Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di isolare il midollo spinale e per identificare e isolare DRG 1, 2. Estrusione idraulica del midollo spinale è un metodo molto più veloce rispetto al modo tradizionale di isolamento del midollo spinale per laminectomia, cioè rompendo vertebre spinali uno alla volta, e questo metodo riduce il rischio di danni ai tessuti causati dal processo di dissezione 3, 4 . DRG può essere difficile da individuare. La corretta identificazione è molto importante per l'analisi dei tessuti, ad esempio in seguito lesione del nervo sciatico. Numerando i DRG in base alla loro localizzazione rispetto al costae, DRG possono essere identificati in modo coerente.
Tissue isolato mediante tecniche dimostrate qui può essere applicato ad un'ampia gamma di analisi inclusi occidentale blotting 5,6, 7 e qPCR colorazione immunoistochimica 8.
Nell'individuazione DRG, è importante prendere in considerazione che il numero dei segmenti spinali si caratterizza per variare con il tipo di animale e ceppo 9, 10, 11. I vantaggi di eseguire questo metodo nei topi sono l'elevato numero di varianti geneticamente modificati disponibili e le spese relativamente basse abitazioni. I vantaggi nell'utilizzo di ratti sono la resa dei tessuti relativamente alta e se coinvolge lesioni nervose, la procedura sarà facilitato con dimensioni.
Protocol
Tutti gli animali sono stati trattati nel pieno rispetto delle normative danesi ed europei. numero di permessi: 2012-15-2934.
1. Preparazione della siringa per idraulica estrusione del midollo spinale
- Per un ratto adulto, usare una siringa da 10 ml. Per un topo adulto, usare una siringa da 5 ml. Per i cuccioli, usare una siringa da ml 2.5.
- Regolare la punta della pipetta non-filtro universale adatto per 2-200 pipette microlitri tagliando l'estremità più grande della punta della pipetta fino a quando non si inserisce saldamente alla siringa. Posizionare la punta della pipetta rettificato sulla siringa. Per i cuccioli, utilizzare un 23 G o un ago simile invece di un puntale rettificato.
- Aspirare ghiacciata PBS sterile e lasciare la siringa sul ghiaccio fino a nuovo uso.
2. L'eutanasia
- Non eseguire dislocazione cervicale, in modo da disturbare la vertebre spinali rendendo impossibile l'estrusione.
- Per ratto adulto / mouse, eutanasia usando il gas come CO 2 o isofluRane. Queste sostanze sono dannose. Eseguire l'eutanasia in una cappa aspirante e gestire le sostanze secondo le linee guida dell'istituzione. (ATTENZIONE: CO 2: H280, P410, P403, isoflurano: H361d, P260, P281, P280)
- Per garantire che il roditore è morto, garantire l'assenza di riflesso pizzicando una zampa con una pinzetta. Decapitare il roditore con grandi forbici. Per i cuccioli, eutanasia per decapitazione.
3. Isolamento della colonna vertebrale
- Spruzzare acqua sul pelo per controllare i capelli.
- Utilizzando un paio di forbici, tagliare aperto il pelo lungo la colonna vertebrale in direzione distale e isolare la colonna vertebrale tagliando su entrambi i lati lungo la colonna vertebrale oltre l'osso pelvico. Tagliare il midollo spinale distalmente all'osso pelvico con un paio di forbici.
NOTA: L'asse rostrale-caudale è indicato come l'asse prossimale-distale durante il protocollo.- Tagliare la colonna vertebrale con un paio di forbici per evitare il proximal-più distale e la maggior parte delle aree, come questi possono rendere la colonna vertebrale anche S-forma per il successo di estrusione del midollo spinale. Assicurarsi che il midollo spinale è visibile a entrambe le estremità. Se il midollo spinale non è visibile, tagliare la colonna vertebrale con le forbici fino al midollo spinale diventa visibile.
