Summary
Brusk fra stamceller krever finjustering av kulturbetingelsene. Her presenterer vi en magnetisk metode for kondensering av celler, til et viktig skritt initiere bruskdannelse. I tillegg, viser vi at dynamisk modning i en bioreaktor gjelder mekanisk stimulering til de cellulære konstruksjonene og forbedrer brusk ekstracellulær matriksproduksjon.
Abstract
Brusk teknikk er fortsatt en utfordring på grunn av vanskelighetene med å skape en in vitro-funksjonell implantatet lik den opprinnelige vev. En tilnærming har nylig undersøkt for utvikling av autologe erstatninger innebærer differensiering av stamceller til kondrocytter. For å initiere denne bruskdannelse, en komprimeringsgrad av stamceller er nødvendig; derav, demonstrerte vi muligheten for magnetisk kondenserende celler, både innenfor tykke stillaser og stillas for, bruk av minimalimagnetfeltkilder for eksempel base tiltrekkere. Denne magnetiske fremgangsmåte ble også benyttet for å lede aggregat fusjon og for å bygge stillas-fri, organisert, tre-dimensjonale (3D) vev flere millimeter i størrelse. I tillegg til å ha en øket størrelse, det vev som dannes ved en magnetisk drevet fusjon presenterte en signifikant økning i ekspresjonen av kollagen II, og en lignende tendens ble observert for aggrecan ekspresjon. Som det native brusk ble utsatt for krefter that påvirket sin 3D-struktur, dynamisk modning ble også utført. En bioreaktor som gir mekaniske stimuli ble anvendt for å dyrke de magnetisk seeded stillasene i løpet av en periode på 21 dager. Bioreaktor modning i stor grad forbedret brusk inn i cellularized stillasene; den ekstracellulære matriks oppnådd under disse betingelser var rik på kollagen II og aggrecan. Dette arbeid beskriver nyskapende potensial av magnetisk kondensering av merkede stamceller og dynamisk modning i en bioreaktor for forbedret chondrogen differensiering, både uten stillas og innenfor polysakkarid stillaser.
Introduction
Magnetiske nanopartikler er allerede anvendt i klinikken som kontrastmidler for magnetisk resonansavbildning (MRI), og deres terapeutiske anvendelser at utvidelsen. For eksempel har det nylig vært vist at merkede celler kan bli manipulert in vivo ved anvendelse av et eksternt magnetfelt og kan rettes og / eller opprettholdt på et definert sete implantasjonsstedet 1, 2, 3. I regenerativ medisin, kan de brukes til å konstruere organiserte vev in vitro 4, deriblant vaskulære vev 5, 6, 7, 8 ben, brusk og 9.
Artikulær brusk er nedsenket i en avaskulær miljø, noe som gjør reparasjon av ekstracellulære matrikskomponenter meget begrenset når skader oppstår. Av denne grunn, research er for tiden rettet mot konstruksjon av hyalinbrusk erstatninger som kan bli implantert på det defekte område. For å fremstille en autolog erstatning, er noen forskningsgrupper utforsker bruken av autologe kondrocytter som en celle kilde 10, 11, mens andre understreke kapasiteten av stamceller (MSC) til å differensiere til kondrocytter, 12, 13. I tidligere studier rekapitulert her, valgte vi MSC, som deres benmarg prøvetaking er ganske enkel og krever ikke offer av sunne chondrocytes, som risikerer å miste sin fenotype 14.
