Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

doi: 10.3791/55219 Published: February 25, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Individuelle celler i en population kan vise vidt forskellige reaktioner på en ensartet fysiologisk stimulus 1, 2, 3, 4. Den genetiske variation af celler i en population er en mekanisme for denne sort af responser, men der er også flere ikke-genetiske faktorer, der kan øge variabiliteten af ​​responser selv i en klonal population af celler. For eksempel kan niveauerne af individuelle proteiner og andre vigtige signalmolekyler variere på en celle til celle-basis, hvilket giver anledning til variation i downstream genekspressionsprofiler. Derudover kan genaktivering forekomme i kortvarige byger af udskrifter 5, 6, der kan være begrænset til et relativt lille antal udskrifter pr burst 7, 8, 9. Sådanstokastik i genaktivering kan i høj grad bidrage til variation i biologiske reaktioner og kan give en selektiv fordel i mikroorganismer 10 og i pattedyrsceller 1, 2 reagerer på en fysiologisk stimulus. På grund af både genetiske og ikke-genetiske kilder til variation kan genekspressionsprofilen af ​​enhver given celle som reaktion på en stimulus er meget forskellig fra den gennemsnitlige genekspression profil opnået fra målingen af ​​bulk respons. Fastsættelse af, i hvilken udstrækning de enkelte celler viser variation i respons på en stimulus kræver teknikker til isolering af individuelle celler, måling af ekspressionsniveauerne for transkripter af interesse, og den beregningsmæssige analyse af de resulterende udtryk data.

Der er flere tilgange til analyse af genekspression i enkelte celler, der dækker en bred vifte af omkostninger, antal udskrifter undersøgt, ognøjagtigheden af ​​kvantificering. For eksempel enkelt-celle-RNA-Seq tilbyder en bred dybde af transkript dækning og evnen til at kvantificere tusindvis af særskilte transkripter til de mest højt udtrykte gener i individuelle celler; dog kan omkostningerne forbundet med en sådan sekventering dybde være uoverkommelige, selv om omkostningerne fortsætte med at falde. Omvendt, single-molekyle RNA fluorescens in situ hybridisering (smRNA FISH) tilbyder præcis kvantificering af udskrifter for selv lave ekspression af gener til en rimelig pris pr gen af interesse; dog kan kun et lille antal af målgener analyseres i en given celle ved denne fremgangsmåde. Kvantitative PCR-baserede analyser, der er beskrevet i denne protokol, giver en mellemvej mellem disse teknikker. Disse assays anvender en mikrofluid realtids-PCR-maskine at kvantificere op til 96 transkripter af interesse på et tidspunkt i op til 96 celler. Mens hver af de førnævnte metoder har fornødne hardware omkostninger, udgifter til en individuel qPCR analysen er forholdsvislav. Denne protokol er tilpasset fra en foreslået af en producent af en mikrofluid real-time PCR-maskine (protokol ADP 41, Fluidigm). For at aktivere estimeringen af ​​det absolutte antal af hver udskrift i en PCR-baseret tilgang, har vi udvidet protokollen at gøre brug af interne kontroller af tilberedte target gen amplikoner, der kan bruges på tværs af flere eksperimenter.

Som et eksempel på denne teknik, er kvantificeringen af ekspressionen af gener reguleret af tumor suppressor p53 i humane MCF-7 brystkarcinomceller beskrevet 11. Cellerne udfordres med et kemisk middel, der inducerer DNA dobbelt-strengbrud. Tidligere undersøgelser har vist, at p53 respons på DNA dobbelt-strengbrud udviser stor heterogenitet i individuelle celler, både med hensyn til p53-niveauer 12 og i aktiveringen af distinkte målgener 11. Endvidere p53 regulerer ekspressionen af ​​over 100velkarakteriseret målgener involveret i adskillige nedstrøms veje, herunder cellecyklusstop, apoptose, og senescens 13, 14. Da p53-medieret respons i hver celle er både kompleks og variabel, analysen af ​​fordelene system fra en tilgang, hvor næsten 100 målgener kan probes samtidig i individuelle celler, såsom den nedenfor beskrevne. Med mindre ændringer (såsom alternative metoder til enkelt-celle isolation og lysis), kan protokollen let tilpasses til at studere en lang række af mammale celletyper, udskrifter og cellulære reaktioner.

Med korrekt forudgående forberedelse, kan gennemføres en runde celle sortering og genekspression måling i henhold til denne protokol over en periode på tre dage. foreslås følgende tidsplan: på forhånd vælge de udskrifter af interesse, identificere og validere primerpar der forstærker cDNA fra dem transcrIPTS, og forberede de standarder og primerblandinger bruger disse primere. På dag 1 efter cellebehandling, høst og sortere celler, udføre revers transkription og specifik målamplifikation, og behandle prøverne med en exonuklease til fjernelse inkorporerede primere. På dag 2, udfører kvalitetskontrol på sorterede celler under anvendelse af qPCR. Endelig på dag 3, måle genekspression i de sorterede celler ved hjælp mikrofluid qPCR. Figur 1 opsummerer de involverede trin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Advance Forberedelse