4. estrusione idraulica del midollo spinale
- Collocare un piatto Petri (100 mm di diametro) riempita con PBS sterile su ghiaccio.
- Raddrizzare la colonna vertebrale applicando un indice sulla parte piegata (prossimale porzione più) della colonna vertebrale, raddrizzando così la colonna vertebrale per quanto possibile.
- Per i cuccioli, evitare di piegare la colonna vertebrale, come le vertebre verrà interrotto il rendering del midollo spinale estrusione impossibile.
- Inserire la punta della pipetta (23 G ago per cuccioli, in alternativa, 18 ago G per topi adulti) al distale-più fine della colonna vertebrale. Se inserita correttamente, la punta è stabilizzato nella cavità spinale.
- Assicurarsi che la colonna vertebrale è raddrizzato per quanto possibile. Applicare una pressione costante, ed estrudere il midollo spinale nella capsula di Petri sul ghiaccio. Assicurarsi che il midollo spinale è tenuto umido in ghiaccio con l'in PBS fino a nuovo trattamento.
Figura 1: midolli spinali rappresentativi. Idraulico estruso midollo spinale. Da sinistra a destra: ratto adulto, topo adulto, mouse cucciolo. ingrandimenti lombare segnati dalla scatola. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
5. Identificazione dei gangli dorsali (DRG)
- Dividere la colonna vertebrale in due parti longitudinali uguali con le forbici e posizionare la colonna vertebrale spaccatura sotto il microscopio.
- Identificare il segmento T13 vertebra dopo localizzare il sito di attacco del distale-più costae sulla colonna vertebrale facendo attenzione a non confondere il costae con le vicine nervi intercostali. I distali-più costae sono attaccati alla parte prossimale del segmento vertebra T13 e T13 DRG si trova distalmente alla vertebra T13 e prossimalmente alla vertebra L1.
- Identificare DRG concomitanti in direzione distale. Per un ratto adulto, DRG concomitanti appaiono bianche con dorsali chiaramente visibili e radici ventrali. Per un topo adulto, DRG concomitanti appaiono bianche con dorsali chiaramente visibili e radici ventrali. Per i cuccioli, DRG concomitanti appaiono come sfere trasparenti.
Figura 2: Identificazione DRG nella colonna vertebrale dopo l'estrusione del midollo spinale. La colonna vertebrale è stato suddiviso consentendo la visualizzazione di DRG come indicato dalle frecce. Esemplificato da ratto adulto e pup del mouse. ref = target "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
6. L'isolamento di DRG
- Piatti Numero di Petri (30 mm di diametro) in funzione delle DRG specifici da isolati, ad esempio L3, L4, L5. Riempire le capsule di Petri con ghiacciata PBS sterile e disporli sul ghiaccio.
- Utilizzando le forbici micro, tagliare dorsali e ventrali radici più vicino possibile ai DRG come possibile rilasciare loro, evitando di danneggiare i DRG.
- Con la punta delle pinzette chiusi, delicatamente scoop DRG e trasferirli ai corrispondenti piatti numerati Petri.
Figura 3: Rappresentante isolato DRG. Da sinistra a destra: ratto adulto, topo adulto, mouse cucciolo."_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
7. lavorazione di tessuti per ulteriori analisi
- Western blotting
- Isolare l'area tessuto di interesse, ad esempio il midollo spinale lombare allargamento. Se necessario, separare il midollo spinale in lati ipsilaterale e controlaterale e ulteriormente in dorsali e ventrali corna.
- Posizionare il tessuto in tampone di lisi come tampone di lisi TNE (10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 in bidistillata H 2 O) contenente opportuni inibitori su ghiaccio.
- Omogeneizzare il tessuto per circa 30 s su ghiaccio con un pestello macinazione meccanica.
- Centrifugare per 15 min a 16.000 xga 4 ° C e utilizzare il supernatante per un'ulteriore elaborazione secondo protocolli standard 5, 6 o mantenere il supernatante a -20 ° C fino all'utilizzo.
