Introduction
El objetivo general de este método consiste en aislar la médula espinal, así como para identificar y aislar los GRD 1, 2. Extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, es decir, romper la columna vertebral de una en una, y este método reduce el riesgo de daño tisular causado por el proceso de disección de 3, 4 . GRD puede ser difícil de identificar. La identificación correcta es muy importante para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente.
Tejido aislado por las técnicas demostradas aquí se puede aplicar a una amplia gama de análisis, incluyendo transferencia de Western 5,6, 7 y qPCR tinción inmunohistoquímica 8.
Cuando la identificación de los GRD, es importante tener en cuenta que el número de segmentos de la médula espinal se sabe que varían con el tipo de animal y tensión 9, 10, 11. Las ventajas en la realización de este método en los ratones son el elevado número de variantes modificadas genéticamente disponibles y los gastos relativamente bajos de vivienda. Las ventajas de usar las ratas son el rendimiento tejido relativamente alta y si la participación de las lesiones nerviosas, el procedimiento se aliviaron con el tamaño.
Protocol
Todos los animales fueron manejados en plena conformidad con los reglamentos daneses y europeos. Número de Permiso: 2012-15-2934.
1. Preparación de la jeringuilla por extrusión hidráulica de la Médula Espinal
- Para una rata adulta, utilice una jeringa de 10 ml. Para un ratón adulto, utilizar una jeringa de 5 ml. Para los cachorros, utilice una jeringa de 2,5 ml.
- Ajuste una punta de pipeta no universalmente filtro adecuado para 2-200 pipetas mu L por el recorte de la gran final de la punta de la pipeta hasta que se ajuste firmemente a la jeringa. Coloque la punta de la pipeta ajustada en la jeringa. Para los cachorros, utilizar una aguja de 23 G o similar en lugar de una punta de pipeta ajustada.
- Aspirar PBS estéril y dejar la jeringa en hielo hasta su uso posterior en frío de hielo.
2. La eutanasia
- No realice dislocación cervical, ya que esto perturbe la columna vertebral representación de extrusión imposible.
- Para el adulto de rata / ratón, la eutanasia usando gas tal como CO2 o isofluRane. Estas sustancias son dañinas. Realizar la eutanasia en una campana de humos y manejar las sustancias de acuerdo con directrices de la institución. (PRECAUCIÓN: CO 2: H280, P410, P403; isoflurano: H361d, P260, P281, P280)
- Para asegurarse de que el roedor está muerto, garantizar la ausencia de reflejo pellizcando una pata con pinzas. Decapitar al roedor usando tijeras grandes. Para los cachorros, la eutanasia por decapitación.
3. Aislamiento de la columna vertebral
- Espolvorear agua sobre la piel para controlar el cabello.
- El uso de un par de tijeras, corte abierto la piel a lo largo de la columna vertebral en una dirección distal y aislar la columna vertebral mediante el corte en ambos lados a lo largo de la columna vertebral más allá del hueso de la pelvis. Cortar la médula espinal distal al hueso pélvico con un par de tijeras.
NOTA: El eje rostral-caudal se denota como el eje proximal-distal durante todo el protocolo.- Recorte de la columna vertebral con un par de tijeras para evitar la proximal-más y más distal áreas, ya que pueden hacer que la columna vertebral también en forma de S para el éxito de la extrusión de la médula espinal. Asegúrese de que la médula espinal es visible en ambos extremos. Si la médula espinal no es visible, el asiento de la columna vertebral con tijeras hasta la médula espinal se hace visible.
4. hidráulica de extrusión de la Médula Espinal
- Colocar una placa de Petri (100 mm de diámetro) lleno de PBS estéril en hielo.
- Enderezar la columna vertebral mediante la aplicación de un dedo índice en la parte doblada (extremo más proximal) de la columna vertebral, enderezando de ese modo la columna vertebral lo más posible.
- Para cachorros, evitar doblar la columna vertebral, como las vértebras se interrumpirá la prestación de extrusión de la médula espinal imposible.
- Insertar la punta de la pipeta (23 G aguja para cachorros, de forma alternativa 18 de la aguja G para ratones adultos) en el extremo más distal de la columna vertebral. Si se inserta correctamente, la punta se estabiliza en la cavidad de la médula.
- Asegúrese de que la columna vertebral se endereza tanto como sea posible. Aplique una presión constante, y la extrusión de la médula espinal en la placa de Petri en el hielo. Asegúrese de que la médula espinal se mantiene húmedo en hielo por mantenerla en PBS hasta su posterior manipulación.