  1. Vælg op til 96 gener af interesse, hvis udtryk vil blive målt.
    BEMÆRK: Mindst én af disse gener bør være en "housekeeping-gen", såsom ACTB eller GAPDH, er der vides at blive udtrykt på et relativt højt og konstant niveau under de anvendte betingelser i eksperimentet. Dette gen vil blive anvendt til sikker identifikation sorteret brønde (trin 8.1) og amplificerede prøver (trin 10.1).
    BEMÆRK: For eksempel eksperiment velkarakteriseret, direkte mål for p53 med en række kendte funktioner 11, 14 og GAPDH som en husholdning kontrol blev udvalgt. Se reference 11 for den komplette liste af mål gener og primersekvenser anvendt i denne undersøgelse.
  2. Identificere potentielle primerpar er specifikke for generne af interesse (f.eks, ved hjælp af den videnskabelige litteratur eller en primer design værktøj såsom Primer-BLAST) 15. Har primerens syntetiseret og opretholde dem i en bestand koncentration på 100 pM i nuklease-frit vand.
    BEMÆRK: Disse primere skal være 15-25 baser lang; frembringe en amplicon 90-130 basepar (bp) langt; spænde en exon-forbindelse, hvis den findes, for at mindske risikoen for amplifikation af genomisk DNA; har smeltetemperaturer på 60 ± 1 ° C; og har minimal sekundær struktur 16. Disse primere vil blive anvendt til at prime revers transskription, amplifikation cDNA fra transkripterne af interesse, og måle genekspression i DNA-bindende farvestof-baserede qPCR.
  3. Godkend primerne.
    1. Først opnå cDNA fra cellerne af interesse. Harvest RNA fra cellerne under anvendelse af en RNA høst kit ifølge producentens instruktioner eller standard molekylærbiologiske metoder 17. Revers-transkribere RNA til cDNA under anvendelse af en revers transkription kit med vilkårlige hexamerer i overensstemmelse med producentens anvisninger eller standard methods 17.
    2. For hvert primerpar, nedsat qPCR med DNA-bindende farvestof mastermix, forward og reverse primere, og cDNA'et fra det foregående trin, efter master mix producentens anbefalinger med foreslåede reaktionsbetingelser. Kør disse reaktioner på en real-time PCR-maskine ved hjælp af et termisk cykling protokol anbefalet af skibsføreren mix producent, der omfatter smelte erhvervelse kurve.
    3. Efter qPCR, køre de amplificerede DNA-prøver på en 2% vægt / vol agarosegel og visualisere DNA via en DNA indlejringsfarvestof efter en standardprotokol 17.
    4. Bestemme effektiviteten af primerparret ved at konstruere en standardkurve fra seriefortyndinger af cDNA (fremstillet i trin 1.3.1) ifølge en standardprotokol 16.
      BEMÆRK: En god primerpar vil give en smelte kurve med en enkelt, veldefineret top og et enkelt bånd i det forventede placering på gelen 16, up class = "xref"> 17 (figur 2). Hvis smelten kurve har flere toppe eller en "skulder", eller hvis gelen har flere bånd eller et smear er primerne amplifikation en off-målsekvens. Redesign eventuelle primere, der er blevet observeret at forstærke off-target-sekvenser og gentag de foregående validering trin som nødvendigt. En god primerpar vil også have en virkningsgrad på 90-110%, med R2 ≥0.985 for standardkurven 16; redesign eventuelle primere til hvilken effektiviteten eller R2 falder uden for disse områder.
  4. Forbered standarder fra oprenset DNA ampliconer.
    1. For hver valideret primerpar:
      1. Amplificere området af interesse fra cDNA under anvendelse af en high-fidelity DNA polymerase ifølge polymerasen producentens anbefalinger til primer og skabelon DNA-koncentrationer, reaktionsbetingelserne og PCR cyklusbetingelser, eller ved anvendelse af en standard-PCR-protokol"xref"> 17.
      2. Kør amplificerede cDNA på en 2% vægt / vol agarosegel og visualisere bånd med en DNA interkalerende farvestof 17. Udskære båndet repræsenterer amplikon under anvendelse af en ren barberblad og placere gelstykket i et mikrocentrifugerør.
      3. Oprens amplikon fra gelen under anvendelse af en standard gel ekstraktionsprocedure, såsom en agarase-baserede ekstraktion 17 eller en spin-kolonne gelekstraktionskit, ifølge producentens instruktioner.
      4. Måle koncentrationen af ​​amplicon anvendelse af en fluorescens-baseret dsDNA kvantificering kit ifølge producentens instruktioner. Del den målte dsDNA koncentrationen ved den kendte molekylvægt af amplikon baseret på amplicon sekvens for at opnå antallet af amplicon-molekyler pr pi.
      5. I en 2,0 ml lav-bindende mikrofugerør, tilsættes 2 pi oprenset amplicon til et volumen på DNA suspension buffer således at den endelige koncentration af ampLicon er 5 x 10 8 molekyler / pl.
    2. Når alle amplikoner er blevet oprenset, kombinere 18 pi af hvert oprenset amplicon i et 2,0 ml lav-bindende mikrocentrifugerør. Tilføj DNA suspension buffer til et totalvolumen på 1.800 pi; således, at koncentrationen af hvert amplikon er 5 x 10 6 molekyler / pl.
      BEMÆRK: Denne blanding, som indeholder cDNA amplikoner fra alle gener af interesse i kendte ækvimolære mængder, vil fungere som en standard i single-celle qPCR.
    3. Vortex denne "5E6" standard grundigt, spin for 10 sek ved 2.000 xg, og opdele i 20 pi prøver i lav-bindende PCR-rør. Opbevar de afmålte mængder ved -80 ° C.
  5. Forbered det specifikke mål forstærkning (STA) primer mix (10x).
    1. I en 15 ml konisk rør, kombinere 25 pi af hver 100 uM stock primer (op til 192). Tilføj DNA suspension buffer til et totalvolumen på 5.000 pi.
      BEMÆRK:Koncentrationen af hver primer i denne blanding er 500 nM. Hver plade af sorterede celler vil bruge 105,6 pi af denne primer mix at prime revers transkription og specifik målamplifikation. Mængden af ​​primer mix givet her er nok til at gøre 45 plader at sortere. Det er tilrådeligt at gøre en tilstrækkelig stor mængde primer mix, så det skal kun gøres én gang; skalere mængder efter behov.
    2. Bland grundigt ved hvirvelbehandling, opdeles i 110 pi prøver, og opbevare portioner ved -20 ° C.
  6. Forbered assay mix, en for hvert primerpar til anvendelse i mikrofluid chip-baserede qPCR.
    1. I hver brønd i en 96-brønds PCR-plade, kombinere 3,0 pi af 100 pM fremadrettede primer for et givet gen, 3,0 pi af den tilsvarende 100 uM revers primer, 24,0 pi DNA suspension buffer og 30,0 pi 2x assay loading reagens .
    2. Vortex denne plade, spin for 10 sek ved 500 xg, og opbevares ved -20 ° C.
  7. Opret to termisk cykling programmer: RTSTA (revers transkription og specifik målamplifikation, tabel 1) og Exol (exonuklease I-behandling; tabel 2).

2. Behandling

  1. Plate pattedyrcellerne på en vævskulturskål sådan, at de vil vokse til den ønskede sammenløbet på tidspunktet for behandlingen, afhængig af betingelserne for eksperimentel undersøgelse. For eksempel præsenteres i denne undersøgelse, plade 4 x 10 5 MCF-7 p53-Venus celler 18 pr 6 cm skål i RPMI med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, og 250 ng / ml amphotericin B. Inkubér cellerne i to dage ved 37 ° C med 5% CO2, indtil de når 50% konfluens.
  2. Behandle cellerne til at fastslå tilstanden af ​​interesse baseret på den eksperimentelle undersøgelse. For eksempel præsenteres i denne undersøgelse, inkuberes MCF-7 p53-Venus-celler med 400 ng / ml neocarzinostatin i 3 timer, 8,5 timer, 14 timer, eller 24 timer.

