Summary
从干细胞软骨需要微调的培养条件。在这里，我们提出了冷凝细胞磁性的方法，一个必不可少的步骤启动软骨。此外，我们显示，在生物反应器中动态成熟施加机械刺激，以在蜂窝结构和增强软骨细胞外基质的产生。
Abstract
软骨工程仍因创建类似于天然组织的体外功能植入物的困难挑战。最近探讨自体替代发展的方法涉及干细胞分化为软骨细胞。要启动这个软骨，一定程度的干细胞需要的压实;因此，我们证实磁冷凝细胞的可行性，既厚支架和自由脚手架内，使用小型化的磁场源如细胞吸引子。这种磁性方法也被用来引导聚集融合，打造脚手架免费的，有组织的，三维（3D）的大小组织中几毫米。除了具有增强的大小，通过磁性驱动的融合形成的组织示于胶原II的表达的增加显著，观察聚集蛋白聚糖表达有类似的趋势。作为天然软骨进行力吨帽子影响了它的三维结构，还进行动态成熟。提供机械刺激的生物反应器被用来培养磁接种的支架在21天的期间。生物反应器的成熟大大改善软骨进入细胞化的支架;这些条件下得到的细胞外基质是富含胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖。这项工作概述在生物反应器用于改善软骨细胞分化，这两种支架和无内多糖支架标记的干细胞的磁性缩合和动态成熟的创新潜力。
Introduction
磁性纳米粒子在临床上用于磁共振成像（MRI）造影剂已经使用，其治疗应用不断扩大。例如，最近已经显示，标记的细胞可在体内使用的外部磁场在限定的注入1，2，3的部位和操作可被引导和/或保持。在再生医学中，它们可以被用于工程体外 4有组织的组织，包括血管组织5，6，7，8的骨和软骨9。
关节软骨浸渍在无血管的环境中，会发生损坏时使细胞外基质组分的维修非常有限。出于这个原因，researc目前h的重点，可以在缺损部位植入透明软骨替换的工程。为了生产自体替换，一些研究小组正在探索使用自体软骨细胞作为细胞源10，11的，而另一些强调间充质干细胞（MSC）分化成软骨细胞12，13的能力。在这里重现以前的研究中，我们选择MSC，因为他们的骨髓采样是相当简单，并不需要健康的软骨细胞，它可能失去其表型14的牺牲。
早期的步骤启动干细胞的软骨细胞分化的实质是他们的凝结。细胞聚集体使用的是离心或微团培养15共同形成;然而，这些冷凝方法neitheR有创建厚支架也不以控制聚集体的融合潜能内细胞团的潜力。在本文中，我们描述了一个创新的方法，利用冷凝MSC磁性标记和磁引力干细胞。该技术已被证明是形成通过聚集体的融合彼此自由支架-3D构建体，以获得毫米级软骨组织9。厚和大的脚手架磁种也让增加工程化组织的大小，用于植入更容易设计的形状是有用的，多样化用于软骨修复的临床应用的潜力的可能性。在这里，我们详细地对MSC的磁播种到天然多糖，支链淀粉，和葡聚糖组成的多孔支架的协议，先前使用的支架，以限制干细胞16,17。软骨分化finallÝ在生物反应器进行，以确保连续的营养物和气体扩散与细胞的高密度接种的支架的基质芯。除了提供营养物，软骨的生长因子，以及气体到细胞中，所述生物反应器提供机械刺激。总体而言，用于限制干细胞的磁性的技术，以在生物反应器的动态熟化组合，可以显着地改善软骨形成分化。
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Protocol
1.磁性设备的建设
注意：用于细胞接种的装置取决于应用（ 图1）。形成聚集体，细胞的数量被限制在2.5×10 5 /聚集体，所以磁性尖端必须非常薄（750微米直径）。种子的1.8厘米七分之二毫米厚的支架，磁体必须更大（直径3mm），并确保通过支架的孔中的细胞迁移。
- 与微磁体为聚集体形成的装置的结构（ 图1A）
- 使通过铝板0.8毫米钻微孔（直径3厘米和6毫米厚）。
- 插入一个磁性尖端（750微米直径）插入所述板的每个孔中。
- 将这个盘在永久钕磁铁，保证磁化饱和。
- 设备的施工脚手架播种（
- 切割硬聚苯乙烯成2.4厘米2米的正方形。