En tidlig trinn nødvendig for å initiere chondrogen differensiering av stamceller er deres kondensering. Celleaggregater dannes vanligvis ved anvendelse av enten sentrifugering eller Micromass kultur 15; Men disse kondensasjonsprodukter metoder neither presentere potensial til å lage cellegrupper innenfor tykke stillaser og heller ikke mulighet for å styre sammensmelting av aggregater. I denne artikkelen beskriver vi en nyskapende fremgangsmåte for kondensering av stamceller ved å bruke MSC magnetisk merking og magnetisk tiltrekning. Denne teknikken har vist seg å danne stillasfritt 3D konstruksjoner via fusjon av aggregater med hverandre for å oppnå en millimeter skala bruskvevet 9. Magnetisk såing av tykke og store stillaser har også gitt mulighet for å øke størrelsen på den manipulerte vev, å utforme en form som lettere anvendbare for implantering, og en spredning av potensialet for kliniske anvendelser i bruskreparasjon. Her har vi detalj protokollen for den magnetiske såing av MSC til porøse stillas består av naturlige polysakkarider, pullulan, dekstran og, stillaser som tidligere ble brukt for å begrense stamceller 16, 17. Chondrogen differensiering var finally utført i en bioreaktor for å sikre kontinuerlig næringsstoff og gass diffusjon inn i matrikskjernen av stillasene podet med en høy tetthet av celler. Foruten næringsstoffer, chondrogen vekstfaktorer og gass til cellene, bioreaktoren tilbys mekanisk stimulering. Totalt sett er magnetiske teknologien som brukes for å begrense stamceller, kombinert med dynamisk modning i en bioreaktor, kan betydelig forbedre chondrogen differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bygging av magnetiske enheter
MERK: enheter som brukes for celleutsåingen variere avhengig av anvendelsen (figur 1). For å danne aggregater, er antallet av celler er begrenset til 2,5 x 10 5 / aggregat, slik at de magnetiske tips må være meget tynn (750 um i diameter). Til frø av 1.8 cm 2/7 mm-tykk stillasene, må magnetene være større (3 mm i diameter), og vil sørge for cellevandring gjennom porene i stillaset.
- Konstruksjon av en anordning med mikro magneter for aggregatdannelse (figur 1A)
- Gjøre mikrohull med et 0,8 mm bor gjennom aluminiumplater (3 cm i diameter og 6 mm tykke).
- Sett en magnetisk spiss (750 mikrometer i diameter) inn i hvert hull i platen.
- Plasser denne skive over en permanentmagnet neodymium, som sørger for magnetiseringen til metning.
- Konstruksjon av en innretning for stillas seeding (
- Skjær hardt polystyren inn 2,4 cm 2 firkanter.
- Sett 9 små magneter (3 mm i diameter, 6 mm long) med lik avstand over et overflateareal på 1,6 cm2.
- Plasser denne enheten via en permanent neodymium magnet.
2. Stem Cell Merking
MERK: stamceller ble merket med 0,1 mM magnetiske nanopartikler i 30 minutter (2,6 ± 0,2 pg jern / celle) for å danne aggregater, mens de ble merket med 0,2 mm magnetiske nanopartikler i 30 minutter (5 ± 0,4 pg jern / celle) i frø stillaser. Disse nanopartikkelkonsentrasjoner og inkubasjonstider har vært brukt tidligere og publisert for MSC og andre celler 18, 19, og det er blitt bestemt at nanopartikler påvirket hverken av cellenes levedyktighet eller MSC differensiering kapasitet. Den jernmasse inkorporert ved stamcellene ble målt via single-cell magnetophoresis 19, 20.
- Kultur Humane stamceller (MSC) i fullstendig mesenchymal stamcelle vekstmedium (MSCGM) ved 37 ° C og 5% CO2 inntil nær til konfluens (~ 90%).
- Fremstill den magnetiske merking av oppløsningen ved å blande 0,1 eller 0,2 mM maghemitt citrat-belagt jernoksyd (γFe 2 O 3 kjerne: 8 nm diameter) i serumfritt McCoy 5A medium modifisert i Roswell Park Memorial Institute (RMPI) uten glutamin og inneholdende 5 mM natriumcitrat.
- Kast det medium, skylles cellene med serumfritt RPMI-medium uten glutamin, og tilsett 10 ml av jernoksyd nanopartikkeloppløsning pr 150 cm2 kulturflaske, det minste volum som kreves for å dekke alle cellene.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2 og deretter forkaste nanopartikkeloppløsning. Skyll i 5 minutter med serumfritt RPMI-medium uten glutamin for å internalisere nanoparticles fremdeles er festet til plasmamembranen.
