix Hersteller empfohlenen verwenden, die Schmelzkurve Akquisition umfasst.
- Die amplifizierten DNA - Proben auf einem 2% w / v Agarosegel nach der qPCR, ausführen und die DNA mittels einer DNA - interkalierenden Farbstoffes visualisieren nach einem Standardprotokoll 17.
- Bestimmen die Effizienz des Primerpaars durch eine Standardkurve von seriellen Verdünnungen von cDNA Konstruktion (hergestellt in Schritt 1.3.1) entsprechend einem Standardprotokoll 16.
HINWEIS: Ein guter Primerpaar wird mit einem einzigen, gut definierte Spitze und eine einzelne Bande in der erwarteten Position auf dem Gel 16 eine Schmelzkurve ergeben,
- Bereiten Standards aus gereinigter DNA - Amplikons.
- Für jeden validierten Primerpaar:
- Erhöhen der Region von Interesse von cDNA, die eine High-Fidelity DNA-Polymerase gemäß den Empfehlungen des Polymerase-Hersteller für Primer und Templat-DNA-Konzentrationen, die Reaktionsbedingungen und PCR-Zyklusbedingungen, oder ein Standard-PCR-Protokoll"xref"> 17.
- Führen der amplifizierten cDNA auf einem 2% w / v Agarosegel und zu visualisieren , die Band mit einem DNA - interkalierenden Farbstoffes 17. Excise die Band, die die Amplikon einen sauberen Rasierklinge und legen Sie das Gelstück in einem Reaktionsgefäß.
- Man reinige das Amplikon aus dem Gel ein Standard - Gel - Extraktionsverfahren, wie beispielsweise ein Agarase-basierte Extraktion 17 oder Spin-Säule Gel Extraction Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Messen der Konzentration von Amplikon eine fluoreszenzbasierte dsDNA Quantifizierungs Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Unterteilen den gemessenen dsDNA-Konzentration durch das bekannte Molekulargewicht des Amplikons auf der Amplicon-Sequenz basiert, die Anzahl der Amplicon-Molekülen pro & mgr; l zu erhalten.
- In einem 2,0 ml schwach bindende Mikrozentrifugenröhrchen, fügen 2 ul gereinigtem Amplikon auf ein Volumen von DNA Suspensionspuffer, so daß die Endkonzentration an amplicon ist 5 x 10 8 Molekülen / ul.
- Wenn alle Amplifikate gereinigt wurden, kombinieren 18 ul jedes gereinigten Amplikon in einer 2,0-ml schwach bindende Reaktionsgefäß. In DNA Suspensionspuffer auf ein Gesamtvolumen von 1.800 & mgr; l zu machen; Somit ist die Konzentration jedes Amplikon 5 x 10 & sup6 ; Moleküle / & mgr; l.
HINWEIS: Diese Mischung, die cDNA-Amplikons aus allen Genen von Interesse in bekannten äquimolaren Mengen enthält, werden in Einzelzellen-qPCR als Standard dienen. - Vortex dieses "5E6" Standard gründlich, Spin für 10 Sekunden bei 2000 · g, und teilen sich in 20 ul Aliquots in Nieder Bindung PCR-Röhrchen. Speichern Sie die Aliquots bei -80 ° C.
- Für jeden validierten Primerpaar:
- Bereiten Sie die spezifischen Ziel - Amplifikation (STA) Primer - Mix (10x).
- In einem 15 ml konischen Röhrchen, kombinieren 25 ul jeder 100 uM Lager Primer (bis zu 192). In DNA Suspensionspuffer auf ein Gesamtvolumen von 5.000 & mgr; l zu machen.
Beachten Sie dasKonzentration jedes Primers in dieser Mischung beträgt 500 nM. Jede Platte der sortierten Zellen werden 105,6 ul dieser Primer-Mix prime die reverse Transkription und spezifische Ziel-Amplifikation verwendet werden. Das Volumen der Primermix hier gegeben ist genug 45 Platten zu machen, zu sortieren. Es ist ratsam, eine ausreichend große Menge Primermischung zu machen, so dass es nur einmal gemacht werden; skaliert die Volumina wie nötig. - Mischen Sie gründlich durch Vortexen, teilen sich in 110 ul Aliquots, und speichern Sie die Aliquots bei -20 ° C.
- In einem 15 ml konischen Röhrchen, kombinieren 25 ul jeder 100 uM Lager Primer (bis zu 192). In DNA Suspensionspuffer auf ein Gesamtvolumen von 5.000 & mgr; l zu machen.
- Bereiten Assay - Mischungen, eines für jedes Primerpaar für den Einsatz in mikrofluidischen Chip-basierte qPCR.
- In jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen PCR kombinieren 3,0 ul der 100 & mgr; M Vorwärtsprimer für ein gegebenes Gen, 3,0 & mgr; l des entsprechenden 100 uM reverse-Primer, 24,0 & mgr; l DNA Suspensionspuffer, und 30,0 & mgr; l 2x Assay Lade Reagenzes .
- Vortex diese Platte, Spin für 10 Sekunden bei 500 · g, und bei -20 ° C.
- Erstellen Sie zwei thermischen Zyklen Programme: RTSTA (Reverse Transkription und spezifische Ziel - Amplifikation; Tabelle 1) und ExoI (Exonuklease I - Behandlung; Tabelle 2).
2. Behandlung
- Platte die Säugerzellen auf einer Gewebekulturschale, so dass sie auf die gewünschte Konfluenz zum Zeitpunkt der Behandlung wachsen wird, abhängig von den Bedingungen der experimentellen Studie. Für das Beispiel in dieser Studie präsentierten, Platte 4 x 10 5 MCF-7 - p53-Venus Zellen 18 pro 6 cm Schale in RPMI mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin B. Inkubiere die Zellen für zwei Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2 , bis sie 50% Konfluenz erreichen.
- Behandeln Sie die Zellen, die den Zustand von Interesse auf der experimentellen Studie basiert zu etablieren. Für das Beispiel in dieser Studie vorgestellt, brüten MCF-7-p53-Venus-Zellen mit 400 ng / ml neocarzinoStatin für 3 h, 8,5 h, 14 h oder 24 h.