- 在相等的距离超过1.6 cm 2的表面积插入9个小磁铁（直径3mm，长6毫米）。
- 将这个装置在永久钕磁铁。
2.干细胞标记
注：干细胞用0.1mM的磁性纳米粒子进行标记30分钟（2.6±0.2皮克铁/细胞）以形成聚集体，当他们用0.2mM的磁性纳米颗粒标记30分钟（5±0.4皮克铁/细胞）接种支架。这些纳米颗粒的浓度和温育时间先前已经使用并发表了MSC和其它细胞18， 图19，和它已经确定的是纳米颗粒既不影响细胞生存力，也不MSC分化能力。由干细胞掺入的铁物料经由单CE测定LL磁19，20。
- 培养人间充质干细胞（MSC）在完整的间充质干细胞生长培养基（MSCGM），在37℃和5％CO 2，直至接近至汇合（〜90％）。
- 无谷氨酰胺在的Roswell Park Memorial研究所（RMPI）改性的无血清的McCoy's5A培养基和含有5：;由0.1或0.2mM的磁赤铁矿柠檬酸被覆铁氧化物（8nm的直径的芯γFe2 O 3）混合制备磁性标记溶液mM柠檬酸钠。
- 弃去培养基，用清洗无血清的RPMI培养基中的细胞没有谷氨酰胺，并添加10毫升每150-cm 2的培养瓶中，以覆盖所有细胞所需的最小体积的氧化铁纳米颗粒溶液。
- 孵育在37℃下30分钟和5％CO 2，然后丢弃该纳米颗粒溶液。冲洗5分钟用无血清的RPMI培养基中，而不谷氨酰胺内化楠oparticles仍然附着至质膜。
- 丢弃该RPMI培养基并添加25毫升每烧瓶完整MSCGM培养基。在37℃下孵育过夜，5％的CO 2。
3.磁性细胞种植
- 新鲜加入50μML-抗坏血酸-2-磷酸，0.1μM地塞米松，1mM丙酮酸钠，0.35毫摩尔L-脯氨酸，1％万向培养制备使用Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖L-谷氨酰胺的软骨形成培养基补充含有胰岛素，人转铁蛋白和硒酸（ITS-预混料），和10ng / mL的转化生长因子-β3（TGF-β3）。
- 分离使用每150-cm 2的培养瓶中0.05％胰蛋白酶-EDTA和离心机的8毫升的解离的细胞的磁性细胞在260×g下5分钟。吸出介质并计数的重新悬浮的细胞。
- 放置在两磁性设备的顶部玻璃底细胞培养的培养皿（35毫米）。
- 到magnetically形成聚集体，加入3毫升软骨形成培养基到培养皿中，并轻轻地沉积含2.5×10 5个标记的细胞每个聚集体（最多16个聚集体可以被沉积）的最小体积可能的（不超过8微升）。离开培养皿20-30分钟而不移动它，允许它以形成球状体，然后将完整的设备，包括含有16个聚集体的培养皿，放入培养箱中在37℃和5％CO 2。
- 以下形式控制聚集体相同的协议和与没有TGF-β3软骨形成培养基替换完全培养基。
- 为了产生3D聚集体构建体，放置2点聚集在第8天接触，以形成8个双峰并启动所述融合。第11天，合并2个双峰形成4四胞胎。最后，融合在第15天的4四胞胎，得到最终的结构。
- 与此同时，通过离心分离2.5×10 5形成聚集体标记的干细胞在26015; （分别为样品和对照）克在15-mL管5分钟用1.5mL有或没有TGF-β3软骨形成培养基的。
- 以磁性种子支架，将每个干燥支架到培养皿。使用由支链淀粉/葡聚糖21的多糖多孔支架。对于每一个支架，在稀软骨形成培养基的350微升2×10 6标记的干细胞而不TGF-β3和小心移液管将细胞在支架上。
- 孵育5分钟，在37℃，以允许在支架内充满细胞穿透，然后轻轻地用或不用TGF-β3（分别用于样品或对照）的培养皿中添加软骨形成培养基的3毫升。
- 孵育其磁性装置上的细胞化的支架在37℃和5％CO 2 4天，以允许通过所述支架的孔和禁闭细胞迁移。
- 与此同时，种子支架与2×10 6
4.分化为软骨细胞
注：温育后的第4天，除去磁体并继续成熟软骨或者在皮氏培养皿（静态条件）或在生物反应器（动态条件）。阴性对照样品的成熟与无TGF-β3软骨中静态条件。
- 在静态条件下，保持在同一个培养皿中的细胞化的支架或聚集体。一个星期更改软骨中两次21天。