- Kast RPMI-medium og tilsett 25 ml komplett medium MSCGM per kolbe. Inkuber over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
3. Magnetic Celleutsåing
- Tilbereder den chondrogen medium ved hjelp av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med høy glukose med L-glutamin ved tilsetning av 50 pm L-askorbinsyre 2-fosfat, 0,1 uM deksametason, 1 mM natriumpyruvat, 0,35 mM L-prolin, 1% universell kultur supplement inneholdende insulin, humant transferrin og selensyre (ITS-forblanding), og 10 ng / ml transformerende vekstfaktor-beta 3 (TGF-β3).
- Løsne de magnetiske celler ved anvendelse av 8 ml av 0,05% trypsin-EDTA pr 150 cm2 kulturflaske og sentrifuger de dissosierte cellene ved 260 x g i 5 min. Aspirere mediet og telle de re-suspenderes celler.
- Plasser en glassbunn-cellekulturpetriskål (35 mm) på toppen av begge magnetiske enheter.
- å magnetically danner aggregater, tilsett 3 ml chondrogen medium til petriskålen, og forsiktig avsette det minste volum mulig (ikke mer enn 8 mL) inneholdende 2,5 x 10 5 merkede celler per aggregat (opp til 16 aggregater kan avsettes). La petriskål i 20-30 minutter uten å flytte den, slik at det for dannelse av sfæroider, og deretter sette hele enheten, inkludert petriskålen som inneholder de 16 aggregatene, inn i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Form kontroll aggregater å følge den samme fremgangsmåte og erstatte det komplette medium med chondrogen medium uten TGF-β3.
- For å generere den 3D-aggregat konstruksjonen, å plassere 2 aggregater i kontakt på dag 8 for å danne 8 dubletter og initiere fusjon. På dag 11, fusjonere 2 dubletter for å danne 4 quadruplets. Til slutt, smelte de 4 quadruplets på dag 15 for å oppnå den endelige struktur.
- På samme tid, danner aggregater ved sentrifugering av 2,5 x 10 5 merket stamceller ved 26015; g i 5 min i 15-ml rør med 1,5 ml chondrogen medium med eller uten TGF-β3 (for prøve og kontroll, respektivt).
- Slik magnetisk frø stillas, plassere hver tørket stillas i en petriskål. Bruk polysakkarid porøse stillasene er laget av pullulan / dekstran 21. For hvert stillas, fortynn 2 x 10 6 merkede stamceller i 350 mL av chondrogen medium uten TGF-β3 og nøye pipette av cellene på stillaset.
- Inkuber i 5 min ved 37 ° C for å tillate full penetrasjon inn i cellene i stillaset, og deretter tilsett 3 ml chondrogen medium med eller uten TGF-β3 (for prøve eller kontroll, respektivt) til Petri-skålen.
- Inkuber cellularized stillaset på sin magnetiske innretning ved 37 ° C og 5% CO2 i 4 dager for å tillate cellemigrering gjennom stillaset porene og innesperring.
- På samme tid, frø stillaser med 2 x 10 6
4. Differensiering til chondrocytter
MERK: Etter 4 dagers inkubering, fjernes magnetene og fortsette chondrogen modning enten i en petriskål (statiske betingelser) eller i en bioreaktor (dynamiske betingelser). Negative kontrollprøver er modnet i statiske betingelser med chondrogen medium uten TGF-β3.
- I statiske betingelser, holde cellularized stillas eller aggregater i samme petriskål. Endre chondrogen medium to ganger i uken i 21 dager.
- I dynamiske forhold, forberede bioreaktoren.
- Skjær-silikonledningen ved den passende lengde i henhold til produsentens protokoll.
- Autoklav alle materialer: 500 ml kultur kammer, rør, to-veis torer, og bur.
- Plasser bioreaktor deler i en steril Microbiologisk sikkerhet stasjon. Koble slangen til de to-veis rotatorer og til kulturen kammeret ved å følge produsentens instruksjoner.