3. Lysispuffer Vorbereitung für Zellsortierung
HINWEIS: eine einzelne Platte Lysepuffer Herstellung dauert ca. 1 Stunde. Es ist ratsam, zu machen und zu sortieren mehrere Platten, wie Zellsortierung ineffizient sein kann und viele Brunnen ohne nachweisbare Zelle ergeben.
- Reinigen Sie die Bank, Pipetten, Röhrchen-Rack, kalt PCR Plattenhalter und Handschuhe mit DNA-Dekontaminationslösung in Vorbereitung für die PCR.
- Verdünnen Sie die RNAse-Inhibitor auf 2,64 U / ul durch Lager RNAse Inhibitor Zugabe zu nukleasefreiem Wasser in einem 1,5-ml-Röhrchen.
ANMERKUNG: Dies ermöglicht RNAse Inhibitor ohne Pipettieren Unter ul Volumina Lysepuffer hinzugefügt werden. - Machen Lysepuffer für die Zellen , die durch Vereinigung der Komponenten in Tabelle 3 aufgeführt.
- Transfer 92,4 & mgr; l des Lysepuffers für die Zellen in ein separates Rohr; Dies wird der Lysepuffer für die Amplicon-Standards sein.
- Mit low-bindenden Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße, bereiten 200 & mgr; l und 500 & mgr; l E. coli - DNA verdünnt auf 3,1 pg / ul und 6,2 pg / ul jeweils mit Puffer DNA - Suspension.
- Hinzufügen , 184,8 & mgr; l von 3,1 pg / ul E. coli DNA zu dem Lysepuffer für die Zellen.
HINWEIS: Der E. coli - Träger - DNA dient dazu , den Umfang der nicht - spezifische Primer - Bindungsmöglichkeiten zu erweitern und dadurch die Wahrscheinlichkeit zu verringern , dass Primer Dimerisierung zu einem PCR - Produkt führen wird. - Bereiten Standards.
- Beschriften sechs schwach bindende Mikrozentrifugenröhrchen als 5e5, 5e4, 5e0 ....
- In 90 ul DNA Suspensionspuffer auf die "5e5" Rohr.
- Werden 90 & mgr; l von 6,2 pg / ul E. coli DNA an jede der anderen fünf Rohre. Halten Sie alle Röhrchen auf Eis.
HINWEIS: Die Einbeziehung Träger-DNA in die Standards macht die Gesamtmasse der DNA in den Standardvertiefungen vergleichbar mit der in der 1-Zelle Vertiefungen; Dadurch verringert sich die probability dass die Konzentration der Standards werden durch DNA-Bindung an Rohren oder Pipettenspitzen berührt. - Nehmen Sie einen aliquoten Teil der "5E6" Standard (5 x 10 6 Moleküle / ul jedes Amplikon, hergestellt in Schritt 1.4) aus dem Speicher. Vortex kurz und Spin kurz (5 sec bei 500 xg), um sicherzustellen, daß die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens ist.
- Mit einem Low-Bindung Pipettenspitze, mit 10 & mgr; l von 5E6-Standard zum "5e5" Rohr. Vortex kurz, Spin (5 sec bei 500 · g), und setzen Sie den Schlauch wieder auf dem Eis.
- Je 10 & mgr; l aus dem "5e5" Rohr in das "5E4" Rohr. Vortex kurz, Spin (5 sec bei 500 · g) und auf Eis gelegt zurück.
- Wiederholen Sie diese Verdünnungsreihen, wobei jede Rohraufnahme 10 & mgr; l aus dem vorherigen Rohr, bis alle Rohre eine Verdünnung von Standard haben.
- Bereiten Sie eine Reihe von 12-PCR-Röhrchen mit Kappen. zu jedem Röhrchen 67 ul "Zelle" Lysepuffer verteilen. Verschließen Sie die Rohre und kurz abzentrifugieren (5sec bei 500 xg), falls erforderlich.
- Mit einem 12-Kanal - Pipette, verteilen 9 ul "Zelle" Lysepuffer aus der Reihe von PCR - Röhrchen in jede Vertiefung der ersten 7 Zeilen einer PCR - Platte (Abbildung 3).
- Verteilen 7 ul "standard" Lysepuffer zu jeder Vertiefung der letzten Reihe der Platte (3).
- Mit Low-Bindung Pipettenspitzen, fügen Sie 2 ul Standard zu jeder Vertiefung der unteren Reihe entsprechend der Plattenbelegung (Abbildung 3).
HINWEIS: 2 ul 5 x 10 0 Moleküle / ul Standard beträgt 10 Moleküle usw. - Hinzufügen 2 & mgr; l von 3,1 pg / ul E. coli DNA in die 10-Zellen - und 100-Zellen - Vertiefungen; Add 2 ul von 6,2 pg / ul E. coli - DNA in die No-Zelle Brunnen.
HINWEIS: Jedes 1-Zellen, 10-Zellen und 100-Zellen und hat 6,2 pg E. coli DNA, Annähern der Masse der genomischen DNA in einer menschlichen Zelle. Jeder Standard-und No-Zelle gut hat 12,4 pg of E. coli - DNA, etwa zwei menschlichen Wert der Zellen. - Verschließen Sie die Platte eine sterile thermische Dichtung verwendet, Spin für 5 Sekunden bei 500 × g und bei 4 ° C, bis die Zellen sind bereit für die Sortierung.
4. Cell Sorter-Setup
- Programmieren Sie die Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer in einer 96-Well - Platte zu sortieren nach der Platte Karte (Abbildung 3); keine Zellen sollten in die Vertiefungen H1-H8 oder H11-H12 sortiert werden.
- Stellen Sie sicher , dass die Zellsortierer auch für die Sortierung in einer PCR - Platte ausgerichtet ist.
- Den Winkel des Sortierstrom so gering wie möglich; Diese Einstellung erhöht die Chance, dass die Zellen in den Böden der Vertiefungen sortiert werden, anstatt die Seiten getroffen.