- 在动态条件下，制备的生物反应器。
- 根据制造商的方案在适当的长度切断硅树脂管。
- 高压灭菌的所有材料：500mL的培养室，管道，2路旋转器，和笼子。
- 生物反应器部件放入无菌就微生物逻辑安全站。管道连接到2路旋转器和培养室按照制造商的说明。
- 小心地将细胞化的支架转移到使用无菌刮刀消毒的笼子。将每笼2个支架。当笼子里准备好了，将它们插入到盖的针，让他们进一步旋转过程中移动。填充软骨形成培养基的培养室，用含有笼中的盖子关闭。
- 打开蠕动泵，以填补软骨中的管道和消除气泡。
- 放置和填充室固定到所述生物反应器的马达和打开计算机，其控制所述臂的与所述腔室的旋转上。
- 在臂和腔室都应用每分钟5转数（RPM）的转速。调整以10rpm的流速为细胞化支架的连续进给的蠕动泵。
注意：在此之前RNA提取，消化支架与酶溶液。
- 通过添加100μL的支链淀粉酶（40U / mL）和葡聚糖酶的50微升（60毫克/毫升），以850毫升的无血清DMEM培养基中制备1毫升的酶溶液。
- 用无血清的DMEM培养基冲洗两次支架，弃去培养基，并加入每支架的酶溶液的800μL。孵育在37℃下轻柔搅拌15-30分钟。
- 当支架被完全溶解，转移在300×g下将含有细胞的1.5毫升管中的溶液，离心10分钟，小心地吸出培养基，用无菌1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），离心机在冲洗两次300×g的10分钟，并重新悬浮在RNA分离溶液中的细胞。
- 取出从聚集体RNA，将球状体中的RNA分离溶液和执行RNA提取之前用均化器粉碎完全它们。
- 隔离根据制造商的说明使用试剂盒提取总RNA的RNA。
- 根据制造商的说明从使用逆转录酶400纳克的总RNA合成互补DNA，使用250纳克随机引物，1微升dNTP混合物（每种10mM），和40U / ml RNA酶抑制剂;反应的最终体积为20μL。在反应结束时，加入80μL的蒸馏水中，得到100微升的最终体积。
- 对于定量聚合酶链式反应（PCR），使用含有荧光试剂的PCR混合物中定量的感兴趣的基因，如聚集蛋白聚糖（AGC）和胶原II（山口II）的相对表达，用10×稀释的cDNA。标准化基因的表达水平与参考基因核糖体蛋白，大的，P0（RPLP0）。 ΔΔCT式-与2执行计算其中ΔΔCT=ΔCT的分化的条件 - 平均ΔCT的控制条件，并且每个ΔCT代表感兴趣的基因的CT - 参照基因（RPLP0）的CT。
- 确定为平均值±平均值（SEM）的标准误差的统计测量。执行用正≥2个独立实验的分析。使用学生t检验来分析离心颗粒和磁性融合体（* P <0.05）之间的统计学差异。确定与Kruskal-Wallis检验（单向ANOVA非参数）的意义进行分析有区别的支架控制支架之间并具有统计学差异（* P <0.05）。
6.组织学分析
- 冲洗细胞化的支架或聚集体，用无菌1×PBS，修复它们在10％福尔马林溶液，在室温下1个小时，并用1×PBS冲洗。
- 除去PBS，在最佳cuttin嵌入样品克温度化合物（OCT），并且在异戊烷浴浸入液氮中冷冻。存储在-20℃下的样品。用低温恒温器以获得所述聚集体或12微米的细胞化的支架8微米冷冻切片切割样品。
- 染色用0.5％甲苯胺蓝溶液的冰冻切片2分钟，漂洗在自来水中，用100％乙醇脱水，澄清使用甲苯，并与用于光学显微镜的安装介质装入滑动。
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Representative Results
