Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Использование данио рерио модели человеческого вируса гриппа А инфекций экрана противовирусных препаратов и характеризации иммунных клеток-хозяев ответов

Published: January 20, 2017 doi: 10.3791/55235

Introduction

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), вирусы гриппа заражают 5-10% взрослых и 20-30% детей ежегодно и вызывает 3-5 миллионов случаев тяжелой болезни и до 500000 смертей в мире 1. Ежегодные прививки против гриппа остаются наилучшим вариантом для предотвращения болезни. Усилия , как Глобальный план действий ВОЗ увеличились сезонного использования вакцины, потенциала для производства вакцин, а также научных исследований и разработок в более мощные стратегии вакцинации с целью снижения заболеваемости и смертности , связанных с сезонными вспышками гриппа 2. Противовирусные препараты , такие как ингибиторы нейраминидазы (например , как занамивир и озелтамивир) доступны в некоторых странах и доказали свою эффективность в уменьшении симптомов, при введении в течение первых 48 часов от начала 3, 4, 5. Несмотря на глобальные усилия, сдерживание сезонного гриппа НУtbreaks остается трудной задачей в это время, так как вирус гриппа антигенный дрейф часто превышает текущие способности адаптироваться к изменяющимся генома вируса 6. Стратегии вакцины, направленные на новые штаммы вируса должны быть разработаны заранее, и иногда оказывается меньше, чем оптимально эффективной из-за непредвиденных изменений в типах штаммов, которые в конечном итоге преобладают в сезон гриппа. По этим причинам, существует явная необходимость разработки альтернативных терапевтических стратегий для сдерживания инфекции и снижения смертности. По достижении лучшего понимания взаимодействия хост-вируса, это может быть возможным разработать новые лекарства против гриппа и адъювантной терапии 7, 8.

Человек-хозяин гриппа А взаимодействие вируса (ИФО) является сложным. Несколько моделей животных заражения человека IAV были разработаны для того, чтобы получить представление о взаимодействии хост-вирусом, ВКЛЮЧАЕТING мышей, морских свинок, крыс хлопка, хомяков, хорьков и макак 9. Обеспечивая важные данные, которые улучшили понимание динамики хост-IAV, каждая модель организм обладает существенными недостатками, которые необходимо учитывать при попытке перевести результаты в медицине человека. Например, у мышей, которые являются наиболее широко используемой моделью, не легко разрабатывать ИФО-индуцированные симптомы инфекции при инфицировании гриппа человека изолирует 9. Это потому , что у мышей не хватает естественный тропизм для человеческого гриппа изоляты , так как мыши эпителиальные клетки экспрессируют альфа-2,3 связей сиаловой кислоты , а не в α-2,6 связей сиаловой кислоты , выраженные на эпителиальных клетках человека 10. Гемагглютинина белки , присутствующие в человеческом IAV изолятов выгодно связывать и входить в клетки - хозяева несущих связи альфа-2,6 сиаловой кислоты через рецептор-опосредованного эндоцитоза 9, 11, 12, 13. Как следствие, в настоящее время принято, что при разработке модели мыши для гриппа человека, необходимо соблюдать осторожность, чтобы пары соответствующих штамм мыши с соответствующим штаммом вируса гриппа с целью достижения фенотипы болезни, которая резюмировать аспекты человеческой болезни. В противоположность этому , эпителиальные клетки в верхних дыхательных путей хорьков обладают альфа-2,6 связей сиаловой кислоты , которые напоминают клетки человека 14. Зараженные хорьков разделяют многие из патологических и клинических особенностей , наблюдаемых в болезни человека, в том числе патогенности и заразности вирусов гриппа человека и птиц 14, 15. Они также высоко поддаются эффективности вакцин испытаний. Тем не менее, модель хорек для человеческого гриппа имеет ряд недостатков, главным образом связанные с их размера и стоимости хозяйства, которые делают приобретение статистически знакосяка данных сложной задачей. Кроме того, хорьки воспроизведенных различия в фармакокинетики, биодоступности и токсичности, которые делают тестирование эффективности трудно. Например, хорьки проявляют токсичность по отношению к М2 ионного канала ингибитора амантадин 16. Таким образом, очевидно, что при выборе модели на животных для изучения вопросов о инфекций Iav человека, важно учитывать его преимущества, присущие и ограничения, а также аспект хост-вирус взаимодействия, который находится под следствием.