- overføre forsiktig cellularized stillasene i steriliserte bur ved hjelp av en steril spatel. Legg 2 stillaser per bur. Når burene er ferdig, setter dem inn i nålene i lokket for å holde dem i å bevege seg under den videre rotasjon. Fylle dyrkningskammeret med chondrogen medium og lukke den med lokket som inneholder merdene.
- Slå på den peristaltiske pumpe for å fylle røret med chondrogen medium og for å eliminere luftbobler.
- Plassere og feste det fylte kammeret inn i motoren i bioreaktoren og slår på en datamaskin, som styrer de rotasjoner både av armen og i kammeret.
- Anvende en rotasjonshastighet på 5 omdreininger pr minutt (rpm) på både arm og kammeret. Juster den peristaltiske pumpe ved en strømningshastighet på 10 opm for kontinuerlig mating av de cellularized stillasene.
MERK: Forut for RNA-ekstraksjon, fordøye stillasene med en enzymatisk oppløsning.
- Forbered 1 ml av enzymløsningen ved å tilsette 100 ul av pullulanase (40 U / ml) og 50 pl av dextranase (60 mg / ml) til 850 ml serumfritt DMEM-medium.
- Skyll stillasene to ganger med serumfritt DMEM-medium, kast medium, og tilsett 800 ul av den enzymatiske oppløsning pr stillaset. Inkuber i 15-30 min ved 37 ° C under forsiktig omrøring.
- Når stillaset er fullstendig oppløst, overføres oppløsningen som inneholder cellene til en 1,5 mL rør, sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter, forsiktig oppsuging medium, skylles to ganger med steril 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS), sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter, og re-suspendere cellene i RNA-isolering løsning.
- For å ekstrahere RNA fra aggregatene, plasserer sfæroidene i RNA isolasjon og løsningenfullstendig knuse dem ved hjelp av en homogenisator før utfører RNA-ekstraksjon.
- Isolere RNA ved anvendelse av et kit for total RNA-ekstrahering i henhold til produsentens instruksjoner.
- Syntetisere komplementært DNA fra 400 ng total-RNA ved anvendelse av revers transkriptase i henhold til produsentens instruksjoner ved anvendelse av 250 ng tilfeldige primere, 1 ul dNTP-blanding (10 mM hver), og 40 U / ml RNase-inhibitor; det endelige volum av reaksjonen er 20 pl. Ved slutten av reaksjonen, tilsett 80 ul destillert vann for å oppnå et sluttvolum på 100 ul.
- For kvantitativ polymerasekjedereaksjon (PCR) ved å bruke en PCR-blanding som inneholder et fluoriserende reagens for å kvantifisere den relative ekspresjon av gener som er av interesse, for eksempel aggrecan (AGC) og kollagen-II (Kol II), med 10 x fortynnet cDNA. Normalisere nivået av genekspresjon med referanse genet ribosomalt protein, Large, P0 (RPLP0). Utføre beregninger med 2 - ΔΔCT formel, Hvor ΔΔCT = ΔCT av differensiert tilstand - bety ΔCT av kontroll tilstand, og hver ΔCT representerer CT av genet av interesse - CT av referanse genet (RPLP0).
- Bestemme statistiske målinger som gjennomsnittsverdier ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Utføre analysen med n ≥ 2 uavhengige eksperimenter. Bruke Students t-test for å analysere de statistiske forskjeller mellom sentrifugert pellets og magnetiske fusjoner (* p <0,05). Bestem betydning med Kruskal-Wallis-test (enveis ANOVA-parametriske) for å analysere statistiske forskjeller mellom differensierte stillaser og med styre stillaset (* p <0,05).
6. histologisk analyse
- Skyll cellularized stillas eller aggregater med steril 1 x PBS, feste dem i 10% formalinløsning i 1 time ved romtemperatur, og skyll med 1 x PBS.
- Fjern PBS, legge prøvene i optimal Cutting temperatur forbindelse (OCT), og fryse dem i et bad isopentan nedsenket i flytende nitrogen. Oppbevar prøven ved -20 ° C. Skjær prøvene med en kryostat for å oppnå 8-um frysesnitt for aggregater eller 12-um for cellularized stillas.