首先，聚集体可以单独使用微磁体通过沉积2.5×10 5个标记的干细胞（ 图2A）形成的。这些单个聚集体（〜大小0.8毫米）然后可融合成由于连续的，磁感应融合较大的结构。例如，在成熟软骨的第8天，聚集体放置在对以形成双联体接触;四胞胎通过合并2个双重峰组装在第11天;最后，在第15天，将4四胞胎融合以形成包含最初形成的聚集体16的3D构建体，总4×10 6个细胞（约4毫米大小）（ 图2B）的。第二，相同的磁吸引力的技术已被用来形成支架内的细胞聚集体。支架接种在磁性设备和显示出稠密冷凝细胞支架的孔隙内，在确切的微磁体的位置（ 图2C）。与此相反，当细胞没有磁吸引力（被动接种）的支架内接种，发现它们被均匀地分布。然后细胞化的支架插入到安装于生物反应器室动态熟化条件下（ 图3B）下进行的软骨形成过程笼（ 图3A）。这样的生物反应器提高了营养物和气体交换以及通过转导提供机械刺激。臂和两个腔室的旋转速度调节至5转，所推荐的构造为软三维组织再生。提供介质的连续供给蠕动泵的速度设定在10rpm。
对于细胞组织的全部条件（稠合的聚集体和支架内接种）和组织成熟（在或不在生物反应器），第25天，分析基因表达通过磁聚变形成的组织表现出了显在Ⅱ型胶原表达着性增加相比，通过离心（ 图4A）中获得的粒料，与聚集蛋白聚糖表达的增加的趋势一起。对于细胞化的支架，我们获得了在增加的聚集蛋白聚糖和胶原II-II时，使用表达式显著胶原磁性播种，相比于支架接种无磁力。此外，这两个基因的表达要高得多（对于山口II显著）当磁种用动态分化（ 图4B）相结合。
组织学分析使用一甲苯胺蓝染色以显示糖胺聚糖（GAG）也执行，例如。的16个聚集体的连续磁聚变表现出GAG的丰富沉积，通过蓝-紫色（ 图5A）作为明证。对于支架，只有那些磁接种甲苯胺蓝染色。 GAG conten吨较高时，支架在生物反应器（ 图5B），而不是静态地（ 图5C）分化。总之，这些结果表明支架内的磁性聚集和磁种的潜力，以提高软骨。这也表明，在生物反应器内的动态成熟的条件是有效的差异化更为有利。
图1结构的磁器件。 （A），用于形成聚集体的磁性装置的实施例：将铝板钻（0.8直径微米孔）和提示插入在每个孔中，然后放置在永久钕磁铁，保证磁化饱和。 （B）磁性设备种子支架：硬聚苯乙烯（24 平方毫米），用9个手动进行孔是放置在永久钕磁铁，保证磁化饱和。然后小磁铁（直径3mm）插入每孔以形成装置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.干细胞和接种的磁性标记。 （A）干细胞与铁氧化物纳米颗粒进行标记30分钟，在37℃。 （B）球状体由16个微磁体网络吸引标记的细胞形成的。聚集体是由前3天形成的双峰的融合合并成四胞胎在第11天。然后，四胞胎被融合在第15天，以构成最终的工程化组织。 （C）的支架，放入玻璃底培养皿，用或接种出磁力。在第4天，在磁接种的支架中观察到压实的干细胞的斑点，而细胞出现均匀分布在无磁体接种的支架。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.细胞化支架的动态成熟。 （A）磁或被动接种后，细胞化的支架投入笼中，以避免干扰。 （B）笼，使用帽的针固定，放入充满了软骨形成培养基的生物反应器的容器中。所述生物反应器应用于双轴旋转被独立控制的速度（1-12转和1-35的转速分别臂和腔室）。蠕动泵连续提供中介嗯。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4的第25天特定软骨基因的表达（A）MSC的球状体的磁感应融合显示在II型胶原一个显著相比，增加通过离心形成沉淀。 *表示使用学生t检验（p值<0.05）统计学差异。 （B）II与磁性播种和动态成熟在生物反应器的组合区分的支架明显增加的聚集蛋白聚糖和胶原蛋白的表达。基因表达标准化为RPLP0 mRNA和以任意单位表示相对于对照（〜1±SEM）。结果表示为平均值两至四次独立实验±SEM。 *杰诺使用Kruskal-Wallis检验（单向ANOVA非参数检验）（p值<0.05）TES统计学差异。 （ - ）：无接种磁铁; （+）：有磁力播种。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 25.糖胺聚糖（GAG）押金由蓝紫色着色证实一天糖胺聚糖的组织学染色 。 （A）在从16个聚集体的顺序融合获得的最终结构软骨的8微米的冷冻切片中观察到的正甲苯胺蓝染色。支架静态的（B）之后磁性接种或动态的（C）条件下的12-μm的冷冻切片清楚地表明这GAG含量在生物反应器中分化的支架较高。箭头表示分化细胞的聚集体。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