3. Lysis Buffer Forberedelse til Cell Sortering

BEMÆRK: At en enkelt plade lysisbuffer tager omkring en time. Det er tilrådeligt at gøre og sortere flere plader, som celle sortering kan være ineffektiv og giver mange brønde med nogen påviselig celle.

  1. Rengør bænken, pipetter, rør rack, kolde PCR-plade holdere, og handsker med DNA dekontamineringsopløsning som forberedelse til PCR.
  2. Fortynd RNAse inhibitor til 2,64 U / pl ved tilsætning stock RNAse inhibitor til nuclease-frit vand i et 1,5 ml rør.
    BEMÆRK: Dette giver RNAse inhibitor, hvormed lyseringspufferen uden pipettering sub-pi volumener.
  3. Gør lysepuffer til cellerne ved at kombinere bestanddelene anført i tabel 3.
  4. Overfør 92,4 pi af lysepuffer til cellerne i et separat rør; dette vil være lysis buffer for amplikonet standarder.
  5. Brug low-bindende pipettespidser og mikrocentrifugerør, forberede 200 pi og 500 pi E. coli-DNA fortyndet til 3,1 pg / pl og 6,2 pg / pl henholdsvis med DNA suspension buffer.
  6. Tilføj 184.8 pi 3,1 pg / pl E. coli DNA til lysis buffer til cellerne.
    BEMÆRK: E. coli bærer-DNA tjener til at udvide omfanget af ikke-specifik primerbindingsstedet muligheder og derved reducere sandsynligheden for, at primerdimerisering vil føre til et PCR-produkt.
  7. Forbered standarder.
    1. Label seks mikrocentrifugerør lave bindende som 5e5, 5E4, ... 5e0.
    2. Tilføj 90 pi DNA suspension buffer til "5e5" rør.
    3. Tilføj 90 pi 6,2 pg / pl E. coli DNA til hver af de andre fem rør. Hold alle rør på is.
      BEMÆRK: Omfattende bærer DNA i standarderne gør den samlede masse af DNA i standard brønde kan sammenlignes med den i 1-celle brønde; dette reducerer probability, at koncentrationen af ​​standarder vil blive påvirket af DNA-binding til rør eller pipettespidser.
    4. Tag en portion af "5E6" standard (5 x 10 6 molekyler / pl af hver amplikon, fremstillet i trin 1.4) fra lageret. Vortex kortvarigt og spin kortvarigt (5 sekunder ved 500 xg) for at sikre, at væsken er i bunden af ​​røret.
    5. Hjælp af en lav-bindende pipettespids, tilsættes 10 pi 5E6 standard til "5e5" rør. Vortex kortvarigt, centrifugering (5 sek ved 500 xg), og sætte røret tilbage på is.
    6. Pipette 10 pi fra "5e5" rør i "5E4" rør. Vortex kortvarigt, centrifugering (5 sek ved 500 xg), og sat tilbage på is.
    7. Gentag disse serielle fortyndinger, med hvert rør modtager 10 pi fra den foregående rør, indtil alle rør har en fortynding af standard.
  8. Forbered en række af 12 PCR-rør med hætter. Fordel 67 pi "celle" lyseringsbuffer til hvert rør. Cap rørene og spin ned kortvarigt (5sek ved 500 xg) om nødvendigt.
  9. Ved hjælp af en 12-kanals pipette, distribuere 9 pi "celle" lysepuffer fra rækken af PCR-rør i hver brønd i de første 7 rækker i en PCR-plade (figur 3).
  10. Fordel 7 pi "standard" lyseringsbuffer til hver brønd i den sidste række af pladen (figur 3).
  11. Anvendelse af lave-bindende pipettespidser, tilsættes 2 pi standard til hver brønd i den nederste række i henhold til pladen kort (figur 3).
    BEMÆRK: 2 pi 5 x 10 0 molekyler / ul faste beløb, 10 molekyler osv
  12. Tilsæt 2 pi 3,1 pg / pl E. coli DNA i 10-celle og 100-celle brønde; tilsættes 2 pi 6,2 pg / pl E. coli DNA i ikke-celle brøndene.
    BEMÆRK: Hver 1-celle, 10-celle, og 100-celle brønd har 6,2 pg af E. coli-DNA, tilnærme massen af genomisk DNA i en enkelt human celle. Hver standard og ingen celle brønd har 12,4 pg of E. coli-DNA, ca. to humane celler værd.
  13. Forsegle skiltet anvendelse af en steril termisk forsegling, spin for 5 sekunder ved 500 x g, og opbevares ved 4 ° C, indtil cellerne er klar til sortering.

4. Cell Sorter Setup

  1. Programmere fluorescensaktiveret cellesorterer at sortere i en 96-brønds plade ifølge pladediagram (figur 3); ingen celler skal sorteres i brønde H1-H8 eller H11-H12.
  2. Kontrollere, cellesorteringsapparatet er godt rettet til sortering i en PCR-plade.
    1. Indstil vinklen af ​​den slags strøm til det mindst mulige; denne indstilling øger chancen for, at cellerne vil blive sorteret i bunden af ​​brøndene i stedet ramte siderne.
    2. At sigte maskinen, forsegle en tom PCR-plade og bruge testen stream til "sortere" dråber af PBS på forseglingen af den tomme plade, i henhold til instruktionerne i maskinen 19; dråberne skulle lande på the overflade af forseglingen ved en position over midten af ​​brønden. For de bedste resultater, kontrollere målet over længden og bredden af ​​pladen.
    3. Hvis dråberne ikke lander i den korrekte position, tørre dem væk fra overfladen af ​​pakningen, kalibrere celle sorteringsanlæg ifølge maskinens producentens anvisninger, og gentag indtil dråberne i den slags strøm er deponeret korrekt.