- RNA-analisi
- Isolare il tessuto di interesse.
- Porre immediatamente il tessuto in soluzione stabilizzazione RNA per stabilizzare l'RNA per la conservazione.
- Isolare RNA secondo protocolli standard 7.
- Convertire RNA a cDNA ed eseguire qPCR secondo protocolli standard 7.
- immunoistochimica
- Per il tessuto fresco congelato (applicabile al midollo spinale):
- Preparare la polvere di ghiaccio secco polverizzando cubetti di ghiaccio secco per un importo corrispondente a due cucchiai di polvere. Coprire cubetti di ghiaccio secco in un panno e polverizzare i cubi con un martello. Posizionare lamina d'argento (circa 5 cm x 5 cm) su uno strato di cubetti di ghiaccio secco e coprire la lamina d'argento con polvere di ghiaccio secco.
- Posizionare l'area del midollo spinale selezionato per ulteriori analisi sulla polvere di ghiaccio secco con una pinzetta, lasciarlo snap-freeze, e trasferire il midollo spinale di un tubo di crio. Tenerlo in ghiaccio secco in ogni momento o conservarlo a -80 ° C fino a quando ci ulteriormentee.
- Trasferire il midollo spinale per un criostato (-20 ° C). Se necessario, tagliare il midollo spinale all'interno del criostato. Posizionare il midollo spinale in embedding materiale all'interno del criostato, al fine di allegare al disco di preparato.
- Tagliare il midollo spinale nello spessore desiderato, ad esempio 5 micron, e raccogliere su lastre di vetro. Riscaldare le lastre di vetro con un dito immediatamente precedenti la raccolta dei tessuti per una migliore attacco. Mantenere qualsiasi tessuto rimanente in tubi crioconservazione a -80 ° C fino all'utilizzo.
- Lasciare le sezioni su lastre di vetro all'interno del criostato fino al momento per la post-fissaggio.
- Post-fix sezioni di immersione nel 4% PFA per 10 min a temperatura ambiente.
- Eseguire la colorazione secondo protocolli standard 8.
- tessuto fisso per crio sezionamento (applicabile al midollo spinale e DRG)
- Fissare midollo spinale e DRG in al 4% PFA (2 h per il midollo spinale, 1.5 h per DRG del mouse e 4 ore per DRG di ratto)4 ° C (posto midollo spinale in posizione orizzontale per evitare che si fissa in una posizione piegata).
- Trasferire il tessuto al 25% w / v di saccarosio notte a 4 ° C. Il tessuto può essere memorizzato nel 25% w / v di saccarosio addizionato con poche gocce di azide di sodio al 10% per prevenire la contaminazione microbica a 4 ° C fino all'utilizzo. Se necessario, tagliare il midollo spinale per compensare l'allargamento lombare solo su una tavola di silicone o simile.
- Utilizzando la punta di un tovagliolo di carta, aspirare soluzione di saccarosio in eccesso dal tessuto.
- Riempire una metà dello stampo crio con materiale di incorporamento. Spingere le bolle ai lati dello stampo crio con strumenti come pinzette chiusi.
- Posizionare il tessuto sul materiale embedding usando pinzette ed assicurare l'orientamento del tessuto desiderato.
- Riempire lo stampo crio completamente con materiale di incorporamento e spingere le bolle più lontano dal tessuto possibile (ad esempio utilizzando una pinzetta chiusi).
- Riempire una piastra di Petri (100 mmdi diametro) con 2-metilbutano. Questa sostanza è nociva. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante e gestire la sostanza secondo le linee guida dell'istituto (ATTENZIONE: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310).
- Porre la capsula di Petri su uno strato di ghiaccio secco e aggiungere due cubetti di ghiaccio secco al piatto Petri. Mettere lo stampo crio nella scatola di Petri e lasciare che il materiale embedding per congelare completamente.