- Um die Maschine zu zielen, Siegel eine leere PCR - Platte und verwenden Sie den Teststrom zu "sortieren" Tropfen PBS auf die Dichtung der leeren Platte, entsprechend den Anweisungen der Maschine 19; die Tröpfchen auf th landen solltee Fläche der Dichtung an einer Stelle oberhalb der Mitte des Schachtes. Für die besten Ergebnisse, stellen Sie sicher das Ziel, über die Länge und Breite der Platte.
- Wenn die Tröpfchen in der richtigen Position nicht landen, wischen sie die Oberfläche der Dichtung ab, neu kalibrieren die Zellsortierer nach den Anweisungen des Maschinenherstellers, und wiederholen, bis die Tröpfchen in der Sortierstrom korrekt abgelegt werden.
5. Zellernte und Sortieren
- Trypsinize die Zellen als geeignet für die Zelllinie. Beispielsweise für MCF-7 - Zellen, anzusaugen , das Medium von den Zellen, spülen Sie die Zellen mit 1 ml von 0,05% Trypsin und Inkubation der Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2 .
- 8 ml von Zellkulturmedium zu den Zellen trypsinisiert und übertragen alle 10 ml der Zellsuspension in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifuge für 4 min bei 400 x g.
- Den Überstand aspirieren und Zellpellet in PBS + 2% FBS. <br /> Hinweis: Ein kleiner Aufwirbelung Volumen der Zellen konzentriert und erleichtert die Zellsortierung; Ein 500 & mgr; l der Resuspension Volumen funktioniert gut für eine 6 cm-Schale von Zellen bei 50% Konfluenz.
- Übertragen die Zellsuspension auf eine 5 ml-Zytometrie Rohr fließen, Pipettieren durch ein 40 um-Filter Zellklumpen zu entfernen.
- Zentrifugieren der Platte Lysepuffer bei 400 xg für 30 sec bei 4 ° C, bevor die Zellen Sortier um sicherzustellen, daß die Flüssigkeit am Boden der Vertiefungen ist.
- Legen Sie die Röhre mit der Zellsuspension in die Zellsortierer. Öffnen Sie die Dichtung auf der Platte Lysepuffer und sortieren Sie sorgfältig die Zellen von Interesse in die Platte nach der Platte Karte und im Anschluss an die Zellsortierer Anweisungen des Herstellers 19. Um sicherzustellen , dass einzelne Zellen bei der maximalen Reinheit sortiert sind, führen Sie die Maschine in "Einzelzelle" Modus und verwenden Standard - Durchflusszytometrie - Gating basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung 19.
HINWEIS: In derBeispiel Experiment Gate die basierend Zellen auf p53-Venus Fluoreszenz 11 die hellsten 15% der einzelnen Zellen zu isolieren. - Verschließen Sie die Platte mit einer neuen, sterilen thermische Dichtung und Zentrifuge bei 400 × g für 1 min bei 4 ° C. Die Platte wird in den Thermocycler und starten Sie das RTSTA Programm (siehe Schritt 1.7).
HINWEIS: Diese führt die Transkription von den sortierten Zellen auf der mRNA umgekehrt und verstärkt dann die cDNA der Transkripte von Interesse.
6. Exonucleasebehandlung
- Mischen verdünnter Exonuklease I , indem die Komponenten in der Tabelle 4 aufgeführt kombiniert. Bereiten Sie eine Reihe von 12-PCR-Röhrchen mit Kappen. 30,5 ul verdünnter Exonuklease verteile ich in jedes Röhrchen. Verschließe die Röhrchen und Spin kurz (5 sec bei 500 xg), um sicherzustellen, daß die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens ist.
- Wenn die RTSTA beendet ist, drehen Sie das Probenplatte ca. 5 s bei 500 x g. Mit einem 12-Kanal-Pipette, verteilen 3,6 ul verdünnter ExonukleaseIch in jede Vertiefung der Platte.
- Verschließen Sie die Platte mit einer sterilen thermische Dichtung und Spin kurz (ca. 5 s bei 500 · g). Die Platte wird in den Thermocycler und starten Sie das ExoI Programm (siehe Schritt 1.7).
Hinweis: Dieser Schritt verschlechtert alle Primer nach spezifischen Ziel-Amplifikation verbleibenden, so dass sie nicht mit zukünftigen PCR stören.
7. Probenverdünnung
- Wenn die Exonuclease-Behandlung abgeschlossen ist, fügen 32,4 & mgr; l TE-Puffer zu jedem Well der Probenplatte; Dies ist eine optionale Haltepunkt, und die Proben können bei -20 ° C für mehrere Tage gelagert werden.
8. Sortieren Qualitätskontrolle qPCR Verwendung
Hinweis: Da Zellsortierung nicht vollkommen effizient ist, ist dieser Schritt notwendig, um festzustellen, welche Vertiefungen der Platte sortierten erhalten tatsächlich eine Zelle. Diese Proben können dann für die weitere Analyse verwendet werden.
- Messen Sie die Housekeeping - Gen - Expression in jeder Probe durch qPCR.
- Bereiten Sie 900 ul der DNA-bindenden Farbstoff qPCR-Mastermix für 96 Reaktionen nach dem Protokoll des Polymerase-Hersteller unter Verwendung von Primern für eine der Housekeeping-Gene in Schritt ausgewählt 1.1; die genauen Konzentrationen der Reaktionspuffer, Polymerase, Primer etc. für diese Reaktion hängt von der spezifischen Polymerase abhängen verwendet werden.
- Verteilen 9 ul Master-Mix zu jeder Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. 1 ul Probe aus der Probenplatte auf die Vertiefung der PCR-Platte entspricht.
- Führen Sie die Platte auf einer Echtzeit - PCR - Maschine mit einem thermischen Zyklus - Protokoll durch den Master - Mix Hersteller oder nach einem Standardprotokoll 20 vorgeschlagen werden.
- Stellen Sie sicher, dass die Messungen von den nicht-Zell-Brunnen zeigen einen niedrigen (Hintergrund) Ebeneder Genexpression oder gar keiner Ausdruck.
- Stellen Sie sicher, dass die Messungen von 1-Zelle Brunnen klar in zwei Gruppen unterteilen: positive Proben mit hoher Genexpression und negativen Proben mit Hintergrundwerte des Ausdrucks oder ohne Ausdruck überhaupt, ähnlich wie bei den No-Zelle Brunnen.
