Summary
神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ と筋肉の両方の機能を総合的に評価するためのプロトコルについて述べる。
Abstract
神経筋接合部 (NMJ) 機能は運動ニューロンと筋肉の間の通信障害、加齢、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの病気を勉強して極めて重要な役割を果たしています。ここで述べる NMJ 機能を電気刺激の 2 つのタイプを組み合わせることで測定するために使用することができます実験的プロトコル: 筋膜刺激と神経を通して刺激を直接します。これらの 2 つの異なる刺激に対する筋反応の比較は、筋肉の機能低下につながる略記で潜在的な変化の機能レベルで定義する助けることができます。
Ex vivo準備はよく統制された研究に適しています。ここで筋肉と NMJ 機能ヒラメ坐骨神経の準備のため、ダイヤフラム横隔神経の準備のためのいくつかのパラメーターを測定するための集中的なプロトコルについて述べる。プロトコルは約 60 分を持続し、カスタムメイドによる間断なく行われている収縮動態特性、筋肉や神経の刺激の力周波数の関係と 2 つパラメーター NMJ 機能に固有すなわち神経伝達障害と intratetanic の疲労を測定するソフトウェア。この方法論は、SOD1G93Aトランスジェニック マウス、普遍的突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) を染色 ALS の実験モデルを用いたヒラメ筋と横隔膜筋の準備で損害を検出する使用されました。
Introduction
神経筋接合部 (NMJ) は、筋線維の運動終板と運動ニューロンの軸索の端末間の接続によって形成される化学シナプスです。略記は、筋肉と神経との間の通信が高齢化や筋萎縮性側索硬化症 (ALS) が発生すると、障害に重要な役割を再生する示されています。筋肉や神経は、双方向の方法1,2通信、筋肉奇形とは切り離して NMJ 欠陥を測定することができるという、physiopathological の相互作用に新たな洞察があります。確かに、この機能の評価は、形態や生化学的変化を減らす神経伝達機能を伝達するかどうかを評価するために役立つことがあります。
神経刺激と同じ筋に、膜の直接刺激によって誘発される応答による筋収縮反応の比較は NMJ 機能の間接測定として提案されています。確かに、膜刺激パスによって神経伝達シグナル、以来 2 つの収縮応答の違いと思われる略記で変更します。このアプローチをラット3,4,5,6、7、広く提案されており、またマウス モデル8,9,10、11,12に関する情報を収集するために使用します。
ここでは、私たちは消費税し、2 つの筋の準備、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔の準備をテストする手順の詳細に説明します。特注を使用してソフトウェア、考案した NMJ と筋肉の両方の機能を特徴付けるいくつかの測定を組み合わせた連続的なテスト プロトコルそれにより筋肉の別々 に NMJ 損傷の包括的な評価を降伏します。特に、収縮力と筋の動態、直接力周波数曲線, 神経刺激、発砲とテタヌス周波数と intratetanic 疲労7の両方の神経伝達障害13プロトコルを測定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我々 が説明されたプロトコルでは、いくつかの神経筋疾患や老化サルコペニア機能神経について説明します。かどうか (その場合は、どのレベルで) は、このプロトコルを使用することができます筋肉の変化がそれ自体筋肉または神経筋伝達で発生する選択の変更によるものです。下図のデータは、我々 グループの18、20疾患の末期で筋萎縮性側索硬化症の SOD1G93Aトランスジェニック マウス モデルの実施による前の仕事の結果です。G93A SOD1 のトランスジェニック マウスでは、突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) 普遍的染色します。図 3 と 4 は、dF/dt とヒラメ坐骨神経 (左) およびダイヤフラム横隔神経 (右) 準備テタヌス力値を示します。これらの結果は、厳密に筋肉自体に関連するものではなく NMJ に関連している遺伝子の筋肉の機能的な欠陥を検出するここで提案する手法の能力を発揮します。確かに、dF/dt と筋の力の両方の SOD1G93Aヒラメ筋は制御筋肉の直接刺激し、神経を刺激したときのさらなる削減を表示するときと比べて低収縮反応を表示されます。対照的に、穏やかな変化が観察されたこれらの 2 つのパラメーターで横隔膜筋ストリップが膜を刺激された横隔膜筋が神経が刺激されたときに重要な変化が検出されたに対し。