- Mantenere il tessuto incorporato in ghiaccio secco in ogni momento o a -80 ° C avvolto in Parafilm fino al procedimento.
- Tagliare il tessuto su un criostato (-20 ° C) nello spessore desiderato, ad esempio 5 micron.
- Eseguire la colorazione secondo protocolli standard 8.
- tessuto fissato per paraffina-embedding (applicabile al midollo spinale e DRG)
- Fix midollo spinale e DRG in 4% PFA (2 h per il midollo spinale, 1.5 h per DRG topo e 4 h per DRG di ratto) a 4 ° C (posto midollo spinalein posizione orizzontale per evitare che si fissa in una posizione piegata).
- Trasferire il tessuto al 25% w / v di saccarosio notte a 4 ° C. Il tessuto può essere memorizzato nel 25% w / v di saccarosio addizionato con poche gocce di azide di sodio al 10% per prevenire la contaminazione microbica a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Isolare l'area tessuto di interesse, ad esempio il midollo spinale lombare allargamento.
- Riempire una metà stampo embedding con paraffina.
- Raffreddare brevemente stampo embedding posizionandolo sulla zona di raffreddamento della macchina embedding per indurire un po 'la paraffina. Ciò consente un migliore posizionamento dei tessuti.
- Posizionare il tessuto nell'orientamento desiderato nello stampo embedding. Riempire lo stampo embedding con paraffina e raffreddare immediatamente.
- Posizionare lo stampo incorporamento paraffina contenente a 4 ° C durante la notte per far indurire completamente e rimuovere il blocco di paraffina contenente il tessuto dallo stampo incorporamento.
- sezioni tagliate ona microtomo nello spessore desiderato, ad esempio 5 micron.
- Eseguire la colorazione secondo protocolli standard 8.
- Per il tessuto fresco congelato (applicabile al midollo spinale):
Representative Results
Midollo spinale idraulico estruso mostrano una superficie liscia intatta mostrato in Figura 1. L'allargamento lombare può essere facilmente identificato come area ispessita del midollo spinale, inscatolato in Figura 1. Le dorsali e ventrali lati del midollo spinale possono essere identificati da occhio secondo la morfologia. Nella figura 1, il lato ventrale è rivolto verso lo spettatore, identificabili da una linea mediana chiaro, lungo l'intero midollo spinale. Due linee più ampie lungo il midollo spinale consentono l'identificazione del lato dorsale. Al distale-più fine, la cauda equina a volte può rimanere attaccato in ratti adulti e topi adulti.
DRG individuali possono essere identificati solo mentre si trova nella colonna vertebrale, Figura 2. Dopo aver isolato, figura 3, i singoli DRG non possono essere identificati in base all'aspetto. Se necessario, è quindiimportante per tenerli separati chiaramente su di isolamento. Dopo l'isolamento, il midollo spinale e DRG possono essere elaborati e colorati come indicato al punto 7.3 e rappresentata nella figura 4. La figura 4a mostra una colorazione immunoistochimica di una sezione DRG cui i neuroni e le cellule gliali satelliti circostante sono chiaramente visibili. Con corretta identificazione del DRG è possibile analizzare l'effetto di lesioni del nervo sciatico sul soma del neurone lesa nonché sulle loro cellule gliali satellitare circostanti. La figura 4b mostra una colorazione Nissl di un midollo spinale estruso idraulicamente dove il tessuto è intatto come risulta dai bordi lisci della sezione.