HINWEIS: Die Proben mit hoher Genexpression darstellen tatsächlichen sortierten Zellen; Menschen mit Hintergrund Ausdruck sollte von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. - Stellen Sie sicher, dass die Messungen aus den 10-Zellen und 100-Zellen-Brunnen spiegeln höhere Genexpression als in den positiven 1-Zelle Brunnen, so dass für die Möglichkeit, dass ineffiziente Sortier diese Vertiefungen dazu führen könnten, weniger Zellen zu haben als gewünscht.
- Stellen Sie sicher , dass die Messungen von den Standard - Brunnen gleichmäßig im logarithmischen Raum verteilt sind (dh , dass die C t - Werte gleichmäßig verteilt sind).
9. Genexpression Messung mit Mikrofluidik-qPCR
HINWEIS: Für jeden Schritt in diesem Abschnitt Pipette nur bis zum ersten Anschlag die Bildung von Blasen in den Reagenzien zu minimieren.
- Öffnen Sie eine Reihe von 8 PCR-Röhrchen. Wenn es mehrere Platten von Proben sind, öffnen Sie eine zweite Reihe von 8 PCR-Röhrchen und beschriften Sie die Rohre 1-8. Diese Zeile wird für die Bündelung Standards aus mehreren Platten sein.
- In einem 1,5-ml-Röhrchen, mischen 360 & mgr; l DNA-bindenden Farbstoff qPCR-Mastermix mit 36 & mgr; l DNA-bindenden Farbstoff Probenbeladung Reagenz. Vortex kurz und Spin für 10 Sekunden bei 2.000 x g. Teilen Sie diese Mischung (396 ul) in die nicht-markierten Reihe von 8 PCR-Röhrchen, Platzierung 48 & mgr; l in jedes Röhrchen.
- Mit einem 8-Kanal-Pipette, verteilen 3,3 ul des Master-Mix / Probenbeladung Reagenzmischung in jede Vertiefungeines neuen 96-Well-PCR-Platte. Beschriften Sie diese Platte, "Sample Mixes."
- Für jede PCR - Platte der Proben:
- Vortex die Platte für 10 Sekunden und Spin für 10 Sekunden bei 500 x g. Entfernen Sie die Abdeckung und übertragen 2,7 ul jeder positiven 1-Zellprobe auf seine entsprechende Vertiefung auf der Probe Mischt Platte für die 1-Zelle Vertiefungen auf der Platte Karte angezeigt.
- Wenn es nur eine Platte von Proben ist, übertragen 2,7 ul jeder verstärkten Standard auf seine entsprechende Vertiefung auf der Probe Mischt Platte gemäß der Platte Karte.
- Wenn es mehrere Platten von Proben sind, übertragen 2,7 ul jeder verstärkten Standard zu seiner entsprechenden Position in der markierten Reihe von PCR-Röhrchen. In Normen von der aktuellen Platte der Proben auf alle dort bereits Standards. Verschließen Sie die Platte der Proben bei Verwendung eines Dichtungsfolie erfolgen.
- Wenn mehrere Platten der Proben:
- Vortex die Reihe von PCR-Röhrchen, die Standards für die10 sec und Spin für 10 Sekunden bei 2.000 x g. Übertragen 2,7 ul aus jedem Röhrchen von gemischten Standards in das Bohrloch entsprechend auf der Probe Mischt Platte gemäß der Platte Karte.
- Legen Sie die NTC-Brunnen mit 2,7 ul Nuklease-freies Wasser, wo auf der Platte Karte angezeigt. Siegel der Probe Mischt Platte und lagern bei 4 ° C bis benötigt.
- Ziehen Sie die Aufkleber von der Unterseite eines neuen mikrofluidischen qPCR-Chip. Unter Verwendung einer Spritze der Steuerleitung Flüssigkeit mit der Kappe noch auf, drücken Sie jeden Speicherfeder nach unten um sie zu lösen, und spritzen jeden Akkumulator mit 150-200 ul Steuerleitung Flüssigkeit.
- Setzen Sie den Chip in der Lademaschine und starten Sie das "Prime" Skript. Dies dauert ~ 20 min.
- Wenn Grundierung durchgeführt wird, Wirbel und drehen Sie die Platten von Testmischungen nach unten und Probenmischungen (in Schritt 1.6) hergestellt.
- Verwendung eines 8-Kanal-Pipette 4,5 ul jeder Testmischung in die linke Seite des mikrofluidischen qPCR-Chip gemäß der Darstellung in
- Übertragen 4,5 ul jeder Probenmischung auf die rechte Seite des mikrofluidischen Chips qPCR gemäß 6. Setzen Sie den Chip in die Lademaschine und führen Sie den "Load Mix" Skript. Dieser Vorgang dauert ca. 90 min.
- Schalten Sie den mikrofluidischen real-time PCR-Maschine, die Software zur Datenerfassung zu starten, und schalten Sie die Lampe um es aufzuwärmen. Dies dauert ~ 20 min.
- Wenn die Last Mix Skript ausgeführt wird, stellen Sie sicher, dass es keine Linien über den sind Chip würde dies eine Ladeproblem hinweisen. Entfernen Sie vorsichtig alle Staubpartikel aus der Verwendung von Klebeband oder Laborband-Chip. Setzen Sie den Chip in den mikrofluidischen real-time PCR-Maschine und die Datenerfassung Skript ausführen. Verwenden die Analysesoftware, um die Ergebnisse zu untersuchen und die Daten für die weitere Analyse exportiert.
- Entfernen Sie die Messungen , für die die qPCR Amplifikationskurven schlechter Qualität zeigen (dh, für die sich die Kurven nicht die Standard - S - förmigen Verstärkungskurve ähnlich) 20.
- Entfernen Sie Proben mit mehr als 30 schlechte Qualität oder Null - Messungen oder für die Housekeeping - Gen - Expression (siehe Schritt 1.1) wesentlich geringer ist als die meisten anderen Proben (Abbildung 7).