図 3- 収縮動態。ダイヤフラムはヒラメ (A) と (B) 準備のための df/dt の ± SEM を意味します。ヒラメ筋標本表示大幅な減速を直接刺激されるとき (-27%)、および神経を刺激したときのさらなる減少 (-58%)。横隔膜標本は減速神経を刺激した場合にのみ表示されます (-30%)。リツートら18から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4-テタヌス力。ダイヤフラムはヒラメ (A) と (B) 準備のテタヌス特定力の ± SEM を意味します。ヒラメ筋標本表示大幅な減速を直接刺激されるとき (-26%)、および神経を刺激したときのさらなる減少 (-50%)。横隔膜標本表示力の減少は神経を刺激した場合にのみ (-44%)。リツートら18から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Intratetanic 疲労と神経伝達障害の評価は、NMJ 測定する特定のパラメーターを許可しました。図 5 intratetanic の疲労 (もしあればヒラメ筋 (図 5 a) の筋疲労のパラダイムの中に測定) の平均値を示しています、ダイヤフラムを取り除きます (図 5 b)。プロトコル セクションの報告を用いて疲労パラダイムは略記をも強調するように筋肉は開発されました。その結果、IF 測定直接筋肉刺激は絶対に変更されません。確かに、IF には、神経刺激が異なるマウス系統間の比較を考慮する必要がありますパラメーターが計算されます。我々 の結果は、トランスジェニック ヒラメでコントロール対応より横隔膜の筋肉低下していた場合を表示します。この違いは小さな筋肉欠損が検出されたダイヤフラムのより大きいとの大きな筋肉の損傷が既に測定してしまった、ヒラメの小さい。それは、トランスジェニック ヒラメ筋は大幅に、破損以来 NMJ 評価が正しいトランスジェニック筋肉力刺激の null 値を返すのにかかる時間は、刺激の最大 8 分間だけ心に負担すべき。トランスジェニックのヒラメ筋刺激の 8 分後の値は基本的にノイズを表す場合。
図 5-Intratetanic 疲労します。Intratetanic ダイヤフラムはヒラメ (A) と (B) 筋肉疲労には、トランスジェニック NMJ 機能の大幅な減少が表示されます。値は、平均 ± SEM. 適合リッツートら18からです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6は、ヒラメ (図 6 a)、横隔膜 (図 6 b) 標本単位テタヌス周波数で神経伝達障害を示します。場合結果に沿って神経伝達の不具合見つかりませんでした, ヒラメ筋横隔膜筋標本が神経筋接合部の疲労度の大幅な増加を表示。
図 6-神経伝達障害。神経伝達障害がヒラメ筋 (A) すべての変更を表示されませんでした、形質 NMJ 機能が大幅に低下を強調表示されているダイヤフラムのストリップ (B)。値は、平均 ± SEM. 適合リッツートら18からです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
上記実験のプロトコルは、測定、差別または筋肉に直接に発生した任意の機能変化間接的神経筋接合部のレベルでの理想的な方法を提供します。この手法は NMJ 機能の間接測定に基づいているので、かどうか瑕疵は形態学的変化または生化学的変化に関係を確立する使用できません。対照的に、任意の形態学的または生化学的変化が神経伝達シグナルの機能を減らしたかどうかを決定するの効果的な方法を用意します。しかし、力の測定が完了したら、筋肉お風呂から削除、消された、最適の長さで固定、埋め込み化合物に囲まれたできイソペンタンを溶解で急速凍結されました。筋肉は、免疫組織化学的、形態学的分析など-80 ° C 以降の評価のために格納できます。
我々 はここで提案する手法は、初めて NMJ と筋肉の機能を特徴づけるいくつかのパラメーターの測定を組み合わせた実験的テスト プロトコルに基づいています。3 つの重要なポイントは、この手法には、信頼性の高い結果が得られますを確認します。
まず、骨格筋切除は比較的一般的な手法では今、余分な注意が必要、神経を筋肉をそのままに保つために手術の手順を実行するとき。オペレーターの能力は他の実験モデルを試行前に、こうしてコントロール マウスでテストされなければなりません。コントロール マウス、直接的および間接的な刺激に対する筋収縮反応は抑え、コントロール オペレーターの手術能力を同じように期待されます。
もう一つの重要なポイントは、直接パルス神経の刺激内の筋肉の枝によって、筋肉がアクティブ化はしないし、神経に適用パルスがお風呂で現在を広めることで artefactual 方法で筋肉を行わなかったことを確認する必要です。最初のポイントは、D-ツボクラリンの前後に膜上に直接筋肉が刺激される実験の別のセットを実行することによってテストできます (25 μ M) は、生理学的なお風呂に追加されています。激の現在の値が修正されると、筋肉応答が D ツボクラリンの付加によって変更しないでください。第 2 の点は、切除した神経の長さに関連しているし、はこうして変化しやすい。吸引電極の電流は、プロトコルのセクションで説明した各テストを開始する前に評価されなければなりません。
最後に、NMJ 機能は、直接的および間接的な刺激に対する筋の反応を比較することによって評価されて、以来電気パルスの非常に正確に同期する必要があります。この点は、プロトコルの中に筋肉が刺激される一度神経を膜に、14 回の終わりに 2 つ疲労パラダイムのため特に重要です。刺激フェーズと残り時間の両方が非常に低いので (0.33 s と 0.67 横隔膜の s)、非常に低い遅れも 1 つ 2 つのコンパートメントのアンバランスの刺激に 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
筆者らの研究室で仕事に支えられたスタンパーリアラヴェッロ ローマ、テレソン (付与なし。GGP14066)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