- Flekk frysesnitt med 0,5% toluidinblått løsning i 2 minutter, skylles i vann fra springen, dehydrere med 100% etanol, klargjøre anvendelse av toluen, og montere glir med et monteringsmedium for lysmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For det første kan aggregater hver for seg dannes ved bruk av mikro-magneter ved å avsette 2,5 x 10 5 merkede stamceller (figur 2A). Disse enkeltaggregater (~ 0,8 mm i størrelse) kan deretter bli smeltet sammen til større strukturer, takket være sekvensielle, magnetisk indusert fusjon. For eksempel, på dag 8 av chondrogen modning ble aggregater anbringes i kontakt i par for å danne dubletter; quadruplets ble samlet på dag 11 ved å flette 2 dubletter; og endelig, på dag 15, 4 quadruplets ble smeltet sammen for å danne en 3D-konstruksjon inneholdende 16 av de initialt dannede aggregater, med et totalt 4 x 10 6 celler (ca. 4 mm i størrelse) (figur 2B). For det andre har den samme magnetiske tiltreknings teknikk blitt brukt til å danne celleaggregater i løpet av stillaser. Stillasene ble sådd ut i løpet av den magnetiske innretning og viste tett kondensert celler inne i porene av stillaset, ved eksakt mikro-magnet steder (figur 2C). Ved sammenligning, når cellene ble sådd ut i løpet av et stillas uten magnetisk tiltrekning (passiv seeding), ble de funnet å være jevnt fordelt. Cellularized stillasene ble så satt inn i bur (figur 3A) som er festet til bioreaktoren kammeret for å utføre den chondrogen prosessen under dynamiske modningsbetingelser (figur 3B). En slik bioreaktor forbedrer nærings og gassutveksling og gir mekanisk stimulering ved transduksjon. Rotasjonshastigheten av både armen og kammeret ble justert til 5 rpm, som anbefalt av konstruktøren for myke 3D vevsregenerering. En peristaltisk pumpe som gir en kontinuerlig tilførsel av medium ble satt til 10 opm.
For alle betingelser for celle organisasjon (sammensmeltede aggregater og poding innenfor stillaser) og vev modning (innenfor eller uten en bioreaktor), ble genekspresjon analysert på dag 25. Den vev som dannes ved en magnetisk fusjon viste en signifikantficant økning av kollagen II-ekspresjon sammenlignet med pelleten oppnådd ved sentrifugering (figur 4A), sammen med en øket tendens av aggrecan uttrykk. For cellularized stillas, erholdt vi en økning av aggrekan og kollagen II ekspresjon signifikant for kollagen II-da magnet utsåing ble anvendt, sammenlignet med stillasene sådd uten magnetiske krefter. I tillegg, ekspresjon av begge genene var mye høyere (signifikant for Col II) når magnet poding ble kombinert med dynamisk differensiering (figur 4B).
Histologiske analyser ble også utført, for eksempel ved hjelp av en toluidin blå flekk for å avdekke de glykosaminoglykaner (GAG). Den sekvensielle magnetiske sammensmelting av 16 aggregater viste rikelig avsetning av GAG slik det ble påvist ved den blå-purpur farge (figur 5A). For stillasene, bare de magnetisk seeded ble farget med toluidinblått. GAG Content var høyere når stillasene ble differensiert i en bioreaktor (figur 5B) i stedet for statisk (figur 5C). Tatt sammen demonstrerer disse resultatene potensialet av magnetisk aggregering og magnetisk såing innenfor stillasene for å forbedre bruskdannelse. Det indikerer også at de dynamiske modningsbetingelser innen bioreaktoren er langt mer gunstig for effektiv differensiering.