5. Cell Høst og sortering

  1. Trypsinisér de som relevante for cellelinie celler. For eksempel til MCF-7-celler, aspireres mediet fra cellerne, skylles cellerne med 1 ml 0,05% trypsin, og inkuber cellerne med 2 ml 0,05% trypsin i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2 .
  2. Tilsæt 8 ml cellekulturmedium til de trypsiniserede celler og overdrager 10 ml cellesuspension til et 15 ml rør. Centrifuger i 4 min ved 400 x g.
  3. Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i PBS + 2% FBS. <br /> BEMÆRK: En mindre resuspension volumen koncentrerer cellerne og fremmer celle sortering; en 500 pi resuspension volumen fungerer godt for en 6 cm skål med celler ved 50% konfluens.
  4. Overfør cellesuspensionen til en 5 ml flowcytometri rør, pipettering gennem et 40 um filter til fjernelse klumper af celler.
  5. Centrifugeres pladen lyseringsbuffer ved 400 xg i 30 sekunder ved 4 ° C før sortering af cellerne for at sikre, at væsken er i bunden af ​​brøndene.
  6. Læg slangen med cellesuspensionen i cellen sorteringsanlæg. Åbn forseglingen på pladen lysisbuffer og omhyggeligt sortere cellerne af interesse i pladen ifølge pladen kort og efter cellesorteringsapparat producentens anvisninger 19. For at sikre at enkelte celler sorteres ved maksimal renhed, køre maskinen i "enkelt celle" mode og bruge standard flowcytometri gating baseret på forward og sidespredning 19.
    BEMÆRK: I deneksempel eksperiment, gate cellerne baseret på p53-Venus fluorescens at isolere lyseste 15% af de enkelte celler 11.
  7. Forsegle skiltet med en ny, steril termisk forsegling og der centrifugeres ved 400 xg i 1 min ved 4 ° C. Pladen anbringes i det termiske cyklusapparat og kør RTSTA programmet (se trin 1.7).
    BEMÆRK: Dette udfører revers transkription på mRNA fra de sorterede celler og forstærker det derefter cDNA af transkripterne af interesse.

6. exonukleasebehandling

  1. Bland fortyndet exonuklease I ved at kombinere bestanddelene i tabel 4 anførte. Forbered en række af 12 PCR-rør med hætter. Fordel 30,5 pi fortyndet exonuklease I i hvert rør. Luk rørene og spin kortvarigt (5 sekunder ved 500 xg) for at sikre, at væsken er i bunden af ​​røret.
  2. Når RTSTA er færdig, spinde prøven plade i 5 sekunder ved 500 x g. Ved hjælp af en 12-kanals pipette, distribuere 3,6 ul fortyndet exonucleaseI i hver brønd på pladen.
  3. Forsegl pladen med en steril termisk tætning og spin-kort (5 sek ved 500 xg). Pladen anbringes i den termiske cycler og kør Exol programmet (se trin 1.7).
    BEMÆRK: Dette trin nedbryder eventuelle primere tilbage efter specifikke mål forstærkning, så de ikke forstyrrer den fremtidige PCR.

7. Prøvefortynding

  1. Når exonukleasebehandling er færdig, tilsættes 32,4 pi TE-buffer til hver brønd af prøven plade; dette er en valgfri stoppunkt, og prøver kan opbevares ved -20 ° C i flere dage.

8. Sort Kvalitetskontrol Brug qPCR

BEMÆRK: Da celle sortering er ikke helt effektiv, dette trin er nødvendigt for at identificere, hvilke brønde i den sorterede plade rent faktisk har modtaget en celle. Disse prøver kan derefter anvendes til yderligere analyse.

  1. Mål husholdning genekspression i hver prøve ved qPCR.
  2. Forbered 900 pi DNA-bindende farvestof qPCR Master Mix i 96 reaktioner ifølge polymerase fabrikantens protokol under anvendelse af primere for en af ​​housekeeping-gener udvalgt i trin 1.1; de nøjagtige koncentrationer af reaktionsbuffer, polymerase, primere, osv for denne reaktion vil afhænge af den specifikke polymerase, der anvendes.
  3. Fordel 9 pi masterblandingen til hver brønd i en 96-brønds PCR-plade. Tilsæt 1 pi prøve fra prøven plade til den tilsvarende brønd på PCR-plade.
  4. Kør pladen på en real-time PCR-maskine under anvendelse af en termisk cyklus-forløb foreslået af master mix fabrikanten eller efter en standardprotokol 20.
  • Analyser qPCR data 20; et eksempel på qPCR data fra sortere kvalitetskontrol nedenstående trin er vist i figur 4.
    1. Kontroller, at målingerne fra de ikke-celle brønde viser en lav (baggrund) niveauaf genekspression eller ingen ekspression overhovedet.
    2. Kontroller, at målinger fra 1-celle brønde opdele klart i to grupper: positive prøver med høj genekspression og negative prøver med baggrundsniveauer udtryksformer eller ingen udtryk på alle, svarende til ikke-celle brønde.
      BEMÆRK: prøver med høj genekspression repræsenterer faktiske sorteret celler; dem med baggrund udtryk bør udelukkes fra yderligere analyse.
    3. Kontrollere, at målinger fra 10-celle og 100-celle brøndene afspejler højere genekspression end i de positive 1-celle brønde, hvilket giver mulighed for, at ineffektive sortering kan forårsage disse brønde til at have færre celler end ønsket.
    4. Kontroller, at målinger fra de almindelige brønde er jævnt fordelt i logaritmisk rum (dvs. at C-t-værdier er jævnt fordelt).
  • Efter at have identificeret alle positive 1-celleprøver, lave en "Sample miks" plade kort for at kortlægge positive 1-cell prøver på en ny 96-brønds plade. Medtag otte brønde til standarder på denne plade kort. Se figur 5 for et eksempel.
  • 9. Gene Expression måling med Mikrofluid qPCR

    BEMÆRK: For hvert skridt i dette afsnit, til pipette kun til det første stop minimere dannelsen af ​​bobler i reagenserne.