首先，因为这里提出的技术依靠磁性纳米粒子的内化，一个重要的问题是纳米粒子的结果，一旦他们定位在细胞内。这是事实，铁纳米颗粒可以触发潜在毒性或取决于它们的大小，涂层，和曝光19，22的时间受损分化能力。然而，一些研究已经显示在细胞生理学没有影响当包封的铁纳米颗粒在magnetoferritin的形式，生物磁性纳米粒子24使用23，或用简单的柠檬酸盐涂层和适当的浓度18中使用。另外，当氧化铁纳米颗粒在类似条件下，如本文描述的那些（与MSC和软骨）以外，我们最近证明了nanoparti的快速和几乎完全降解克莱斯在在蜂窝掺入和MSC球体形成约10天的核内体中发生。有趣的是，这种大规模的降解与铁蛋白中的游离铁的高效存储相关，并导致对细胞铁代谢非常有限的影响，为今后的临床应用25好兆头。
另一个关键点是细胞压实启动软骨的要求。通常情况下，细胞的缩合是通过离心实现;然而，这种方法是由较低的细胞数量（不大于2.5×10个5细胞）的限制。过去，这数，营养物质和气体不能扩散到聚集体的中心，引发细胞坏死。这里，标记的干细胞的磁性缩合成聚集体表现为显著方法，以形成用于软骨组织再生的3D构建体。这种磁过程已被用于其他作者与放置在板的顶部的细胞23的或与铁销的解离来本地化的磁场26后的磁体由磁悬浮：建立三维球状体。但是，磁悬浮不会出现以适合于骨料融合进一步阶段。与此相对，这里提出的磁性的方法，我们可以控制所有的融合步骤以获得一个步骤一步软骨组织构建。简言之，这个多步过程与干细胞的限制进入骨料积木开始，之后是融合这些块成较大的结构。这个自由脚手架干细胞聚集过程的关键步骤如下：首先，必须形成具有细胞作为可能的，并且第二的尽可能小的体积中的每个集合，一个必须控制的融合步骤，以避免的一个单一的，大的形成骨料。这里获得的组织是富含胶原蛋白II和蛋白聚糖。它还提出了advantag具有柔性的几何形状和尺寸的和存在的支架 - 自由ES。
磁的方法也被用来引导又厚又大的支架内的干细胞;另一替代为各种形状和尺寸的设计。这里的关键步骤是与细胞适当体积的种子支架：既不太少有细胞的整体均匀的分布，也不会太多，以避免任何细胞损失。磁力以前用来吸引和支架中保持细胞，并增强细胞接种27,28。在这里，多糖支架的孔隙内的足够的细胞凝结导致成功软骨。当磁性细胞化的支架进行生物反应器由于其双向轴向旋转由设置在转导/剪切应力刺激细胞外基质的产量显着提高。它已经在MUL其他研究显示TI-轴向负载条件下提高从软骨细胞29形成组织的质量。相对于现有技术，其中只有压缩力被施加30，31，32时，这种新颖的生物反应器的概念提出了一个真正的增益。
总之，对于软骨细胞分化，使用标记的干细胞的磁约束的形成和操纵聚集体以及种子允许创建毫米大小的软骨细胞构建体的支架。此外，磁性细胞种植与动态相结合的分化提供了再生医学应用价值的新工具。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢QuinXell技术和CellD，特别是洛塔尔·格兰尼曼和多米尼克·霍兹伦他们用生物反应器的帮助。我们感谢凯瑟琳原我，谁用普鲁兰多糖/葡聚糖多糖支架为我们提供。这项工作是由欧盟（ERC-2014-COG项目马蒂斯648779）和由AgenceNationalede LA RECHERCHE（ANR），法国（MagStem项目ANR-11 SVSE5）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
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