Данио, Danio rerio, является животная модель , которая предоставляет уникальные возможности для исследования микробной инфекции, иммунного ответа хозяина, и потенциальные лекарственные терапии 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <вир класс = "Xref"> 24, 25, 26, 27, 28. Присутствие α-2,6-связанных сиаловых кислот на поверхности клеток в данио предложил его восприимчивость к IAV, что подтвердилось в исследованиях инфекционных и изображаемого в естественных условиях с использованием флуоресцентного штамм репортер IAV 19. В ИФО-инфицированных данио, повышенная экспрессия противовирусных ifnphi1 и MxA транскриптов показал , что врожденный иммунный ответ был стимулируется, и отображаемая ИФО-инфицированной данио, в том числе отека и деструкции ткани патология, была аналогична той , которая наблюдается при инфекциях гриппа человека , Кроме того, IAV противовирусный ингибитор нейраминидазы занамивир ограниченная смертность и снижение вирусной репликации в данио 19.

В этом докладе, протокол для инициирования системыIC IAV инфекции у эмбрионов данио описано. Использование занамивир клинически значимых дозах в качестве доказательства из-принципа, полезность этой модели данио IAV инфекции для скрининга соединений на противовирусную активность проявляется. Кроме того, протокол , для генерации локализованного эпителиальные инфекции Iav в данио плавательном пузыре, орган , который считается анатомически и функционально аналогичны легких млекопитающих 21, 29, 30, 31, описан. Используя эту локализованную модель инфекции Iav, нейтрофилы набор к месту инфекции можно отследить, что позволяет расследование роли нейтрофилов в биологии IAV инфекции и воспаления. Эти данио модели дополняют существующие модели животных инфекций Iav человека и особенно полезны для тестирования небольших молекул и реакций иммунной клетки из-за возможности расширения сtatistical мощность, емкость для умеренной до высокой пропускной способности анализов, а также способности отслеживать поведение иммунных клеток и функции со световой микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все работы должны быть выполнены с использованием уровня биологической безопасности 2 (или BSL2) стандартов, описанных Центров США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и в соответствии с директивами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитетов (IACUC). Пожалуйста, посоветуйтесь с соответствующими должностными лицами в целях обеспечения безопасности и соблюдения.

1. рерио Уход и техническое обслуживание

  1. Spawn данио и собрать необходимое количество эмбрионов для экспериментов. При необходимости, массового размножения танков, как те , которые описаны Adatto и др. 32, могут быть использованы для сбора большого количества онтогенетически-ступенчатую эмбрионов.
  2. Разрешить эмбрионов разработать до желаемой стадии развития (48 ч после оплодотворения для системной инфекции IAV [Раздел 3] или 5 дней после оплодотворения для локализованной, плавать инфекции мочевого пузыря [раздел 4]) в глубоких чашках Петри при низкой плотности (< 100 эмбрионов / чашку) при 28 ° С в стерильной яичной воде, содержащей 60 мкг / мл морской соли (например, проточный океан) в дистиллированной воде.
    1. Удалить мертвых эмбрионов с пластиковыми пипец переноса и изменения яичного воды ежедневно для обеспечения оптимального здоровья и развития.

2. Подготовка материалов и реагентов

  1. Подготовьте 4 мг / мл маточного раствора из Tricaine-S (доведения рН до 7,0-7,4) в дистиллированной воде и автоклав. Хранить при температуре 4 ° С.
  2. Вытащите из боросиликатного стекла капилляров с нитями с использованием микропипетки съемник (например , микропипетки Puller со следующими параметрами: значение давления = 100, тепло = 550, тянуть = [нет значения], скорость = 130, время = 110).
    Примечание: Перед обрезки иглы, длина от того, где игла начинает сужаться до кончика иглы будет составлять приблизительно 12-15 мм. Это может варьироваться, однако, на основании предпочтений и применения. Более длинный, более постепенным конусности может быть более предпочтительным, из-за повышенной способности проколоть эмбрион и уменьшенного Р.И.С.К. иглы погнуться или сломаться.
  3. Растопить 2 г агарозы в яйце воды 100 мл с использованием микроволновой печи. Сделайте плиты, на которых выстраиваются и впрыснуть эмбрионов, выливая расплавленную агарозу в глубокие чашки Петри и позволяет ему затвердеть.
  4. Сделать 10 мг / мл запас Занамивир в нуклеазы без воды. Аликвоты и замораживают при -20 ° С.
  5. Растопите 0,5 г агарозы в яичном воды 50 мл с использованием микроволновой печи, чтобы сделать эмбриона монтажа агарозы. Поддержание в водяной бане при 50 ° С до момента использования во время формирования изображения.

3. Системный IAV инфекции (48 ч после оплодотворения)

ВНИМАНИЕ: Все исследования персонал должен проконсультироваться со своими руководителями и врачами относительно вакцинации до начала работы с IAV.

  1. Вручную dechorionate эмбрионов на день эксперимента с использованием # 5 щипцов. Позаботьтесь, чтобы удалить и эвтаназии эмбрионов, которые были ранены в процессе в концентрации 200 мкг / мл раствора Tricaine.
  2. Подготовка Oе IAV для микроинъекции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы, которые были показаны для заражения эмбрионов данио являются гриппа A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), гриппа A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), а также флуоресцентные репортер штамм вируса гриппа NS1-GFP 33. Подробная информация о APR8 и X-31, и других штаммов, можно найти в базе данных по гриппу Research
    1. Размножаются штамма NS1-GFP из IAV в куриные эмбрионы , как описано выше 34, 35. Сбор, аликвоты и титровать аллантоисной жидкости, содержащей Iav, и хранят при -80 ° С. Pre-титровали APR8 и X-31 вирусы могут быть приобретены на коммерческой основе.
      1. Непосредственно перед инфекцией, быстро таять аликвоту Iav в перчатке, а затем быстро поставить на лед, чтобы уменьшить потерю титра.
    2. Вирусный разведение
      1. При использовании APR8 или X-31 вирусы, разбавленные до 3,3 × 10 6 яиц инфекционная доза 50% (EID50) / мл в стерильной, ледяной PBS supplemтованный с 0,25% фенола красного (для облегчения визуализации) в колпаке с ламинарным потоком. Одновременно установить контроль, содержащий стерильный PBS с 0,25% фенола красного.
      2. При использовании НС1-GFP штамма 33, разбавляют до ~ 1,5 х 10 2 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на НЛ в стерильной, охлажденным льдом PBS , содержащий 0,25% фенола красного (для облегчения визуализации) в колпаке с ламинарным потоком. Одновременно установить элемент управления, содержащий аллантоисной жидкости из незараженных куриных яиц разбавленных как вируса в стерильной PBS с 0,25% фенола красного.
      3. Поддерживать Iav на льду, пока готов к использованию.
    3. раствор вируса пипеткой в ​​микроинъекции иглы с использованием microloader советы непосредственно перед использованием. Вставьте микроинъекции иглу в соответствующий держатель устройства для инъекций (например , MPPI-3 системы впрыска под давлением).
    4. При просмотре под стереомикроскопа, аккуратно обрезают кончик иглы микроинъекции с острыми, стерилизуют # 5 щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это рекоменDed, что кончик микроинъекции быть обрезано постепенно.
    5. Выжмите педаль системы впрыска под давлением и вводят в каплю микроскопа иммерсионного масла на калибровочный микрометра слайд. Измерьте диаметр капли. Рассчитать объем капли с помощью уравнения, V = 4 / 3πr 3, где V есть объем в NL и R является радиусом в мкм.
      Примечание: Если диаметр капель слишком мал, дополнительное стекло может быть обрезан или настройки давления и сроки могут быть скорректированы. Если диаметр капель слишком велик, параметры давления и времени может быть скорректирована.
    6. Настройка параметров давления и синхронизации инжектора под давлением и / или reclip кончик иглы, пока желаемый объем инъекции не достигается (обычно 1-3 NL). Параметры давления от 20 до 30 фунтов на квадратный дюйм и длительность импульса настройки между 40 и 80 мс типичны. Отрегулируйте обратное давление, так что счетчики капиллярное давление, но не протекает Iav (чистый нулевой давления).
  3. Совместите зародыши для инъекций
    1. Обезболить dechorionated эмбрионов в 200 мкг / мл Tricaine.
    2. После того, как движение прекращается, передача 10-20 эмбрионов в агарозном пластины 2% (полученного в разделе 2.3) с пластиковой пипеткой. Используйте пластиковую пипетку, чтобы удалить лишнюю жидкость.
    3. Аккуратно выровняйте эмбрионов для микроинъекции с огнем полированные и запечатаны боросиликатного стеклянного капилляра. Использование стереомикроскоп, аккуратно сориентировать эмбрионов , так что канал Кювье или задней кардинальной вены находится в соответствии с микроинъекции иглы (рис 1А).
  4. IAV Микроинъекция
    1. Аккуратно вставьте микроинъекции иглу в канал Кювье или задней кардинальной вены. Выжмите педаль , чтобы придать нужный объем IAV в кровеносную систему эмбриона (рис 1А). Эмбрионы могут быть введены более чем один раз, если это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: болюсное должен быть заметен в обращение и дистрибьютораделены по всему телу. Если вводимый объем собирает на месте инъекции, удалить эмбрион из эксперимента и эвтаназии.
    2. Инъекции повторяют на различных эмбрионов с контрольного раствора специфической для штамма вируса, выбранного. Для APR8 и X-31, используйте элемент управления, описанный в разделе 3.2.2.1; для NS1-GFP, используйте элемент управления, описанный в разделе 3.2.2.2.
  5. Перенос эмбрионов в меченых чашки Петри, содержащие стерильную воду яйца и место в инкубаторах при температуре 33 ° C.
    Примечание: Зараженные эмбрионы должны быть выращены при температуре 33 ° С, чтобы поддерживать усиленную репликацию вируса. Кроме того, инкубация при 33 ° С более близко имитирует температуру верхних дыхательных путей человека, который находится в тесном контакте с более низкими температурами во внешней среде и где происходят IAV инфекции. Эмбрионы могут акклиматизироваться в широком диапазоне температур 34.

4. Локализованный, плавательным пузырем IAV Инфекция в Tg (MPX: mCherry)

  1. Приготовление IAV для микроинъекции
    1. Развести NS1-GFP штамма и контрольного раствора для инъекций, как описано в разделе 3.2.
    2. Приготовьте иглы, как описано в разделе 2.2.
    3. Совместите Tg (пикс: mCherry) 35 личинок , содержащие завышенные плавательные пузыри , как описано в разделе 3.3 со следующим исключением. Align личинки таким образом , что игла может прокалывать плавательного пузыря , и вирус может быть вложенной в задней части плавательного пузыря, как описано выше 36 (фиг.2А).
  2. IAV Микроинъекция
    1. Аккуратно вставьте микроинъекции иглу в плавательном пузыре и придать желаемый объем (например , 5 NL) в направлении задней части структуры (рис 2А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: болюсное следует собирать в сторону задней и воздушный пузырь плавательный пузырь должен бе смещается вперед. выражение GFP должно начать наблюдаться у 3 ч после инъекции.
    2. Повторные инъекции с контрольного раствора специфической для штамма вируса, выбранного, как описано в разделе 3.4.2.
  3. Передача личинок в чашки Петри, содержащие стерильную воду яйца и место в инкубаторах при температуре 33 ° C.

5. Противовирусные наркологическая

Примечание: Протокол ниже описывает обработку занамивир ранее показанную в Габора и др. 19. Этот протокол может быть изменен, чтобы экранировать другие противовирусные препараты, и имеет потенциал, чтобы быть модифицирован для скрининга нескольких соединений в 96-луночный планшет, формат высокой пропускной способности.

  1. В 3 ч после заражения, заменить яйцо воду NS1-GFP- и контрольно-инфицированных рыб стерильной яичной воде, содержащей 0, 16.7 или 33.3 нг / мл занамивир.
    Примечание: Эти концентрации были выбраны для того, чтобы попытаться воспроизвести физиологические уровни, достигнутые FOllowing введение Занамивир у людей (100, 200 или 600 мг, внутривенно, два раза в день или 10 мг ингаляционных, два раза в день). Концентрации в сыворотке крови у больных человека колебалась от 9,83 до 45,3 нг / мл 36.
  2. В течение 5 дней, изменение яйце воды каждые 12 ч и заменить стерильной яичной водой, содержащей соответствующее количество Занамивир.
  3. Отслеживание хода инфекции.
    1. Обезболить данио в 200 мкг / мл Tricaine. Монитор экспрессии GFP с помощью стерео флуоресцентной микроскопии визуально наблюдать различия в характере инфекции между ИФО-инфицированных и контрольных рыб и среди рыб, погруженного в различных концентрациях препаратов.
    2. Отслеживание заболеваемости и смертности в течение 5 дней.
      1. Запись наблюдения о динамике инфекций, связанных с патологией заболевания, в том числе признаки вялости и признаков отека, различия в пигментации, окуляр и черепно-лицевых деформаций и лордоз. Болезнь патологиикак правило, становится очевидным, в контрольной зараженной рыбы на 24-48 ч после инъекции, в зависимости от количества вируса впрыскиваемого. Собирать изображения 24 ч после инъекции.
      2. Каждые 24 ч в течение 5 дней после заражения, записать число погибших, болезненного и здоровых личинок. Смерть определяется отсутствие различимой сердцебиение. Plot данные по своему усмотрению. Например, участок и данные в виде столбчатой ​​графа с процентами здоровых, болезненном или мертвой рыбы нанесены на оси у и группы обработки по оси х. 19
        Примечание: Смертность может быть забит оценками выживаемости Каплана-Мейера. В зависимости от применения, может быть целесообразным разработать альтернативные подходы к скоринг рыбьего заболеваемости, в том числе матрицы балльной которые могут количественно определить степень заболеваемости, основанные на вышеуказанных патологических особенностей, наблюдаемых.
      3. Проконсультируйтесь с статистиком, чтобы применить соответствующие статистические анализы.

6, Миграция Нейтрофильная

Примечание: Протокол ниже описан способ отслеживания миграции нейтрофилов в плавательном пузыре после локализованы, эпителиальной инфекции IAV. Описанные здесь методы могут быть модифицированы, чтобы проверить воздействие генетических и химических манипуляций. Используя эту технику, можно будет охарактеризовать механизмы, лежащие в основе поведения нейтрофильной во время инфекции IAV.

  1. Монтаж данио рерио для обработки изображений
    1. Обезболить личинок, которые будут отображены в концентрации 200 мкг / мл Tricaine.
    2. Передача индивидуального Tg (MPX: mCherry) личинку , который был заражен NS1-GFP в лунку 24 - луночного, стеклянную нижнюю пластину в небольшой капли яичного воды (~ 50-100 мкл). Повторите с другой ИФО-инфицированного и контрольных рыб.
    3. Медленно добавляют 1% агарозном эмбрион монтажных средств массовой информации для каждого (раздел 2.5) а, следя за тем, чтобы не вводить большие пузыри.
      1. Осторожно отрегулировать положение личинке таким образом, что он установлен на его стороне.Гуди и Генри 37 описывают , как сделать зонды , которые функционируют хорошо в этом приложении с помощью насекомых булавками, которые установлены в боросиликатного стекла капилляров с нитями и superglued на месте.
    4. После агарозном затвердевает, аккуратно заполнить отдельные лунки с яичным водой, содержащей 200 мкг / мл Tricaine.
    5. С помощью конфокальной микроскопии, захват Аз стека серии Светлое и флуоресцентных изображений с использованием объектива 20X сосредоточены на плавательном пузыре.
      1. Установить верхний и нижний пределы так, что они захватывают все визуально наблюдаемую зеленой и красной флуоресценции.
      2. Захват изображения на 2,0 микросекунды / пиксель с шагами, которые ≤ 4 мкм. Увеличение времени на пиксель и уменьшая расстояние между шагами (например , 0,5 - 1,0 мкм) повышает разрешение и качество изображения.
      3. Генерация двухмерного изображения путем слияния слоев.
      4. Сравните количество MPX-mCherry-положительных нейтрофилов настоящее время яп плавательного пузыри ИФО-инфицированного и управления впрыском данио.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При этом данные , показывающие , как системная инфекция IAV в данио может быть использован для проверки эффективности лекарственного средства (рисунок 1А) предусмотрены. Эмбрионы через 48 часов после оплодотворения инъецируют APR8 (Рисунки 1C, 1F), Х-31 (фигуры 1D, 1G) или NS1-GFP (фигуры 1H-1i) , через проток Кювье , чтобы инициировать вирусной инфекции. Еще одна когорта эмбрионов на 48 ч после оплодотворения вводили , чтобы служить в качестве контроля за вирусной инфекции (фиг.1В, 1E). К 48 ч после инфицирования, данио вводили IAV выставлены доказательства перикарда отека (рис 1C, 1D) и кровообращения (рис 1F), с эритроцитами , присутствующих во всем перикарда (рис 1G). Используя NS1-GFP, начальное экспрессию GFP с помощью флуоресцентной микроскопии в начале наблюдалось 3 часа после заражения. В этот момент данио подвергали воздействию 33,3 нг/ Мл доза ингибитора нейраминидазы занамивир. Эта доза составляет примерно эквивалентно 200 мг дозы, больным людям. Контроль инфицированных рыба не подвергается воздействию Занамивир (рис 1Н, 1Н ') выставлены признаки отека и системной экспрессии GFP. Снижение валовой патологии и флуоресценции GFP (фигуры 1I, 1И ') в NS1-GFP-инфицированных личинок подвержены Занамивир наблюдались. Снижение GFP был наиболее заметен в телах личинок, в то время как очень небольшое изменение наблюдалось в желтке мешочков. Рыба обрабатывают Занамивир выставлены меньше заболеваемости, о чем свидетельствует улучшение моторики плавания и пониженные уровни отека в сердце, и улучшение выживаемости. Эти результаты дополняют более всестороннее исследование 19 и показать ценность этой модели для скрининга лекарственных средств.

Локализованный модель 31 инфекция данио плавательного пузыря была адаптирована для IAV инфефикция. Вирус NS1-GFP вводили в заплыве пузырей после оплодотворения 5 г Tg (MPX: mCherry) личинок инициировать локализованный, эпителиальные инфекции (Рисунок 2А). PBS вводили в плавательном пузыре в качестве контроля, чтобы продемонстрировать специфичность набора нейтрофилов к ИФО-инфицированных клеток. Набор mCherry-меченых нейтрофилов в плавательном пузыре отслеживалась. В 20 ч после инфицирования, значительной миграции нейтрофилов в купальных пузырей ИФО-инфицированной рыбы по отношению к PBS инъецировали управления (рис 2B, 2B ', 2C, 2C') наблюдалась. Эти данные свидетельствуют о том, что ИФО могут привлекать нейтрофилы к плавательным пузырем, так же, как он вербует нейтрофилы в легких человека.