Figur 1. Konstruksjon av de magnetiske innretningene. (A) Eksempel på en magnetisk innretning for aggregatdannelse: aluminiumplate ble boret (0,8 ^ m diameter hull) og tips ble innsatt i hvert hull, og deretter plassert på en permanent neodym-magnet, som sørget for magnetiseringen til metning. (B) Magnetisk innretning til frø stillaset: hard polystyren (24 mm 2) med 9 manuelt laget hull varplassert på en permanent neodym-magnet, som sørget for magnetiseringen til metning. Små magneter (3 mm i diameter) ble deretter satt inn i hvert hull for å danne enheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Magnetisk merking av stamceller og såing. (A) Stamceller ble merket med jernoksid nanopartikler i 30 minutter ved 37 ° C. (B) Sfæroider ble dannet fra merkede celler tiltrukket av et nettverk av 16 mikromagneter. Aggregatene ble slått sammen til quadruplets på dag 11 etter fusjon av dubletter dannede 3 dager før. De quadruplets ble deretter sammensmeltet på dag 15 for å konstruere den endelige konstruksjons vev. (C) Et stillas som er lagt inn i en glass-bunn fatet, ble podet med eller utenut magnetiske krefter. På dag 4, ble flekker av kompakterte stamceller observert i den magnetisk seeded stillaset, mens syntes cellene å være jevnt fordelt i stillaset podet uten en magnet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Dynamisk modning av cellularized stillaser. (A) Når magnetisk eller passiv utsåing, ble cellularized stillaser satt i bur for å unngå forstyrrelser. (B) merder, fikserte ved hjelp av nåler av hetten, ble plassert i karet i bioreaktor fylt med chondrogen medium. Bioreaktoren påføres biaksial rotasjon med en uavhengig styrt hastighet (1-12 rpm og 1-35 rpm for armen og kammeret, henholdsvis). En peristaltisk pumpe som kontinuerlig tilgjengelig medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Ekspresjon av spesifikke chondrogen gener på dag 25. (A) Det magnetisk induserte sammensmelting av MSC sfæroider viste en signifikant økning i kollagen II sammenlignet med den pellet som dannes ved sentrifugering. * Angir en statistisk forskjell ved anvendelse av Students t-test (p-verdi <0,05). (B) Ekspresjon av aggrekan og kollagen II var tydelig øket i stillaser differensiert med en kombinasjon av magnetisk såing og dynamisk modning i en bioreaktor. Genekspresjon ble normalisert til RPLP0 mRNA og uttrykt i vilkårlige enheter i forhold til kontroll (~ 1 ± SEM). Resultatene er presentert som middelverdier ± SEM av to til fire uavhengige forsøk. * DenoTES en statistisk forskjell med Kruskal-Wallis-test (enveis ANOVA-parametrisk test) (p-verdi <0,05). (-): poding uten magnet; (+): Poding med magnetiske krefter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Histologisk farging av glykosaminoglykaner på dag 25. glykosaminoglykan (GAG) innskudd er dokumentert av blå-purpur farge. (A) En positiv toluidin blå flekk ble observert i 8-um frysesnitt av det endelige bruskstrukturen erholdt fra den sekvenssammensmelting av 16 aggregater. De 12-um frysesnitt av stillasene magnetisk utsådd etter statisk (B) eller dynamisk (C) betingelser viste klartat GAG innholdet var høyere i stillas differensiert i en bioreaktor. Piler indikerer aggregater av differensierte celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Først fordi de teknikkene som presenteres her er avhengige av internalisering av magnetiske nanopartikler, er en viktig sak utfallet av nanopartikler når de lokaliseres inne i cellene. Det er sant at jern nanopartikler kan utløse potensiell toksisitet, eller nedsatt differensieringskapasitet, avhengig av deres størrelse, belegg, og tiden for eksponering 19, 22. Imidlertid har flere studier vist noen effekt på cellulær fysiologi når innkapslede jernnanopartikler ble anvendt 23 i form av magnetoferritin, en biologisk magnetiske nanopartikler 24, eller anvendt med en enkel citrat belegg og tilstrekkelige konsentrasjoner 18. I tillegg, når jernoxydpartikler nanopartikler ble benyttet i tilsvarende forhold som de som er beskrevet i dette papir (med MSC og for brusk), vi nylig vist at en rask og nesten total nedbrytning av nanoparticles skjer innen endosomene i ca 10 dager etter cellulær inkorporering og MSC sfæroide dannelse. Interessant nok ble dette massiv nedbrytning forbundet med effektiv lagring av fritt jern i ferritin protein og resulterte i en meget liten grad den cellulære jernmetabolismen, boding for fremtidige kliniske anvendelser 25.