Figura 1: médulas espinales representativos. Hidráulicamente extruido médula espinal. De izquierda a derecha: rata adulta, ratón adulto, cría de ratón. ampliaciones lumbares marcados por caja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Identificación de los ganglios de la raíz dorsal (GRD)
- Dividir la columna vertebral en dos partes longitudinales iguales utilizando tijeras y colocar la columna vertebral de división bajo el microscopio.
- Identificar el segmento T13 vértebra a localizar el sitio de unión de la más distal costillas sobre la columna vertebral prestar atención para no confundir la costae con los nervios intercostales cercanas. Los más distal costae están unidos a la parte proximal del segmento vértebra T13 y el T13 DRG está situado distalmente a T13 vértebra y proximalmente a la vértebra L1.
- Identificar los GRD concomitantes en la dirección distal. Para una rata adulta, GRD concomitantes aparecen de color blanco con dorsal claramente visible y las raíces ventrales. Para un ratón adulto, GRD concomitantes aparecen de color blanco con dorsal claramente visible y las raíces ventrales. Para los cachorros, los GRD concomitantes aparecen como esferas claras.
Figura 2: Identificación de los GRD en la columna vertebral después de la extrusión de la médula espinal. La columna vertebral se ha dividido que permite la visualización de los GRD, como se indica por las flechas. Ejemplificado por rata adulta y la cría de ratón. ref = objetivo "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Aislamiento de los GRD
- Platos Número de Petri (30 mm de diámetro) de acuerdo con los GRD específicos a ser aislados, por ejemplo, L3, L4, L5. Llenar las cajas de Petri con helado de PBS estéril y colocarlos en hielo.
- Con unas tijeras micro, dorsal y cortar las raíces ventrales tan cerca de los GRD como sea posible para liberarlos, evitando dañar los GRD.
- Con la punta de las pinzas cerradas, suavemente sáquele GRD y transferirlos a las placas de Petri numeradas correspondientes.
Figura 3: Representante aislado GRD. De izquierda a derecha: rata adulta, ratón adulto, cría de ratón."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
7. Tratamiento de tejidos para su posterior análisis
- Western Blot
- Aislar el área de tejido de interés, por ejemplo, la médula espinal lumbar de la ampliación. Si es necesario, separar la médula espinal en ipsilateral y contralateral partes y más en la dorsal y ventral cuernos.
- Coloque el tejido en tampón de lisis tal como tampón TNE de lisis (10 mM Tris-base, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de NP40 en bidestilada H 2 O) que contiene inhibidores de la enzima apropiados sobre hielo.
- Homogeneizar el tejido durante aproximadamente 30 s en hielo usando una mano de mortero de molienda mecánica.
- Centrifugar durante 15 min a 16.000 xg a 4 ° C y utilizar el sobrenadante para su posterior procesamiento de acuerdo con protocolos estándar 5, 6 o mantener el sobrenadante a -20 ° C hasta su uso posterior.
- RNA-análisis
- Aislar el tejido de interés.
- Colocar inmediatamente el tejido en una solución de estabilización de ARN para estabilizar el ARN para el almacenamiento.
- Aislar ARN de acuerdo con protocolos estándar 7.
- Convertir RNA a cDNA y realizar qPCR acuerdo con protocolos estándar 7.
- La inmunohistoquímica
- Para tejido fresco congelado (aplicable a la médula espinal):
- Preparar polvo de hielo seco pulverizando los cubos de hielo seco a una cantidad correspondiente a dos cucharadas de polvo. Cubra cubos de hielo seco en un paño y pulverizar los cubos con un martillo. Coloque la hoja de plata (aproximadamente 5 cm x 5 cm) sobre una capa de cubos de hielo seco y cubrir la hoja de plata con el polvo de hielo seco.
- Coloque el área de la médula espinal seleccionado para profundizar el análisis sobre el polvo de hielo seco con unas pinzas, se deja complemento de congelación, y la transferencia de la médula espinal a un tubo criogénico. Mantener en hielo seco en todo momento o almacenarla a -80 ° C hasta auxílianosmi.
- La transferencia de la médula espinal para un criostato (-20 ° C). Si es necesario, cortar la médula espinal dentro del criostato. Coloque la médula espinal en el interior del material aglomerante criostato con el fin de adjuntarlo a la platina.