- Für jedes Gen, schätzen die richtige Schmelzpeakposition als Median der Schmelzpeak Stellen von jeder Probe. Wenn eine Messung mit einer Schmelz Peak aus dem Median liegt mehr als 1 ° C, zu entfernen , dass die Messung aus der Betrachtung 20.
- Für jedes Gen, erstellen Sie eine Standardkurve der mRNA Zahl in jeder Probe zu schätzen , eine Tabelle oder eine Skriptsprache , 20 verwendet wird .
HINWEIS: Die Standards in diesem Experiment von 10 bestehen, 100, 1.000 oder 10.000 Molekülenvon dsDNA zu jedem Transkript von Interesse entspricht. Wenn die reverse Transkription vollkommen effizient wäre, würde entsprechen die Standards bis 20, 200, 2.000 und 20.000 Molekülen von mRNA, da mRNA und cDNA sind einsträngige. In der Praxis ist dies nicht der Fall, so drücken wir Messungen als eine Schätzung in Einheiten von Molekülen × E RT, wobei E RT die Effizienz der reversen Transkription ist.- Für jeden Standard gut identifizieren m, die Anzahl der Moleküle von ssDNA (zweimal die Anzahl der Moleküle von dsDNA) vor der Verstärkung (beispielsweise 20 - Moleküle, Moleküle 200, etc.).
- Für jeden Standard gut, identifizieren die C t - Wert von qPCR 20.
- Mit den Werten für m und C t, führen Sie eine lineare Regression unter Verwendung der folgenden Gleichung eine Standardkurve mit den Parametern a und b für jedes Gen zu erzeugen, und die R 2 -Wert als ein findenn Indikator für die Güte der Anpassung:
- Von der Standardkurve berechnen Sie die PCR - Effizienz E für jedes Gen:
HINWEIS: Ein Wert von E viel größer als 1,0 (zB E> 1.1) ist physikalisch nicht realistisch; ein R 2 -Wert für die lineare Regressions viel weniger als 1,0 (beispielsweise R 2 <0,985) bedeutet , dass die Standards nicht zuverlässig arbeiten. Diese Probleme zeigen allgemein, daß die niedrigste Amplikon Standard unter einen Schwellenwert von zuverlässige Quantifizierung und somit die niedrigste Standard sollte aus der linearen Regression ausgeschlossen. Wird eine angemessene lineare Regression kann nicht mit mindestens drei einzigartigen Standards vorgenommen werden, um die Expressionsmessungen für das Gen zu verwerfen. - Wenn die lineare Regression ausreichend ist, verwenden Sie die Passform Parameter a und b </ em> für jedes Gen die Anzahl von mRNA - Molekülen m est (in Einheiten von Molekülen × E RT) für das entsprechende Gen in jedem Einzelzellprobe aus dem gemessenen Wert C t zu schätzen:
- Bezeichnen Sie jede Messung m est <1 als m est = 0. Auch bezeichnen jede Messung ohne Verstärkung in qPCR und somit Wert keinem C t als m est = 0.
HINWEIS: Die Messungen mit einem m est kleiner als die niedrigste oder größer als der höchste Standard in der Regression werden durch Extrapolation aus der Standardkurve gefunden. Diese Schätzungen sind nicht unbedingt ungültig sollte aber mit Vorsicht betrachtet werden.
- Visualisieren Sie die Einzelzell - Genexpressionsdaten.
- Machen Sie eine beeswarm Grundstück (Dorn, J. und Holy, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange / 37105), bei dem jeder Punkt die Genexpression in einer bestimmten Zelle darstellt; ein Beispiel ist in 8 gezeigt.
- Machen Sie eine Violine Grundstück (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661), in dem die Breite der "Violine" stellt die Frequenz der Genexpression Messungen um ein bestimmtes Niveau in der Population von Zellen analysiert; ein Beispiel ist in 8 gezeigt.
HINWEIS: Komplexere Analysen 21 die Beziehungen in der Expression zwischen Paaren von Genen untersuchen können, 22 und kann die Genexpression Netzwerke schließen.
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Representative Results
Eine allgemeine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1, mit Schritten zur Zellbehandlung, die Isolierung von einzelnen Zellen durch FACS, die Erzeugung gezeigt und Vorverstärkung von cDNA - Bibliotheken aus single-Zelllysaten, die Bestätigung der Einzelzell - cDNA - Bibliotheken in sortierter Wells, und die Messung der Genexpression durch qPCR.
In Vorbereitung auf die Analyse Einzelzellisolierung und Genexpression, ist es notwendig, zuerst gültige Oligonukleotid-Primerpaare für jedes Ziel-Gen von Interesse zu identifizieren. Abbildung 2 zeigt zwei Beispiele von Primerqualitätskontrollverfahren. Die Schmelzkurven werden folgende qPCR erzeugt mit dem Primerpaar getestet. Gültige Primer resultieren in einer Schmelzkurve mit einer einzigen Spitze (2A, grüne Kurve). Wenn mehrere Spitzen (2A, blaue Kurve) oder einer Kurve mit einer ausgeprägten Schulter (Figure 2A, sind rote Kurve) vorhanden ist , dieses das Vorhandensein multipler PCR - Produkte zeigt, und die Primer neu gestaltet werden soll. Als zweite Qualitätskontrollverfahren kann Agarose - Gelelektrophorese , um visuell verwendet werden , sicherzustellen , dass eine einzelne Bande mit der richtigen Größe für jedes Primerpaar vorhanden ist , getestet (2B). Mehrere Bands oder Bands der falschen Größe zeigen , dass die Primer nicht gültig sind (2B).