    1. Åbn en række af 8 PCR-rør. Hvis der er flere plader af prøver, åbne en anden række af 8 PCR-rør og mærke rørene 1-8. Denne række vil være for at samle standarder fra flere plader.
    2. I et 1,5 ml rør, blandes 360 pi DNA-bindende farvestof qPCR Master Mix med 36 pi DNA-bindende farvestof prøve loading reagens. Vortex kort og spin for 10 sek ved 2000 x g. Divider denne blanding (396 pi) i den umærkede række af 8 PCR-rør, anbringelse 48 pi i hvert rør.
    3. Anvendelse af en 8-kanals pipette, distribuere 3,3 pi af blandingen masterblandingen / prøvepåfyldning reagens i hver brøndaf en ny 96-brønds PCR-plade. Mærk denne plade, "Sample miks."
    4. For hver PCR-plade af prøver:
      1. Vortex pladen i 10 sek og centrifugering i 10 sekunder ved 500 x g. Fjern dækslet og overføre 2,7 pi af hver positiv 1-celleprøve til dets tilsvarende brønd på prøven miks plade til 1-celle brønde angivet på pladen kort.
      2. Hvis der kun er én plade af prøver, overføre 2,7 pi af hver amplificeret standard til den tilsvarende brønd på prøven miks plade ifølge pladen kort.
      3. Hvis der er flere plader af prøver, overføre 2,7 pi af hver amplificeret standard til sin tilsvarende position i det mærkede række af PCR-glas. Tilføj standarder fra den nuværende plade af prøver til eventuelle standarder, der allerede der. Forsegle skiltet af prøver når gøres ved anvendelse af en forseglende film.
    5. Hvis der er flere plader af prøver:
      1. Vortexes række af PCR-rør indeholdende standarder for10 sek og spin for 10 sek ved 2000 x g. Overfør 2,7 ul fra hvert rør af blandede standarder i den tilsvarende godt på Sample miks pladen ifølge pladen kortet.
    6. Læg NTC brønde med 2,7 ul nuklease-frit vand, hvor der er angivet på pladen kortet. Forsegl Sample miks plade og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
    7. Peel mærkaten væk fra bunden af ​​en ny microfluidic qPCR chip. Ved hjælp af en sprøjte med styreledning væske med hætten stadig på, tryk ned hver akkumulator forår for at løsne den, og injicere hver akkumulator med 150-200 pi af kontrol linje væske.
    8. Sæt chip i laste- maskinen og kør "Prime" script. Dette tager ~ 20 min.
    9. Når priming er færdig, vortex og spin ned plader assay blandinger (udarbejdet i trin 1.6) og prøve blandinger.
    10. Anvendelse af en 8-kanals pipette til 4,5 pi af hvert assay blandes ind i venstre side af mikrofluid qPCR Chip ifølge diagrammet i g> figur 6. Pipette meget omhyggeligt for at undgå at skabe luftbobler på bunden af ​​brøndene. Når du er færdig, forsegle plade af assay mix og opbevares ved -20 ° C til senere brug.
    11. Overfør 4,5 pi af hver prøve blandes til højre side af mikrofluid qPCR Chip ifølge figur 6. Sæt chippen i lastning maskine og køre "Load Mix" script. Dette tager ~ 90 min.
    12. Tænd for mikrofluid realtids-PCR-maskine, starte dataindsamlingen software, og tænd for lampen at varme det op. Dette tager ~ 20 min.
    13. Når Load Mix scriptet er færdig, skal du kontrollere, at der ikke er nogen linjer på tværs af chip-dette ville indikere en lastning problem. Fjern forsigtigt eventuelle støvpartikler fra chippen bruger Scotch tape eller lab tape. Sæt jeton i mikrofluid real-time PCR-maskine og køre dataindsamlingen script. Brug analysesoftware at inspicere resultaterne, eksportere data til yderligere analyse.
    _title "> 10. Analyse af data

    1. Fjern målingerne for hvilke qPCR amplifikationsprodukter kurver viser dårlig kvalitet (dvs. for hvor kurverne ikke ligner standard sigmoidal amplifikationskurven) 20.
    2. Fjern prøver med mere end 30 dårlig kvalitet eller ingen målinger eller for hvilke housekeeping genekspression (se trin 1.1) er meget lavere end de fleste andre prøver (figur 7).
    3. For hvert gen, anslås det korrekte smeltetopværdianalyse placering som medianen af ​​smelten toppunktsplaceringer fra hver prøve. Hvis en måling har en smelte højdepunkt ligger mere end 1 ° C fra medianen, fjerne, at måling fra betragtning 20.
    4. For hvert gen, skabe en standardkurve til at estimere mRNA tæller i hver prøve ved hjælp af et regneark eller scriptsprog 20.
      BEMÆRK: Standarderne i dette eksperiment består af 10, 100, 1000 eller 10.000 molekyleraf dsDNA svarende til hver udskrift af interesse. Hvis revers transkription var helt effektiv, ville standarderne svare til 20, 200, 2.000 og 20.000 molekyler af mRNA, idet mRNA og cDNA er enkeltstrenget. I praksis er dette ikke tilfældet, så vi udtrykker målinger som et skøn i enheder af molekyler × E RT, hvor E RT er effektiviteten af revers transkription.
      1. For hver standard brønd, identificere m, antallet af molekyler af ssDNA (to gange antallet af molekyler af dsDNA) før amplifikation (f.eks, 20 molekyler, 200 molekyler, etc.).
      2. For hver standard godt, identificere C t-værdien fra qPCR 20.
      3. Med værdierne for m og C t, udføre en lineær regression ved anvendelse af følgende ligning til at generere en standardkurve med parametrene a og b for hvert gen, og finde R2 værdi som enn indikator for goodness of fit:
        ligning 1
      4. Fra standardkurven, beregne PCR effektivitet E for hvert gen:
        ligning 2
        BEMÆRK: En værdi på E meget større end 1,0 (fx E> 1.1) ikke er fysisk realistisk; en R2-værdi for den lineære regression meget mindre end 1,0 (fx R2 <0,985), betyder, at standarderne ikke fungerer pålideligt. Disse problemer generelt indikerer, at den laveste amplicon standarden falder under en tærskel på pålidelig kvantificering, og dermed den laveste standard bør udelukkes fra den lineære regression. Hvis en tilstrækkelig lineær regression ikke kan fremstilles ved hjælp af mindst tre unikke standarder, kassere udtrykket målinger for genet.
      5. Hvis den lineære regression er tilstrækkelig, den deraf opståede fit parametrene a og b </ em> for hvert gen at estimere antallet af mRNA-molekyler m est (i enheder af molekyler × E RT) i det tilsvarende gen i hver enkelt celle prøve fra den målte Ct-værdi:
        ligning 3
      6. Udpeg en måling m est <1 som m est = 0. Også udpege en måling uden forstærkning i qPCR og dermed ingen Ct værdi som m est = 0.
        BEMÆRK: Målinger med en m est mindre end det laveste eller større end den højeste standard bruges i regressionen findes ved ekstrapolation fra standardkurven. Disse skøn er ikke nødvendigvis ugyldige, men bør betragtes med forsigtighed.
    5. Visualiser de encellede genekspression data.
      1. Lav en beeswarm plot (Dorn, J. og Holy, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange / 37105), hvori hvert punkt repræsenterer genekspression i en bestemt celle; et eksempel er vist i figur 8.
      2. Foretag en violin plot (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661), hvor bredden af ​​det "violin" repræsenterer frekvensen af ​​genekspression målinger omkring et bestemt niveau i population analyserede celler; et eksempel er vist i figur 8.
        BEMÆRK: Mere avancerede analyser kan sonde relationerne i udtryk mellem par af gener 21, 22 og kan udlede genekspression netværk.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    En generel oversigt over protokollen er vist i figur 1, herunder trin til celle behandling, isolering af enkelte celler ved FACS, generering og præ-amplifikation af cDNA-biblioteker fra single-cellelysater, bekræftelse af enkelt-celle cDNA-biblioteker i sorterede brønde og måling af genekspression ved qPCR.