Figura 4: sezioni di tessuto rappresentativi. A. La colorazione immunoistochimica della sezione DRG. B. Nissl macchiato section del midollo spinale estruso idraulicamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Se la colonna vertebrale è disturbato, ad esempio mediante dislocazione cervicale, il midollo spinale dividerà durante l'estrusione. Se il midollo spinale non può essere estruso, la colonna spinale può essere leggermente tagliati a entrambe le estremità e il tentativo di estrusione può essere ripetuto. Nel caso sia necessario l'intero midollo spinale per ulteriori analisi, cioè costituito dell'allargamento cervicale e l'allargamento lombare della colonna vertebrale deve essere tagliato solo leggermente. Se è necessario solo il rigonfiamento lombare per ulteriori analisi, il midollo spinale deve essere tagliato secondo la presente protocollo. La colonna vertebrale deve essere raddrizzata con la punta delle dita per facilitare l'estrusione.
Il protocollo è applicabile ai roditori di ogni età ed è qui esemplificato da un topo adulto (8 settimane), un cucciolo mouse (5 giorni) e un ratto adulto (10 settimane). A seconda del tipo di animale e la tensione, il numero di sezioni toracica e lombare può variare 9, 10, 11. A seconda delle proteine da analizzare, roditori adulti possono essere perfusi con soluzioni di enzimi inibizione prima dell'eutanasia. Se si esegue un esperimento che coinvolge lesioni nervose unilaterale, il midollo spinale può essere suddiviso in parti ipsilaterale e controlaterale utilizzando pinzette ultrafini subito dopo l'estrusione. Inoltre, ogni lato può essere suddiviso in dorsale e ventrale lati. Il tessuto può quindi essere elaborato per ulteriori analisi, ad esempio Western blotting.
Transcardial perfusione-fissazione con PFA prima dell'estrusione del midollo spinale dovrebbe essere evitata, in quanto rende il midollo spinale non flessibile e impedisce midollo spinale estrusione idraulica. Idraulico estrusione del midollo spinale si strappa le radici dorsali. Per gli esperimenti in cui sono necessari allegati radici dorsali, si consiglia di laminectomia. Inoltre, meningi spinali vengono persi per estrusione idraulico, che può essere evitato laminectomia serie estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento DRG potrebbe anche essere eseguita utilizzando ossigenato liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) invece di PBS ghiacciato. L'uso di ACSF permette conservazione del tessuto isolato in un ambiente migliore fisiologica, che è particolarmente importante nel caso di successive registrazioni elettrofisiologiche 12, 13. Un'alternativa al ACSF potrebbe essere PBS contenente 1 g / L di glucosio per la generazione di colture DRG primaria 14. estrusione idraulica del midollo spinale è un metodo molto più veloce rispetto al modo tradizionale di isolamento del midollo spinale per laminectomia, riducendo i tempi di tessuto-movimentazione e quindi diminuendo il rischio di danni proteine. Perfusione con un fissatore prima di isolare il midollo spinale laminectomia può ridurre il rischio di danni ai tessuti durante la dissezione e durante la rimozione finale delmidollo spinale dalla colonna vertebrale. Tuttavia, la fissazione dei tessuti preclude l'applicabilità di analisi come la Western blotting. I rendimenti di estrusione idraulici tessuto strutturalmente integro 3 adatto per una gamma più ampia di analisi. individuazione coerente di DRG può essere difficile. Tuttavia, questo è essenziale per l'analisi dei tessuti, ad esempio in seguito lesione del nervo sciatico. Numerando i DRG in base alla loro localizzazione rispetto al costae, DRG possono essere identificati in modo coerente. La colorazione di tessuto del midollo spinale e della DRG può essere ottimizzata eseguendo le variazioni di trattamento del tessuto illustrate descritte nel passaggio 7 di protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100% | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μL, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1X and eyepiece 10X | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
References
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9, 82 (2016).
- Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Meikle, A. D., Martin, A. H. A rapid method for removal of the spinal cord. Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay. J Vis Exp. (40), (2010).
- Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections (2014).
- Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).
- Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
- Green, E. L. Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice. Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. (35), (2010).
- Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia. Ann Anat. , 62-67 (2016).
- Peeraer, E., et al. Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy. J Pain Res. 4, 55-65 (2011).