Folgende Primer-Validierung und die Erzeugung von Bibliotheken von qPCR-Standards von der korrekten Amplicons können Zellsortierung durchgeführt werden. Ein Beispiel Sortierschema ist in Abbildung 3 dargestellt. Jede sortiert Platte sollte Brunnen umfassen eine Verdünnungsreihe von Amplicon Standards enthält, mit 10, 100, 1.000 oder 10.000 Kopien jedes Ziel-Amplikon. Es wird auch empfohlen, Vertiefungen umfassen, in welche keine Zellen, 10-Zellen oder 100 Zellen sortiert werden, zusätzlich zu den Einzelzellen-Wells.Wegen Unwirtschaftlichkeit Sortierung, ist es oft notwendig, die Vertiefungen der Platte zu identifizieren, in denen einzelne Zellen erfolgreich hinterlegt. Aus diesem Validierungsschritt, nach dem Verfahren für die reverse Transkription und spezifische Zielamplifikation sollte qPCR durchgeführt werden , um die Expression eines Housekeeping - Gen (Figur 4) zu messen. Die Vertiefungen für die Amplicon - Standards (Abbildung 4, schwarze Kurven) soll zeigen , gleichmäßig Amplifikationskurven Abstand. Es sollte auch eine klare Trennung in den Kurven sein , entsprechend den "No-Zelle" Brunnen (Abbildung 4; rote Kurven), "10-cell" Brunnen (Abbildung 4; blaue Kurven) und "100-cell" Brunnen (Abbildung 4 ; lila Kurven). Eine klare Trennung erfolgen sollte auch für die "1-Zelle" Brunnen zur erfolgreichen Zellaufbringeinrichtung entsprechenden (Abbildung 4; grün Amplifikationskurven mit C t - Werten kleiner als die für die nicht-Zell - Kontrollen , sondern größere als die für die 10-Zell - Kontrollen) im Vergleich zu nicht erfolgreichen Zellablage (Abbildung 4; grüne Kurven mit C t - Werte in der Nähe von den für die nicht-Zell - Kontrollen). Sobald Vertiefungen mit einer einzigen Zelllysat identifiziert wurden, cDNA aus den Vertiefungen (möglicherweise von mehreren Platten) können pro Vertiefung mit einem single-Zelllysat zu einem mikrofluidischen Chip qPCR, übertragen werden. Zum Beispiel zeigt 5 eine hypothetische Array , das cDNA aus einzelnen Zellen kombiniert aus verschiedenen drei 96-Well - Platten in einem einzigen neuen Platte für die qPCR - Analyse sortiert.
Um die mikrofluidische qPCR Ergebnisse analysieren, die Proben , die wahrscheinlich nicht eine Zelle erhalten haben sollte zuerst entfernt werden, wie sie von vielen fehlenden oder Null Genexpression Messungen (Abbildung 7, Zeilen , die durch Pfeile) oder ungewöhnlich niedrige Housekeeping Genexpression angezeigt. Für jeden Test werden alle Messungen mit Schmelzpeaks, die nicht denen der othe entsprechenr Proben im gleichen Test sollte auch entfernt werden. Nach dem Entfernen von schlechten Proben und Messungen kann die lineare Regression auf, die an die Amplikon Standards entsprechende Messungen durchgeführt werden, um die absolute Zahl jedes Transkript von Interesse in jedem Einzelzellprobe abzuschätzen. 8 zeigt eine Visualisierung dieser Genexpressions Schätzungen, gemessen in Einheiten von × Molekülen reversen Transkriptionseffizienz, wie beeswarm und Violine Parzellen. In diesem Beispiel zeigen unbehandelte Zellen , die ein breites Spektrum von CDKN1A Expressionsniveaus, mit vielen Zellen nicht CDKN1A überhaupt exprimiert und mit anderen , die das Gen in Mengen Spanning zwei Grßenordnungen exprimieren. Nach der Behandlung mit Neokarzinostatin (NCS) für 3 Stunden, zum Ausdruck bringen die meisten Zellen CDKN1A bei viel höheren Ebenen, und die Variabilität verringert sich auf etwa eine einzige Größenordnung. Da die Dauer der Behandlung erhöht, verringert sich die durchschnittliche Höhe der CDKN1A Ausdruck und die Variabilität in Ausdruck erweitert.
Abbildung 1: Überblick über die Schritte in Einzelzell - Genexpressionsprofilen. Behandelten Zellen werden geerntet und mittels FACS direkt in Lysepuffer sortiert. mRNA-Spezies von Interesse werden revers transkribiert und die sich ergebende cDNA wird durch PCR amplifiziert. Housekeeping Genexpression in jeder Probe wird durch qPCR gemessen, um zu bestimmen, welche Proben tatsächlich eine Zelle empfangen. Bei den Proben dieses Qualitätskontrolltest besteht, die Expression von bis zu 96 Gene mit mikrofluidischen qPCR gemessen. Diese Zahl hat sich von einer früheren Veröffentlichung 11 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2: Beispiel Ergebnisse der Primer - Tests. (A) Schmelzkurven von qPCR. Die blaue Schmelzkurve (TNFRSF10D) hat mehrere Spitzen und die rote Schmelzkurve (TRIM22) hat eine "Schulter", die in der Nähe der ersten Spitze zu einer zweiten Spitze beträgt. Diese zeigen an, dass die verwendeten Primer in diesen Reaktionen verstärken mehrere Ziele und müssen neu gestaltet werden. Die grüne Schmelzkurve (SCN3B) hat einen einzigen Peak, im Einklang mit den Primern, die ein einziges Ziel zu verstärken. (B) amplifizierte DNA - Lauf auf einem Agarose - Gel. Die Bahnen für SCN3B, TRIM22 und TRPM2 enthalten mehrere Bänder; die Primer verwendet, um diese DNA-Amplikons verstärken mehrere Ziele machen und neu gestaltet werden müssen. Die Spur für TNFRSF10D hat eine einzelne Bande, die mit Primern, die ein einziges Ziel zu verstärken. Es ist erwähnenswert, dass die Primer für SCN3B die Schmelzkurve Test bestehen, aber das Gel Test nicht bestehen, während die für TNFRSF10D das Gel Test bestehen, aber die Schmelzkurve scheiternTest; Diese beiden Methoden der Primer-Validierung sind komplementär. In diesem Beispiel kann man schließen, dass alle vier Primersätze neu gestaltet werden müssen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Platte Karte für Zellsortierung. Diese Platte Karte umfasst 1-Zelle Brunnen (rot), 10- und 100-Zellen-Brunnen (dunkler rot), Standards (grün), und keine Zell Brunnen (weiß). Inklusive zwei Wiederholungen jeder Standard auf jeder Platte trägt dazu bei, Schwankungen der Standards zu kompensieren. 10-Zellen und 100-Zellen-Brunnen Inklusive ist hilfreich als Plausibilitätsprüfung für die Genexpression. Die nicht-Zell-Brunnen dienen als Negativkontrolle. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version t anzuzeigenseine Figur.