    Som forberedelse til enkelt-celle isolation og genekspression analyse, er det nødvendigt først at identificere gyldige oligonukleotidprimerpar for hvert målgen af ​​interesse. Figur 2 viser to eksempler på primer kvalitet-bekæmpelsesmetoder. Smelte kurver genereres efter qPCR med primerparret der testes. Gyldige primere resulterer i en smelte kurve med en enkelt top (figur 2A, grøn kurve). Hvis flere toppe (figur 2A, blå kurve) eller en kurve med en udtalt skulder (Figure 2A, røde kurve) er til stede, indikerer dette tilstedeværelsen af flere PCR-produkter, og primerne bør ændres. Som et andet kvalitetskontrol fremgangsmåde kan agarosegelelektroforese bruges til visuelt at kontrollere, at et enkelt bånd med den korrekte størrelse er til stede for hver afprøvet (figur 2B) primerpar. Multiple bånd eller bånd af forkert størrelse indikerer, at primerne ikke er gyldige (figur 2B).

    Efter primer validering og generering af biblioteker af qPCR standarder fra de korrekte amplikoner, kan cellesortering skal udføres. Et eksempel sortering ordning er angivet i figur 3. Hver ordnet plade bør omfatte brønde, der indeholder en fortyndingsrække af amplicon standarder, med 10, 100, 1000 eller 10.000 eksemplarer af hvert mål amplicon. Det anbefales også at omfatte brønde, hvori ingen celler, 10 celler eller 100 celler sorteres, foruden de encellede brønde.Grundet sortering ineffektivitet, er det ofte nødvendigt at identificere brøndene i pladen, hvor enkelte celler med succes er blevet deponeret. Til denne validering trin, ved at følge fremgangsmåden til revers transkription og specifik målamplifikation bør qPCR udføres for at måle ekspressionen af et housekeeping-genet (figur 4). Brøndene for amplikonet standarder (figur 4, sorte kurver) skal vise jævnt fordelte amplifikationsprodukter kurver. Der bør også være klar adskillelse i kurverne svarer til "no-celle" brønde (Figur 4, røde kurver), "10-celle" brønde (figur 4, blå kurver), og "100-celle" brønde (Figur 4 ; lilla kurver). En klar adskillelse bør også forekomme for "1-celle" brønde svarende til vellykket celle deposition (Figur 4, grøn forstærkning kurver med C t-værdier mindre end for de ikke-celle kontrol men greater end for de 10-celle kontrol) versus mislykket celle deposition (Figur 4, grønne kurver med C t-værdier i nærheden af dem, for de ikke-celle kontrol). Når brønde med en enkelt cellelysat er blevet identificeret, kan cDNA fra brøndene (potentielt fra flere plader) overføres til en mikrofluid qPCR chip, med en enkelt-cellelysat per brønd. For eksempel viser figur 5 en hypotetisk matrix, der kombinerer cDNA fra enkelte celler fra tre forskellige Language plader med 96 brønde i en enkelt ny plade for qPCR analyse.

    At analysere de mikrofluide qPCR resultater, bør de prøver, der sandsynligvis ikke modtog en celle først fjernes, som angivet med mange mangler eller nul genekspression målinger (figur 7, rækker angivet med pile) eller usædvanligt lave housekeeping genekspression. For hver analyse, eventuelle målinger med smeltetopværdier der ikke matcher de af other prøver i det samme assay bør også fjernes. Efter fjernelse dårlige prøver og målinger, kan lineær regression udføres på målingerne svarer til de amplicon standarder for at estimere den absolutte optælling af hvert transkript af interesse i hver enkelt celleprøve. Figur 8 viser en visualisering af disse genekspression skøn, målt i enheder af molekyler × revers transkription effektivitet, som beeswarm og violin plots. I dette eksempel ubehandlede celler viser en bred vifte af CDKN1A ekspressionsniveauer, med mange celler som ikke udtrykker CDKN1A overhovedet og med andre udtrykker genet på niveauer, der spænder over to størrelsesordener. Efter behandling med neocarzinostatin (NCS) i 3 timer, de fleste celler udtrykker CDKN1A ved meget højere niveauer, og variabiliteten falder til omkring en enkelt størrelsesorden. Da varigheden af behandling stiger, det gennemsnitlige niveau for CDKN1A udtryk falder, og variationen i ekspression udvider.

    figur 1
    Figur 1: Oversigt over trinene i single-celle genekspression profilering. Behandlede celler høstes og sorteres via FACS direkte i lysisbuffer. mRNA-arter af interesse er revers-transkriberet, og det resulterende cDNA amplificeres ved PCR. Housekeeping genekspression i hver prøve måles ved qPCR at bestemme, hvilke prøver faktisk modtog en celle. I prøver, der passerer denne kvalitetskontrol test, er det udtryk for op til 96 gener, målt ved hjælp af mikrofluid qPCR. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

    19 / 55219fig2.jpg "/>
    Figur 2: Eksempler resultater af primer test. (A) Smelt kurver fra qPCR. Den blå smelte kurve (TNFRSF10D) har flere toppe og den røde smelte kurve (TRIM22) har en "skulder", hvilket svarer til en top tæt den første top. Disse indikerer, at primerne anvendes i disse reaktioner amplificere flere mål og skal redesignet. Den grønne smelte kurve (SCN3B) har en enkelt top, i overensstemmelse med primere, der amplificerer et enkelt mål. (B) amplificeret DNA kørt på en agarosegel. De baner til SCN3B, TRIM22, og TRPM2 indeholde flere bands; primerne anvendt til at gøre de DNA amplikoner amplificere flere mål og skal redesignet. Banen for TNFRSF10D har et enkelt bånd, i overensstemmelse med primere, der amplificerer et enkelt mål. Det er værd at bemærke, at primerne til SCN3B passere smelten kurven test, men mislykkes gelen test, mens dem for TNFRSF10D passere gelen test, men mislykkes smelten kurvenprøve; disse to metoder til primer validering er komplementære. I dette eksempel kan man konkludere, at alle fire primersæt skal redesignet. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3: Plade kort for celle sortering. Denne plade map inkluderer 1-celle brønde (rød), 10- og 100-celle brønde (mørkere rød), standarder (grøn), og ingen-celle brønde (hvid). Herunder to replikater af hver standard på hver plade med til at kompensere for variation i standarder. Herunder 10-celle og 100-celle brønde er nyttigt som en tilregnelighed check for genekspression. De ikke-celle brønde tjene som en negativ kontrol. Klik her for at se en større udgave af thans figur.