- Cortar la médula espinal en el espesor deseado, por ejemplo, 5 m, y recoger sobre placas de vidrio. Calentar las placas de vidrio con un dedo inmediatamente antes de la recogida de tejidos para un mejor agarre. Mantenga cualquier tejido sobrante en tubos criogénicos a -80 ° C hasta su uso posterior.
- Deje las secciones sobre placas de vidrio en el interior del criostato hasta que esté listo para la post-fijación.
- Post-fijar las secciones por inmersión en 4% PFA durante 10 min a temperatura ambiente.
- Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8.
- tejido fijado para la sección crio (aplicable a la médula espinal y los GRD)
- Fijar la médula espinal y los GRD en PFA al 4% (2 h de la médula espinal, 1,5 h para GRD ratón y 4 h de GRD de rata) a4 ° C (lugar de la médula espinal en posición horizontal para evitar que se fijan en una posición doblada).
- Transferir el tejido a 25% w / v de sacarosa durante la noche a 4 ° C. El tejido puede almacenarse en 25% w / v de sacarosa complementado con algunas gotas de azida de sodio al 10% para evitar la contaminación microbiana a 4 ° C hasta su uso posterior. Si es necesario, recortar la médula espinal para compensar la ampliación lumbar solamente en un tablero de silicona o similar.
- Con la punta de una toalla de papel, aspirar el exceso de solución de sacarosa a partir del tejido.
- Llenar hasta la mitad un molde crio con material aglomerante. Empuje las burbujas a los lados del molde crio con herramientas tales como pinzas cerradas.
- Coloque el tejido en el material de incrustación con unas pinzas y garantizar la orientación tejido deseado.
- Llenar el molde crio completamente con el material de incrustación y empujar las burbujas tan lejos de los tejidos como sea posible (por ejemplo, usando pinzas cerradas).
- Llene una placa de Petri (100 mmde diámetro) con 2-metilbutano. Esta sustancia es perjudicial. Realice este paso en una campana de humos y manejar la sustancia de acuerdo con directrices de la institución (PRECAUCIÓN: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310).
- Coloque la placa de Petri sobre una capa de hielo seco y añadir dos cubos de hielo seco a la placa de Petri. Coloque el molde crio en la placa de Petri y permitir que el material de incrustación para congelar completamente.
- Mantener el tejido embebido en hielo seco en todo momento o a -80 ° C envueltos en Parafilm hasta su posterior procesamiento.
- Cortar el tejido en un criostato (-20 ° C) en el espesor deseado, por ejemplo 5 m.
- Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8.
- tejido fijado para la inclusión en parafina (aplicable a la médula espinal y los GRD)
- Fijar la médula espinal y los GRD en 4% PFA (2 h para la médula espinal, 1,5 h para GRD de ratón y de 4 h de GRD de rata) a 4 ° C (lugar de la médula espinalen posición horizontal para evitar que se fijan en una posición doblada).
- Transferir el tejido a 25% w / v de sacarosa durante la noche a 4 ° C. El tejido puede almacenarse en 25% w / v de sacarosa complementado con algunas gotas de azida de sodio al 10% para evitar la contaminación microbiana a 4 ° C hasta su uso posterior.
- Aislar el área de tejido de interés, por ejemplo, la médula espinal lumbar de la ampliación.
- Llenar hasta la mitad un molde de inclusión con parafina.
- Enfriar el molde brevemente la incrustación colocándolo en la zona de refrigeración de la máquina de incrustación para endurecer la parafina ligeramente. Esto permite un mejor posicionamiento de los tejidos.
- Coloque el tejido en la orientación deseada en el molde de inclusión. Llenar el molde de inclusión con parafina y enfriar inmediatamente.
- Coloque el molde de inclusión en parafina que contiene a 4 ° C durante la noche para dejar que se endurezca por completo y retire el bloque de parafina que contiene el tejido del molde de inclusión.
- secciones de corte omicrotomo na en el espesor deseado, por ejemplo 5 m.
- Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8.
- Para tejido fresco congelado (aplicable a la médula espinal):
Representative Results
Médulas espinales hidráulicamente extruidos presentan una superficie lisa sin daños muestra en la Figura 1. La ampliación lumbar puede ser fácilmente identificado como el área engrosada de la médula espinal, encajonado en la Figura 1. Los lados dorsal y ventral de la médula espinal pueden ser identificados por los ojos de acuerdo con la morfología. En la Figura 1, el lado ventral se enfrenta al espectador, identificable por una línea media clara a lo largo de toda la médula espinal. Dos líneas más generales a lo largo de la médula espinal permiten la identificación de la cara dorsal. En el extremo más distal, la cola de caballo a veces puede permanecer unido en ratas adultas y ratones adultos.