Abbildung 4: Beispiel für qPCR Amplifikationskurven von Art Qualitätskontrolle Messung GAPDH Ausdruck. Keine-Zellproben (rot) zeigen einen Hintergrundwert des Ausdrucks. 1-Zellproben (grün) teilen sich in zwei Gruppen, eine mit hoher Expression und eine mit niedriger Expression ähnlich wie die No-Zellproben. Die High-Expression Proben meisten erhalten wahrscheinlich eine reale Zelle während der Sortierung; die Low-Ausdruck Proben meisten tat wahrscheinlich nicht. 10-Zellen (blau) und 100-Zellen (lila) Proben zeigen eine höhere Expression als die 1-Zellproben; die 10-Zellproben sind in der Nähe zu den höchsten exprimierenden 1-Zellproben wegen Art Ineffizienz. Standards (schwarz) gleichmäßig verteilt sind, wie erwartet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ P>
Abbildung 5: Beispiel der Probe Mischt Platte Karte. Diese Platte Karte umfasst 1-Zellproben von drei verschiedenen Platten (Reihen AG), gemischt Standards aller drei Platten (H1-H8), no-Zellkontrollen (H9-H10) und no-Template-Kontrollen für qPCR (H11-H12 ). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Schematische Darstellung der mikrofluidischen qPCR - Chip mit der Reihenfolge der Beladung (1, 2, 3 ...). Die Kerbe (A1) ist die linke obere Ecke der Platte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version von thi zu sehenWert.
Abbildung 7: Wärmekarte der qPCR Ergebnisse. Jede Zeile stellt eine 1-Zelle Probe, Standard oder Kontrolle; jede Spalte stellt eine gemessene Transkript. Zeilen mit einer ungewöhnlichen Anzahl von schwarzen Quadraten oder Xs (Pfeile) wahrscheinlich zeigen Proben, die keine tatsächliche Zelle erhalten haben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: Beeswarm und Violine Plots. In einem beeswarm Grundstück (blaue Punkte), stellt jeder Punkt der Genexpression in einer bestimmten Zelle. In einer Violine Grundstück (grau Form), die Breite der "Violine" stellt die Frequenz der Genexpression measurungen um ein bestimmtes Niveau in der Population der analysierten Zellen. Hellblaue Balken stellen den niedrigsten Standard. Messungen über den blauen Balken sind zwischen den Standards interpoliert, während der Messung in den blauen Balken hochgerechnet werden. Die hier gezeigten Daten sind Messungen der CDKN1A Expression in MCF-7 - Zellen Venus-markiertes p53 behandelt mit Neocarzinostatin (NCS) für die angegebenen Zeiten , um Expression von DNA - Doppelstrangbrüche zu induzieren. Diese Zahl wurde von früheren Veröffentlichung geändert 11. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Bedingung | Temperatur | Zeit |
| Halt | 50 ° C | 15 Minuten |
| Halt | 95 ° C | 2 Minuten |
| 20 Zyklen | 95 ° C | 15 Sek |
| 60 ° C | 4 min | |
| Halt | 4 ° C | ∞ |
Tabelle 1: Die reverse Transkription und spezifische Ziel - Amplifikation (RTSTA) Temperaturwechselprogramm.
| Bedingung | Temperatur | Zeit |
| Halt | 37 ° C | 30 Minuten |
| Halt | 80 ° C | 15 Minuten |
| Halt | 4 ° C | ∞ |
Tabelle 2: Exonuclease I - Behandlung (ExoI) Temperaturwechselprogramm.
| Komponente | Volumen / Vertiefung (ul) | 96 Bände w / 10% overage (ul) |
| 2x Reaktionsmischung | 5.00 | 528,00 |
| Reverse-Transkriptase / Polymerase-Mix | 0,20 | 21,12 |
| 10x STA Primer Mix | 1,00 | 105,60 |
| 2,64 U / ul (verdünnt) RNAse-Inhibitor | 0,02 | 2.00 |
| Nuklease-freies Wasser | 0,78 | 82,48 |
| Gesamt | 7.00 | 739,20 |
Tabelle 3: Komponenten des Lysepuffers für die Zellen.
| Komponente | Volumen / Vertiefung (ul) | 96 Bände w / 10% overage (ul) |
| Nuklease-freies Wasser | 2,52 | 266,00 |
| Exonuclease I Reaktionspuffer (10x) | 0.36 | 38.00 |
| Exonuclease I (20 U / ul) | 0,72 | 76.00 |
| Gesamt | 3.60 | 380,00 |
Tabelle 4: Komponenten des Exonuklease mischen die verstärkten cDNA - Proben zu behandeln.
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Discussion
Wir haben zur Isolierung von einzelnen Säugerzellen aus einer Population von anhaftenden Zellen in der Kultur und zur Untersuchung der Expression von etwa 96 Gene in jeder Zelle gezüchtet ein Verfahren dargestellt. Gute rechtzeitige Vorbereitung ist entscheidend für diese Methode gut zu funktionieren. Insbesondere Entwerfen und Testen Primerpaare spezifisch für die Transkripte von Interesse (Schritte 1,2-1,3) sind zeitaufwendig, aber wichtige Schritte, wie die Primer, die Qualität der Einzelzellmessungen bestimmen. Sobald zuverlässige Primerpaare erhalten wurden, werden sie verwendet, um cDNA aus den Transkripten von Interesse zu verstärken; die Amplifikate werden miteinander kombiniert dann äquimolar Standards zu machen (Schritt 1.4). Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da die Standards der absoluten Transkript zählt zu schätzen sind erforderlich; Standards sollten einmal, aliquotiert und für alle nachfolgenden Runden der Zellsortierung und Genexpressionsmessungen vorgenommen werden. Ebenfalls am Tag, dass die Zellen sortiert werden, ist es besonders important, die Standards zu verdünnen sorgfältig mit Low-bindenden Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße, wenn Platten Lysepuffer machen (Schritte 3.7 und 3.11). Ziel, die Zellsortierer (Schritt 4.2) ist ein weiterer wichtiger Schritt; Dieses muss sehr sorgfältig erfolgen, um für die Zellen, um erfolgreich das Ziel von 9 & mgr; l Lysepuffer in einer PCR-Platte treffen.