    Figur 4
    Figur 4: Eksempel på qPCR forstærkning kurver fra slags kvalitetskontrol måling GAPDH udtryk. Ingen-celleprøver (rød) viser et baggrundsniveau af ekspression. 1-celleprøver (grøn) kløft i to forskellige grupper, en med høj ekspression og en med lav ekspression ligner de ikke-celleprøver. Den høje ekspressionsniveauer prøver sandsynligvis modtaget en reel celle under sortering; lav-udtryk prøver sandsynligvis ikke. 10-celle (blå) og 100-celle (lilla) prøverne viser højere ekspression end de 1-celleprøver; De 10-celleprøver er tæt på de højest udtrykkende 1-celleprøver grund af sortering ineffektivitet. Standarder (sort) er jævnt fordelt, som forventet. Klik her for at se en større version af dette tal. </ P>

    Figur 5
    Figur 5: Eksempel på Sample miks plade kort. Denne plade kort omfatter 1-celleprøver fra tre forskellige plader (rækker AG), standarder blandet fra alle tre plader (H1-H8), no-cellekontroller (H9-H10), og uden template kontrol for qPCR (H11-H12 ). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 6
    Figur 6: Diagram over mikrofluid qPCR chip med rækkefølgen af belastning (1, 2, 3 ...). Den hak (A1) er den øverste venstre hjørne af pladen. Klik her for at se en større version af this figur.

    Figur 7
    Figur 7: Heat map af qPCR resultater. Hver række repræsenterer et 1-celleprøve, standard eller kontrol; hver kolonne repræsenterer en målt udskrift. Rækker med et usædvanligt antal sorte firkanter eller Xs (pile) sandsynligvis indikerer prøver, der ikke modtog en egentlig celle. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 8
    Figur 8: Beeswarm og violin plots. I en beeswarm plot (blå punkter), hvert punkt repræsenterer genekspression i en bestemt celle. I en violin plot (grå form), bredden af ​​"violin" repræsenterer frekvensen af ​​genekspression measuvandskravene omkring et bestemt niveau i populationen af ​​analyserede celler. Lyseblå søjler repræsenterer den laveste standard. Målinger over de blå søjler interpoleres mellem standarder, mens målinger inden de blå søjler er ekstrapoleret. De viste data er målinger af CDKN1A ekspression i MCF-7 celler, der udtrykker Venus-mærket p53 behandlet med neocarzinostatin (NCS) i de angivne tidsrum for at inducere DNA dobbelt-strenget pauser. Dette tal er blevet ændret fra tidligere publikation 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Tilstand Temperatur Tid
    Holde 50 ° C 15 min
    Holde 95 ° C 2 min
    20 cykler 95 ° C 15 sek
    60 ° C 4 min
    Holde 4 ° C

    Tabel 1: Omvendt transskription og specifikke mål forstærkning (RTSTA) termisk cykling program.

    Tilstand Temperatur Tid
    Holde 37 ° C 30 min
    Holde 80 ° C 15 min
    Holde 4 ° C

    Tabel 2: exonuklease I-behandling (Exol) termisk cykling program.

    Komponent Volumen / brønd (pi) 96 bind w / 10% overskud (pi)
    2x-reaktionsblandingen 5.00 528,00
    Revers transkriptase / polymerase mix 0,20 21.12
    10x STA Primer Mix 1.00 105,60
    2,64 U / pl (fortyndet) RNAse inhibitor 0.02 2.00
    Nuklease-frit vand 0,78 82,48
    Total 7,00 739,20

    Tabel 3: Komponenter af lysis buffer til cellerne.

    Komponent Volumen / brønd (pi) 96 bind w / 10% overskud (pi)
    Nuklease-frit vand 2,52 266,00
    Exonuklease I Reaction Buffer (10x) 0,36 38.00
    Exonuklease I (20 U / pl) 0,72 76.00
    Total 3,60 380,00

    Tabel 4: Komponenter i exonuklease mix at behandle de amplificerede cDNA prøverne.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Vi har præsenteret en fremgangsmåde til isolering individuelle pattedyrsceller fra en population af adhærente celler dyrket i kultur og til analyse af ekspressionen af ​​ca. 96 gener i hver celle. God forudgående forberedelse er kritisk for denne metode til at fungere godt. Især design og test primerpar specifikke for udskrifter af interesse (trin 1,2-1,3) er tidskrævende, men vigtige skridt, som primerne bestemme kvaliteten af ​​de encellede målinger. Når pålidelige primerpar er opnået, bliver de brugt til at forstærke cDNA fra udskrifter af interesse; amplikonnerne kombineres derefter sammen i ækvimolære mængder til at gøre standarder (trin 1.4). Dette trin er kritisk, da standarderne er forpligtet til at estimere de absolutte udskrift tæller; bør standarder gang, alikvoteret og anvendes til alle efterfølgende runder af cellesortering og genekspression målinger. Ligeledes på dagen, at cellerne er sorteret, er det især important at fortynde standarderne omhyggeligt bruger lav-bindende pipettespidser og mikrocentrifugerør, når de foretager plader af lysisbuffer (trin 3.7 og 3.11). Sigter cellen sorteringsanlæg (trin 4.2) er en anden afgørende skridt; dette skal gøres meget omhyggeligt, for at cellerne med held ramte målet af 9 pi lysepuffer i et PCR-plade.