Et annet kritisk punkt er kravet til cellen komprimering for å initiere bruskdannelse. Vanligvis blir kondensasjon av cellene oppnådd ved sentrifugering; imidlertid er denne metoden begrenset av et lavt antall celler (ikke mer enn 2,5 x 10 5 celler). Forbi dette tall, kan de næringsstoffer og gass ikke diffunderer til midten av aggregatene, utløser cellenekrose. Her vises den magnetiske kondensering av merkede stamceller til aggregater som en betydelig metode for å danne 3D konstruksjoner for bruskvev regenerering. En slik magnetisk prosedyre har blitt brukt av andre forfattere tilbygge 3D-sfæroider: av magnetisk levitasjon med en magnet er plassert på toppen av platen etter dissosiasjon av celler 23 eller med jern pinner for å lokalisere det magnetiske felt 26. Imidlertid ikke magnetisk levitasjon ikke ut til å være egnet for videre trinn aggregatsammensmelting. I motsetning til dette, sammen med det magnetiske metoden foreslått her, kan vi kontrollere alle fusjonstrinn for å oppnå en trinn-for-trinn bruskvev konstruksjon. I korte trekk, starter denne flertrinnsprosess med innesperring av stamceller inn i samlebyggesteiner og er etterfulgt av sammensmelting av disse blokker i en større struktur. De kritiske trinn av denne stillas for stamcelle aggregering prosedyre er følgende: For det første må man danne hvert aggregat med så lite volum av celler som mulig og for det andre, må man kontrollere fusjonstrinn for å unngå dannelse av en enkelt, stor aggregat. Den oppnådde her vev var rik på kollagen II og aggrecan. Det presenteres også den advantages ved å ha fleksibel geometri og størrelse og av å være uten stillas.
Den magnetiske metode ble også anvendt for å lede stamceller innenfor tykke og store stillaser; et annet alternativ for utforming av ulike former og størrelser. Det kritiske trinnet er å seede stillasene med et passende volum av celler: hverken er for lite til å ha en samlet homogen fordeling av cellene, og heller ikke for mye for å unngå en hvilken som helst celle tap. Magnetiske krefter har tidligere blitt brukt til å tiltrekke og holde cellene i stillasene, og for å forbedre celleutsåingen 27, 28. Her tilstrekkelig celle kondens i porene i polysakkarid stillasene førte til vellykket brusk. Ekstracellulær matriksproduksjon ble betydelig forbedret når de magnetisk cellularized stillasene ble utsatt for transduksjon / skjærspennings stimuli gitt av bioreaktoren, takket være sin bi-aksial rotasjon. Det har vært vist i andre studier som multi-aksiale belastningsforhold forbedret kvaliteten av vev er dannet fra kondrocytter 29. Dette nye konsept bioreaktor presenterer en ekte vinning i forhold til de eksisterende teknikker, hvor kun trykkrefter påføres 30, 31, 32.
Som konklusjon, etter chondrogen differensiering, bruk av magnetiske oppdemningsapparat av merkede stamceller for å danne og manipulere aggregater, så vel som for å pode stillaser tillatt for etablering av millimeterstørrelse brusk cellulære konstruksjoner. I tillegg, ved å kombinere magnetisk celleutsåingen med dynamisk differensiering tilveiebringer en ny og verdifull verktøy for regenerativ medisin anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne QuinXell Technologies og CellD, særlig Lothar Grannemann og Dominique Ghozlan for deres hjelp med bioreaktor. Vi takker Catherine Le Visage, som ga oss med pullulan / dekstran polysakkarid stillaser. Dette arbeidet ble støttet av EU (ERC-2014-Cog prosjekt Matisse 648 779) og ved AgenceNationalede la Recherche (ANR), Frankrike (MagStem prosjekt ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