Es gibt mehrere Modifikationen des Protokolls, das hergestellt werden kann, es zu einer Vielzahl von Forschungsbedarf anzupassen. Hier konzentrieren wir uns auf einem DNA-bindenden Farbstoff-basierte qPCR-Ansatz, der zur Quantifizierung der Genexpression eine relativ kostengünstige Methode zur Verfügung stellt. Jedoch hat dieses Verfahren das Potential für einen hohen Hintergrundsignal, da jede amplifizierte DNA zu schaffen, auch die des off-Zielsequenzen führt zu einem Fluoreszenzsignal. Ein solcher Hintergrund kann , indem sichergestellt wird, daß das Primerpaar ein bestimmtes Ziel zu amplifizieren minimiert werden , um eine Schmelzkurve mit einem einzigen Peak ergibt und ein einzelnes PCR - Produkt mit der richtigen Größe (Abbildung 2). Wenn der Hintergrund noch ein Anliegen ist eine solche Qualitätskontrollverfahren nach der Verwendung, eine sondenbasierte qPCR Ansatz kann verwendet werden, Off-Target-Erkennung zu minimieren, wenn auch zu höheren Kosten von Reagenzien. Eine andere Möglichkeit wäre eine nested PCR Ansatz, in dem ein Satz von Primern in der RTSTA Schritt verwendet wird, um revers transkribieren und eine große Region des Transkripts verstärken und einen zweiten Satz von Primern, die einen kleineren Bereich innerhalb dieses großen Bereich enthalten verstärkt wird verwendet, um die Genexpression durch qPCR zu messen. Dieser Ansatz wurde die Spezifität der DNA - Bindungsfarbstoffbasis qPCR 23 gezeigt , zur Verbesserung.
Es sind mehrere Verfahren zur Isolierung einzelner Zellen für die Genexpressionsanalyse zur Verfügung. Die Wahl der Zellisolierungsmethode hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Verfügbarkeit von Geräten (wie zB einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer), die Quelle der Zellen (wie etablierte Zelllinien gegenüber Primärzellen aus einem Gewebe) ausgewertet werden, oderdie Geschwindigkeit, mit der die Zellen isoliert werden müssen. In dem Beispiel in diesem Protokoll vorgestellt, verwendeten wir FACS einer Zelllinie, ein klar nachweisbares Fluoreszenz-markiertes Protein exprimiert. FACS hat die Vorteile der seltenen Fähigkeiten Zelldetektion und relativ schnelle Zellisolierung. Eine Herausforderung des Verfahrens besteht darin, daß die Abscheidung der Zellen von Interesse in der erforderlichen kleinen Volumen Lysepuffer in einer 96-Well-PCR-Platte ineffizient sein kann und kann die Optimierung der Zellsortierung Geometrie erfordern eine erfolgreiche Isolierung zu gewährleisten. Alternative Ansätze , die zu einer höheren Präzision in Zellisolierung bei niedrigeren Drehzahlen und / oder höhere Kosten umfassen die Mikropipettiervorrichtung einzelner Zellen, die Laser Mikrodissektion spezifischer Zellen aus einer Tumorprobe oder die Verwendung von mikrofluidischen Systemen (beispielsweise die Fluidigms C1 führen System).
Ein großer Vorteil des Protokolls hier beschrieben ist, dass die internen Kontrollen, eine Verdünnungsreihe von gereinigtem PCR-Produkte, e Nable die Abschätzung der absoluten Nummer jedes Transkript in jeder Zelle. Ohne diese Standards können nur relative Niveaus der Genexpression , die aus den C t - Werte abgeleitet , auf Berechnungen beruhen. Doch mit diesen Standards können absolute Transkript zählt geschätzt werden, idealerweise durch Interpolation im Bereich von genau quantifizierte Amplikon Standards (Abbildung 8). Wie bei jedem PCR-basierte Methode der Quantifizierung der Genexpression, genaue absolute Quantifizierung erfordert die Kenntnis der Leistungsfähigkeit jedes Prozesses, einschließlich der reversen Transkription.
Eine aktuelle Herausforderung Transkriptspiegel in einzelnen Zellen zu quantifizieren ist , dass die Nachweisgrenze für viele Methoden geschätzt 10-100 mRNAs pro Zelle 24, verhindern , dass die zuverlässige Quantifizierung eines bedeutenden Prozentsatz der Transkriptom zu sein. Als alternativer Ansatz kann man smRNA FISH zu quantifizieren Ziele von besonderem Interesse nutzenass = "xref"> 25, 26, mit sehr wenigen Transkripte einschließlich. Advances in smRNA FISH haben die Anzahl der verschiedenen Transkripte erweitert, die zugleich 27 und die Anzahl der Zellen nachgewiesen werden können, die gleichzeitig 28 profiliert sein kann, die geeignete Ausrüstung gegeben. Obwohl smRNA FISH seine eigenen Grenzen hat (Potential falsch-positive und falsch-negative Transkript Erkennung, Einschränkungen auf nur wenige Zielgene pro Zelle, die Kosten für die Ausrüstung und Reagenzien), kann es eine leistungsfähige Methode zur Verfügung stellen, um Ergebnisse aus einer Ergänzung und Validierung qPCR-basierte Analyse einer Teilmenge von Zielgenen von Interesse.
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Acknowledgments
Wir möchten, dass bei der Durchführung der Zellsortierung bei der Entwicklung dieses Protokolls V. Kapoor in der CCR ETIB Flow Cytometry Kern für ihre Hilfe zu danken. Wir danken auch M. Raffeld und die CCR LP Molecular Diagnostics Unit und J. Zhu und die NHLBI DNA-Sequenzierung und Genomics Core-für ihre Hilfe in der qPCR bei der Entwicklung dieses Protokolls durchgeführt wird. Diese Forschung wurde von der Intramural Programm des NIH unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
References
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