GRD individuales sólo pueden ser identificados mientras se encuentra en la columna vertebral, la Figura 2. Después del aislamiento, la Figura 3, los GRD individuales no pueden ser identificados por la apariencia. Si es necesario, es por lo tantoimportante mantenerlos claramente separados tras el aislamiento. Después del aislamiento, la médula espinal y los GRD pueden ser procesados y se tiñeron como se indica en el paso 7.3 y representado en la Figura 4. La figura 4a muestra una tinción inmunohistoquímica de una sección donde los DRG neuronas y células gliales sus alrededores satélite son claramente visibles. Por la correcta identificación del DRG es posible analizar el efecto de las lesiones del nervio ciático en el soma de la neurona lesionada, así como en sus células gliales satélite circundante. La figura 4b muestra una tinción de Nissl de una médula espinal hidráulicamente extruido en el que el tejido está intacto como se refleja por los bordes lisos de la sección.
Figura 4: secciones de tejido representativas. A. La tinción inmunohistoquímica de la sección DRG. B. Nissl manchadas sección de la médula espinal hidráulicamente extruido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Si se altera la columna vertebral, por ejemplo, por dislocación cervical, la médula espinal se dividirá durante la extrusión. Si la médula espinal no se puede extruir, la columna vertebral puede ser recortado ligeramente en ambos extremos y el intento de extrusión se puede repetir. En caso de que se necesita toda la médula espinal para su posterior análisis, es decir, que consiste en la ampliación de cuello uterino, así como la ampliación lumbar, la columna vertebral sólo debe ser recortado ligeramente. Si sólo se necesita la ampliación lumbar para su posterior análisis, la médula espinal se debe ajustar de acuerdo con el presente protocolo. La columna vertebral debe enderezarse usando las yemas de los dedos para facilitar la extrusión.
El protocolo es aplicable a los roedores de todas las edades y es aquí ejemplificado por un ratón adulto (8 semanas), una cría de ratón (5 días) y una rata adulta (10 semanas). Dependiendo del tipo de animal y la tensión, el número de secciones torácica y lumbar puede variar 9, 10, 11. Dependiendo de las proteínas a analizar, roedores adultos pueden ser perfundidos con soluciones de inhibidores de enzimas antes de la eutanasia. Si se realiza un experimento con lesión del nervio unilateral, la médula espinal se puede dividir en los lados ipsilaterales y contralaterales utilizando pinzas ultra-finas inmediatamente después de la extrusión. Además, cada lado se puede dividir en lados dorsal y ventral. El tejido puede ser procesada para análisis adicionales, por ejemplo, transferencia Western.
Transcardial perfusión-fijación con PFA antes de la extrusión de la médula espinal debe evitarse, ya que esto hace que la médula espinal no flexible y evita cable de extrusión hidráulica espinal. Hidráulica de extrusión de la médula espinal será arrancar las raíces dorsales. Para los experimentos en los adjuntos raíces dorsales son necesarias, se recomienda laminectomía. Además, meninges espinales se pierden por extrusión hidráulica, que se puede evitar mediante laminectomía estándar extrusión hidráulica de la médula espinal y el aislamiento DRG también podría llevarse a cabo utilizando oxigenado líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) en lugar de PBS enfriado en hielo. El uso de ACSF permite la conservación del tejido aislado en un mejor entorno fisiológico, que es particularmente importante en el caso de registros electrofisiológicos posteriores 12, 13. Una alternativa a ACSF podría ser PBS que contiene 1 g / l de glucosa para la generación de cultivos de DRG primaria 14. extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, lo que reduce el tiempo de manipulación de tejido y por lo tanto reducir el riesgo de daño a las proteínas. La perfusión con un fijador antes de aislar de la médula espinal por laminectomía puede reducir el riesgo de daños en los tejidos durante la disección y durante la extracción final de lade la médula espinal de la columna vertebral. Sin embargo, la fijación del tejido se opone a su aplicabilidad a los análisis, tales como transferencia Western. Los rendimientos de extrusión hidráulicas estructuralmente tejido intacto 3 adecuado para una gama más amplia de análisis. la definición constante de los GRD puede ser difícil. Sin embargo, esto es esencial para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente. La tinción de tejido de la médula espinal, así como de los GRD se puede optimizar mediante la realización de las variaciones de tratamiento de tejido ilustradas descritas en el paso 7 de protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100% | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μL, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1X and eyepiece 10X | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
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