    Der er flere ændringer af protokol, der kan gøres for at tilpasse den til en bred vifte af forskningsbehov. Her har vi fokuseret på en DNA-bindende farvestofbaseret qPCR tilgang, som giver en forholdsvis overkommelig metode til kvantificering af genekspression. Denne fremgangsmåde har potentialet til at skabe en høj baggrund signal, idet enhver amplificeret DNA, selv det af ikke-tilsigtede sekvenser, resulterer i et fluorescerende signal. Sådan baggrund kan minimeres ved at sikre, at den anvendte primerpar til amplifikation af et specifikt mål giver en smelte kurve med en enkelt top og en enkelt PCR-produkt af den korrekte størrelse (figur 2). Hvis baggrunden er stadig et problem efter at have brugt sådanne kvalitet-metoder, kan en sonde-baserede qPCR tilgang anvendes til at minimere off-target afsløring, omend på en større omkostning af reagenser. En anden mulighed ville være en nested PCR strategi, hvori et sæt af primere anvendes i RTSTA trin på omvendt transskribere og amplificere et stort område af transkriptet, og et andet sæt primere, som amplificerer et mindre område indeholdt i denne store region , bruges til at måle genekspression ved qPCR. Denne fremgangsmåde har vist sig at forbedre specificiteten af DNA-bindende farvestof-baserede qPCR 23.

    Adskillige metoder er tilgængelige til isolering af individuelle celler til genekspression analyse. Valget af celleisolering metode afhænger af flere faktorer, herunder udstyr til rådighed (såsom en fluorescens-aktiveret cellesorterer), kilden til de celler, der skal evalueres (såsom etablerede cellelinier versus primære celler fra et væv), ellerden hastighed, hvormed cellerne skal isoleres. I eksemplet præsenteret i denne protokol anvendte vi FACS af en cellelinie, der udtrykker en klart påviselig fluorescerende-mærket protein. FACS har fordelene af sjældne afsløring celle kapaciteter og relativt hurtig celle isolation. En af udfordringerne ved metoden er, at aflejring af cellerne af interesse, til den fornødne lille volumen af ​​lysisbuffer i en 96-brønds PCR-plade kan være ineffektiv og kan kræve optimering af cellesortering geometri at sikre en vellykket isolering. Alternative fremgangsmåder, som kan føre til større præcision i celleisolering ved lavere hastigheder og / eller højere omkostninger omfatter micropipetting af individuelle celler, laser capture mikrodissektion af specifikke celler fra en tumor prøve eller anvendelsen af mikrofluide systemer (f.eks den Fluidigm C1 system).

    En væsentlig fordel ved protokollen beskrevet her er, at de interne kontroller, en fortyndingsrække af oprensede PCR amplikoner, e nable estimeringen af ​​det absolutte antal af hver udskrift i hver celle. Uden disse standarder, kan fås kun relative niveauer af genekspression baseret på beregninger afledt af C t-værdier. Men med disse standarder, absolutte transcript tællinger kan estimeres, ideelt set gennem interpolation inden for intervallet præcist kvantificerede amplicon standarder (figur 8). Som med enhver PCR-metode af genekspression kvantificering, præcis absolut kvantificering kræver viden om effektiviteten af ​​hver proces, herunder revers transkription.

    En aktuel udfordring at kvantificere transkriptniveauer i enkelte celler er, at detektionsgrænsen for mange metoder er estimeret til 10-100 mRNA per celle 24, hvilket forhindrer pålidelig kvantificering af en betydelig procentdel af transkriptomet. Som en alternativ fremgangsmåde kan man anvende smRNA FISH at kvantificere mål af særlig interesseass = "xref"> 25, 26, herunder dem med meget få udskrifter. Fremskridt inden smRNA FISH har udvidet antallet af forskellige transkripter, der kan detekteres på en gang 27, og antallet af celler, der kan være profileret på en gang 28, har det fornødne udstyr. Selvom smRNA FISH har sine egne begrænsninger (potentiel falsk-positive og falsk-negative udskrift afsløring, begrænsninger for kun et par målgener per celle, udgifter til udstyr og reagenser), kan det give en kraftfuld metode til at supplere og validere resultater fra et qPCR-analyse af en delmængde af target gener af interesse.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Vi vil gerne takke V. Kapoor i CCR ETIB flowcytometri Core for hendes hjælp i udførelsen cellen sortering under udviklingen af ​​denne protokol. Vi takker også M. Raffeld og CCR LP Molekylær Diagnostik Unit og J. Zhu og NHLBI DNA-sekventering og Genomics Core for deres hjælp i at udføre qPCR under udviklingen af ​​denne protokol. Denne forskning blev støttet af Intramural Program for NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
    High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor ThermoFisher 4374966
    Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530S
    QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
    Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit ThermoFisher Q33120 
    2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes USA Scientific 1420-2600
    DNA Suspension Buffer Teknova T0221
    Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning PCR-02-L-C
    GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm 100-3415
    HyClone RPMI 1640 media GE Healthcare Life Sciences SH30027.01
    Fetal Bovine Serum, Certified (US) ThermoFisher 16000-044
    Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30-004-CI
    Neocarzinostatin Sigma N9162
    ELIMINase Decon Labs 1101
    SUPERase-In ThermoFisher AM2696
    CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher 11753500
    E. coli DNA Affymetrix 14380 10 MG
    ThermalSeal Sealing Film, Sterile Excel Scientific STR-THER-PLT
    BD FACSAria IIu BD Biosciences
    HyClone Trypsin 0.05% GE Healthcare Life Sciences SH30236.01
    PBS, 1x Corning 21-040-CV
    Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
    Exonuclease I New England BioLabs M0293S
    SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad 172-5210
    96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) Fluidigm BMK-M-96.96
    IFC Controller HX (loading machine) Fluidigm
    BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) Fluidigm
    Real-Time PCR Analysis software  Fluidigm
    MATLAB software MathWorks

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321, (5892), 1081-1084 (2008).
    2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459, (7245), 428-432 (2009).
    3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2, (1), (2006).
    4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
    5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158, (2), 314-326 (2014).
    6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4, (10), e309+ (2006).
    7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8, (1), 75-83 (2014).
    8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11, (5), 806+ (2015).
    9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, (43), 17454-17459 (2012).
    10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167, (1), 523-530 (2004).
    11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2, (4), 272-282 (2016).
    12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36, (2), 147-150 (2004).
    13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9, (10), 749-758 (2009).
    14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (5), 402-412 (2008).
    15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13, (1), 134 (2012).
    16. PCR Technologies: A Technical Guide. Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
    17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
    18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30, (3), 277-289 (2008).
    19. Flow Cytometry: Principles and Applications. Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
    20. Real-time PCR. Taylor & Francis. (2006).
    21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13, (1), 328 (2012).
    22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7, (Suppl 1), (2006).
    23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3, (6), 332-337 (1994).
    24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
    25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
    26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, (10), 877-879 (2008).
    27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9, (7), 743-748 (2012).
    28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10, (11), 1127-1133 (2013).
    Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).More

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter