Introduction
L'objectif global de cette méthode est d'isoler la moelle épinière, ainsi que pour identifier et isoler les DRG 1, 2. Extrusion hydraulique de la moelle épinière est une méthode nettement plus rapide que la méthode traditionnelle d'isolement de la moelle épinière par laminectomie, soit par rupture de la colonne vertébrale une à la fois, et ce procédé réduit le risque de dommages aux tissus causés par le processus de dissection 3, 4 . DRG peut être difficile à identifier. L' identification correcte est très importante pour l' analyse des tissus, par exemple suite à une lésion du nerf sciatique. En numérotant les DRG selon leur localisation par rapport à la costae, DRG peut être identifié de manière cohérente.
Tissue isolé par les techniques démontrées ici peut être appliquée à un large éventail d'analyses , y compris Western blot 5,6, 7 qPCR et la coloration immunohistochimique 8.
Lors de l' identification DRG, il est important de tenir compte du fait que le nombre de segments de la moelle épinière est connu pour varier avec le type et la souche 9, 10, 11 animaux. Les avantages dans l'exécution de cette méthode chez la souris sont le nombre élevé de variantes génétiquement modifiées disponibles et les dépenses relativement faibles en matière de logement. Les avantages de l'utilisation des rats sont le rendement relativement élevé des tissus et si les blessures impliquant nerveuses, la procédure seront assouplies avec la taille.
Protocol
Tous les animaux ont été traités dans le respect des normes danoises et européennes. Numéro d'autorisation: 2012-15-2934.
1. Préparation de la Seringue pour hydraulique Extrusion de la moelle épinière
- Pour un rat adulte, utiliser une seringue de 10 ml. Pour une souris adulte, utiliser une seringue de 5 ml. Pour les chiots, utiliser une seringue mL 2.5.
- Régler une pointe de pipette sans filtre universellement adapté pour 2-200 pipettes uL en coupant la grande extrémité de la pointe de la pipette jusqu'à ce qu'il soit fermement à la seringue. Placez la pointe de la pipette ajustée sur la seringue. Pour les petits, utiliser un 23 G ou une aiguille semblable au lieu d'une pointe de pipette ajustée.
- Aspirer PBS glacé stérile et laisser la seringue sur la glace jusqu'à utilisation ultérieure.
2. euthanasie
- Ne pas effectuer la dislocation cervicale, car cela va perturber la colonne vertébrale rendant impossible l'extrusion.
- Pour adultes rat / souris, euthanasier en utilisant du gaz comme le CO 2 ou isoflurane. Ces substances sont nuisibles. Effectuer l'euthanasie dans une hotte et à manipuler les substances selon les directives de l'institution. (ATTENTION: CO 2: H280, P410, P403; isoflurane: H361d, P260, P281, P280)
- Pour veiller à ce que le rongeur est mort, assurer l'absence de réflexe en pinçant une patte avec des pincettes. Décapite les rongeurs en utilisant de grands ciseaux. Pour les chiots, euthanasier par décapitation.
3. Isolement de la colonne vertébrale
- Saupoudrer l'eau sur la fourrure pour contrôler les cheveux.
- En utilisant une paire de ciseaux, ouvrir la fourrure le long de la colonne vertébrale dans une direction distale et à isoler la colonne vertébrale en découpant des deux côtés le long de la colonne vertébrale devant l'os du bassin. Couper la moelle épinière de manière distale à l'os du bassin avec une paire de ciseaux.
REMARQUE: L'axe rostral-caudal est désignée par l'axe proximal-distal à travers le protocole.- Découper la colonne vertébrale à l'aide d'une paire de ciseaux pour éviter proximal-plus et plus distales domaines que ceux-ci peuvent rendre la colonne vertébrale trop en forme de S pour le succès de l'extrusion de la moelle épinière. Faire en sorte que la moelle épinière est visible aux deux extrémités. Si la moelle épinière est pas visible, couper la colonne vertébrale avec des ciseaux jusqu'à la moelle épinière devient visible.
4. hydraulique Extrusion de la moelle épinière
- Placez une boîte de Pétri (100 mm de diamètre) rempli de PBS stérile sur la glace.
- Redresser la colonne vertébrale par l'application d'un index sur la partie coudée (extrémité la plus proximale) de la colonne vertébrale, ainsi redresser la colonne vertébrale, autant que possible.
- Pour bébés, d'éviter la flexion de la colonne vertébrale, les vertèbres que sera perturbée rendant spinale extrusion du cordon impossible.
- Insérez la pointe de la pipette (23 aiguille G pour chiots, alternativement 18 aiguilles G pour les souris adultes) à l'extrémité la plus distale de la colonne vertébrale. Si correctement inséré, la pointe est stabilisée dans la cavité vertébrale.
- Faire en sorte que la colonne vertébrale est redressée dans la mesure du possible. Appliquer une pression constante, et extruder la moelle épinière dans la boîte de Pétri sur de la glace. Assurez-vous que la moelle épinière est maintenu humide sur la glace en le mettant dans le PBS jusqu'à ce que la manipulation ultérieure.
Figure 1: moelles épinières représentatifs. Hydrauliquement extrudé moelles épinières. De gauche à droite: rat adulte, souris adulte, chiot de la souris. élargissements lombaires marqués par boîte. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
5. Identification des ganglions rachidiens (DRG)
- Divisez la colonne vertébrale en deux parties longitudinales égales à l'aide de ciseaux et placer la colonne vertébrale fendue sous le microscope.
- Identifier le segment T13 vertèbre par localiser le site de fixation de la plus distale costae sur l'attention de payer de la colonne vertébrale de ne pas confondre l'costae avec les nerfs intercostaux à proximité. Les plus distales costae sont fixés à la partie proximale du segment de vertèbre T13 et T13 DRG est situé de manière distale à la vertèbre T13 et proximalement à la vertèbre L1.
- Identifier DRG concomitants dans la direction distale. Pour un rat adulte, DRG concomitants apparaissent en blanc avec dorsale bien visible et les racines ventrales. Pour une souris adulte, DRG concomitants apparaissent en blanc avec dorsale bien visible et les racines ventrales. Pour les chiots, les DRG concomitants apparaissent comme des sphères claires.
Figure 2: Identification des DRG dans la colonne vertébrale après extrusion de la moelle épinière. La colonne vertébrale a été divisé en permettant la visualisation des DRG comme indiqué par des flèches. Exemplifié par rat adulte et chiot de la souris. ref = cible "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
6. Isolation des DRG
- Plats nombre de Petri (30 mm de diamètre) en fonction des DRG spécifiques qui doivent être isolés, par exemple , L3, L4, L5. Remplissez les boîtes de Pétri avec de la glace froide PBS stérile et placez-les sur la glace.
- Utilisation de micro ciseaux, couper dorsale et ventrale racines au plus près des DRG que possible pour les libérer, tout en évitant d'endommager les DRG.
- Avec la pointe de pinces fermées, évider délicatement DRG et les transférer vers les boîtes de Pétri numérotés correspondants.
Figure 3: Représentant isolé DRG. De gauche à droite: rat adulte, souris adulte, chiot de la souris."_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
7. Traitement des tissus pour une analyse ultérieure
- transfert de western
- Isoler la zone de tissu d'intérêt, par exemple , l'élargissement de la moelle épinière lombaire. Si nécessaire, séparer la moelle épinière dans les côtés ipsilatéraux et controlatéraux et plus loin dans dorsale et des cornes ventrales.
- Placer le tissu dans un tampon de lyse tel que le tampon TNE de lyse (10 mM Tris-base, 150 mM de NaCl, 1 mM d' EDTA, 1% de NP40 dans bidistillée H 2 O) contenant des inhibiteurs d'enzymes appropriées sur la glace.
- Homogénéiser le tissu pendant environ 30 s sur la glace à l'aide d'un broyage mécanique pilon.
- Centrifuger pendant 15 min à 16 000 xg à 4 ° C et utiliser le surnageant pour un traitement ultérieur selon des protocoles standards 5, 6 ou conserver le surnageant à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- L'ARN-analyse
- Isoler le tissu d'intérêt.
- Placer immédiatement le tissu dans une solution de stabilisation de l'ARN pour stabiliser l'ARN pour le stockage.
- Isoler l' ARN selon des protocoles standards 7.
- Convertir l' ARN en ADNc et effectuer qPCR selon des protocoles standards 7.
- immunohistochimie
- Pour les tissus frais congelé (applicable à la moelle épinière):
- Préparer la poudre de glace sèche par pulvérisation cubes de glace sèche à un montant correspondant à deux cuillères à soupe de poudre. Couvrir cubes de glace sèche dans un linge et pulvériser les cubes à l'aide d'un marteau. Placez une feuille d'argent (environ 5 cm x 5 cm) sur une couche de cubes de glace sèche et couvrir la feuille d'argent avec de la poudre de glace sèche.
- Placez la zone de la moelle épinière sélectionnée pour d'autres analyses sur la poudre de glace sèche en utilisant des pinces, laissez-le composant logiciel enfichable gel, et le transfert de la moelle épinière à un tube de cryo. Gardez-le sur la glace sèche en tout temps ou le stocker à -80 ° C jusqu'à ce que nous poursuivree.
- Transférer la moelle épinière à un cryostat (-20 ° C). Si nécessaire, couper la moelle épinière à l'intérieur du cryostat. Placer la moelle épinière dans le matériau d'enrobage à l'intérieur du cryostat afin de le fixer sur le disque de spécimen.
- Couper la moelle épinière dans l'épaisseur désirée, par exemple 5 um, et de recueillir sur les plaques de verre. Chauffer les plaques de verre avec un doigt immédiatement avant le prélèvement de tissus pour une meilleure fixation. Gardez tout tissu restant dans des tubes cryogéniques à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Laissez les sections sur des plaques de verre à l'intérieur du cryostat jusqu'au moment de post-fixation.
- Post fixer les sections par immersion dans 4% de PFA pendant 10 min à température ambiante.
- Effectuer la coloration selon des protocoles standard 8.
- tissu fixe pour cryo tronçonnage (applicable à la moelle épinière et DRG)
- Fixer la moelle épinière et DRG dans 4% PFA (2 h pour la moelle épinière, 1,5 h pour DRG de souris et 4 h pour DRG de rat) à4 ° C (lieu de la moelle épinière en position horizontale pour l'empêcher de fixation dans une position courbée).
- Transférer le tissu à 25% en poids / volume de saccharose pendant une nuit à 4 ° C. Le tissu peut être conservé dans 25% p / v de saccharose additionnée de quelques gouttes d'azoture de sodium à 10% pour éviter une contamination microbienne à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Si nécessaire, couper la moelle épinière pour compenser l'élargissement lombaire seulement sur une planche de silicone ou similaire.
- Avec la pointe d'une serviette en papier, aspirez solution de saccharose en excès du tissu.
- Remplir un moule à mi-chemin de cryo avec matériau d'enrobage. Poussez les bulles sur les côtés du moule de cryo avec des outils tels que des pinces fermées.
- Placer le tissu sur le matériau d'enrobage en utilisant une pince à épiler et d'assurer l'orientation tissulaire souhaitée.
- Remplissez le moule cryo complètement avec le matériau d' enrobage et de pousser les bulles aussi loin du tissu que possible (par exemple en utilisant des pinces fermées).
- Remplir une boîte de Pétri (100 mmde diamètre) avec le 2-méthylbutane. Cette substance est nocive. Effectuez cette étape dans une hotte et à manipuler la substance selon les directives de l'institution (ATTENTION: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310).
- Placez la boîte de Pétri sur une couche de glace sèche et ajouter deux cubes de glace sèche à la boîte de Pétri. Placer le moule cryo dans la boîte de Petri et laisser le matériau d'enrobage pour congeler complètement.
- Gardez le tissu embarqué sur la glace sèche à tout moment ou à -80 ° C enveloppé dans Parafilm jusqu'au traitement.
- Couper le tissu sur un cryostat (-20 ° C) dans l'épaisseur désirée, par exemple 5 um.
- Effectuer la coloration selon des protocoles standard 8.
- tissu fixe pour la paraffine-plongement (applicable à la moelle épinière et DRG)
- Fixer la moelle épinière et DRG dans 4% PFA (2 h pour la moelle épinière, 1,5 h pour DRG de souris et 4 h pour DRG de rat) à 4 ° C (lieu de la moelle épinièreen position horizontale pour l'empêcher de fixation dans une position pliée).
- Transférer le tissu à 25% en poids / volume de saccharose pendant une nuit à 4 ° C. Le tissu peut être conservé dans 25% p / v de saccharose additionnée de quelques gouttes d'azoture de sodium à 10% pour éviter une contamination microbienne à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Isoler la zone de tissu d'intérêt, par exemple , l'élargissement de la moelle épinière lombaire.
- Remplir un moule à mi-chemin de l'intégration avec de la paraffine.
- Refroidir le moule brièvement enrobage en le plaçant sur la zone de refroidissement de la machine d'enrobage à durcir légèrement la paraffine. Cela permet un meilleur positionnement des tissus.
- Placer le tissu dans l'orientation souhaitée dans le moule d'enrobage. Remplir le moule enrobage avec de la paraffine et refroidir immédiatement.
- Placer le moule enrobage contenant la paraffine à 4 ° C pendant la nuit pour laisser durcir complètement et retirer le bloc de paraffine contenant le tissu du moule enrobage.
- sections Cut ona microtome dans l'épaisseur désirée, par exemple 5 um.
- Effectuer la coloration selon des protocoles standard 8.
- Pour les tissus frais congelé (applicable à la moelle épinière):
Representative Results
Moelles épinières hydrauliquement extrudés présentent une surface lisse en bon état représenté sur la figure 1. Renflement lombaire peut être facilement identifiée comme étant la zone épaissie de la moelle épinière, encadré sur la figure 1. Les faces ventrale et dorsale de la moelle épinière peuvent être identifiés à l'oeil en fonction de la morphologie. Dans la figure 1, la face ventrale est en face du spectateur, identifiable par une ligne médiane claire le long de la moelle épinière entière. Deux lignes plus larges le long de la moelle épinière permettent l'identification de la face dorsale. A l'extrémité la plus distale, la queue de cheval peut parfois rester attaché chez des rats adultes et des souris adultes.
Les DRG individuels ne peuvent être identifiées alors qu'elle se trouvait dans la colonne vertébrale, la figure 2. Après l' isolement, la figure 3, les différents DRG ne peuvent être identifiés par l' apparence. Si nécessaire, il est par conséquentimportant de les garder clairement séparés sur l'isolement. Après isolement, la moelle épinière et les DRG peuvent être traitées et colorées comme décrit dans l' étape 7.3 et représenté sur la figure 4. La figure 4a montre une coloration immunohistochimique d'une section de DRG où les neurones et les cellules gliales de leurs satellites entourant sont clairement visibles. Par identification correcte de la DRG, il est possible d'analyser l'effet des lésions du nerf sciatique sur le soma du neurone blessé, ainsi que sur leurs cellules gliales satellite environnantes. La figure 4b montre une coloration de Nissl d'une moelle épinière hydraulique extrudé où le tissu est intacte comme en témoignent les bords lisses de la section.
Figure 4: coupes de tissus représentatifs. A. La coloration immunohistochimique de l'article DRG. B. Nissl teinté section de la moelle épinière hydrauliquement extrudée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Si la colonne vertébrale est perturbée, par exemple par dislocation cervicale, la moelle épinière se divisera lors de l' extrusion. Si la moelle épinière ne peut être extrudé, la colonne vertébrale peut être ajustée légèrement aux deux extrémités et la tentative d'extrusion peut être répétée. Dans le cas de la moelle épinière entière est nécessaire pour une analyse plus poussée, soit constitué par l'élargissement du col, ainsi que l'élargissement lombaire de la colonne vertébrale ne doit être coupée légèrement. Si seulement l'élargissement lombaire est nécessaire pour une analyse plus poussée, la moelle épinière doit être coupée selon le protocole actuel. La colonne vertébrale doit être redressé en utilisant le bout des doigts pour faciliter l'extrusion.
Le protocole est applicable aux rongeurs de tous âges et est ici illustrée par une souris adulte (8 semaines), un chiot de la souris (5 jours) et un rat adulte (10 semaines). Selon le type et la souche animale, le nombre de sections thoraciques et lombaires peut varier 9, 10, 11. En fonction des protéines à analyser, rongeurs adultes peuvent être perfuses avec des solutions enzymatiques d'inhibition avant l'euthanasie. Si l'exécution d'une expérience impliquant une lésion nerveuse unilatérale, la moelle épinière peut être divisée en côtés ipsilatéraux et controlatéraux à l'aide des pinces ultra-fines immédiatement après extrusion. De plus, chaque côté peut être divisée en côtés dorsal et ventral. Le tissu peut ensuite être traité pour d' autres analyses, par exemple Western blot.
Transcardial perfusion fixation avec PFA avant l'extrusion du cordon spinal doit être évité, car cela rend la moelle épinière non flexible et empêche l'extrusion de la moelle épinière hydraulique. Hydraulique extrusion de la moelle épinière se déchirer les racines dorsales. Pour les expériences où les racines dorsales attachées sont nécessaires, laminectomie est recommandé. En outre, la colonne vertébrale sont perdus meninges par extrusion hydraulique, qui peut être évité par laminectomie norme extrusion hydraulique de la moelle épinière et DRG isolement peut également être effectuée en utilisant un fluide cérébrospinal artificiel oxygéné (ACSF) au lieu de PBS glacé. L'utilisation de l' ACSF permet la préservation du tissu isolé dans un meilleur environnement physiologique, ce qui est particulièrement important dans le cas des enregistrements ultérieurs électrophysiologiques 12, 13. Une alternative à l' ACSF pourrait être PBS contenant 1 g / L de glucose pour la production des cultures primaires de DRG 14. extrusion hydraulique de la moelle épinière est une méthode nettement plus rapide que la méthode traditionnelle d'isolement de la moelle épinière par laminectomie, ce qui réduit le temps de manipulation des tissus et diminue donc le risque de détérioration des protéines. Perfusion avec un fixatif avant d'isoler la moelle épinière par laminectomie peut réduire le risque de lésions des tissus lors de la dissection et pendant le retrait final de lala moelle épinière de la colonne vertébrale. Toutefois, la fixation du tissu empêche son application à des analyses telles que Western blot. Hydrauliques rendements d'extrusion structurellement des tissus intacts 3 adapté à une plus large gamme d'analyses. identification cohérente des DRG peut être difficile. Cependant, cela est essentiel pour l' analyse des tissus, par exemple suite à une lésion du nerf sciatique. En numérotant les DRG selon leur localisation par rapport à la costae, DRG peut être identifié de manière cohérente. Coloration des tissus de la moelle épinière, ainsi que des DRG peut être optimisée en effectuant les variations de traitement des tissus illustrés décrits dans le protocole étape 7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100% | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μL, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1X and eyepiece 10X | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
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