Рисунок 1
Рисунок 1: противовирусная лекарственная терапия уменьшает тяжесть IAV инфекции в данио. (A (B - I) Брутто патология и GFP флуоресценции эмбрионов данио инжектированных в канал Кювье с IAV. (BG) Рыба инфицированных IAV и исследовали на 48 ч после инфекции признаки вирусной инфекции и болезни. (B - D) Одиночные фокальные плоскости управления или ИФО-инфицированной рыбы были собраны (боковые, передний левый, спинные сверху, 4X увеличение, масштаб бар = 500 мкм). (B) рыбы контроля вводили PBS и отображать нормальную морфологию. (C - D) Эмбрионы , инфицированные APR8 (С) или Х-31 (D) обычно выставлены экссудативный отек (заполняется стрелка). Зародыши также имели некротические ткани, очевидной в (С). Рыба (E) управления вводили PBS и не проявляют никаких признаков патологии (масштаб бар = 250 мкм). (F) Эмбрионы инфицированных APR8 отображает остановки кровообращения (прорезью Arrowhead, масштаб бар = 250 мкм). (G) Эмбрион вводили X-31 отображает гриппа как перикарда отек (стрелка) и объединенное эритроцитов в течение перикарда (зубчатым Arrowhead, масштаб бар = 100 мкм). (H, I) Типичные изображения , показывающие влияние противовирусного препарата на ИФО-инфицированных данио (масштаб бар = 200 мкм). (H) Светлое и (Н ') флуоресценции изображение , показывающее эмбрион вводят с NS1-GFP (без противовирусное лечения наркозависимости). Обратите внимание на отек и экспрессию GFP, особенно в области вены общий кардинал. (I, I ') Лечение с помощью противовирусного препарата уменьшил Infectионов, о чем свидетельствует уменьшенной патологии, в том числе отеков, уменьшалась и уменьшалась экспрессии GFP в пределах белого пунктирного контура тела, в частности, в сосудистую систему, что свидетельствует о пониженной вирусной нагрузки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Нейтрофилы вербуются для сайтов локализованной инфекции IAV. (A) Схема демонстрирует инъекционной подход , необходимый для инициирования локализованной Iav инфекции в надутом данио плавательного пузыря на 5 г после оплодотворения. (B, C) Нейтрофильная набор в плавательном пузыре следующего NS1-GFP инфекции. Z-стека изображений (4 мкм шаги) были собраны с помощью конфокальной микроскопии (20х увеличение). Изображения были плоскимиtened в двух измерениях (боковые, передний левый, спинные сверху). Tg (MPX: mCherry) данио (5 d после оплодотворения) вводили (В, В ') аллантоисной жидкости , разбавленного PBS и 0,25% фенола красного или (C, C') NS1-GFP (7,2 × 10 2 БОЕ / эмбрион), разведенного в аллантоисной жидкости и PBS с 0,25% фенола красного. В 16 ч после инфекции, нейтрофилы присутствовали в ИФО-инфицированной плавательного пузыря (C, C ': зеленая флуоресценция показывает локализованную инфекцию; C': красные клетки нейтрофилы, белая стрелка идентифицирует представительную нейтрофильный). (В, В ') Нет доказательств экспрессии GFP , указывающего IAV инфекции и не рекрутингом нейтрофилов к плавательным пузырем наблюдалось у личинок , инъецированных аллантоисной жидкости в PBS. Плеаза нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для того, чтобы максимизировать выгоды, получаемые от использования мелких животных для моделирования человеческих хозяин-патоген взаимодействия, важно сформулировать вопросы исследования и тестирования гипотез, прописными буквами на преимущества, присущие модельной системы. В качестве модели для заражения человека IAV, то данио имеет ряд сильных сторон, в том числе высокой плодовитостью, оптической прозрачности, аменабельности скрининга лекарственных средств, а также наличие трансгенных линий, которые маркируют иммунные клетки, как нейтрофилы. Данио была разработана в качестве все более мощной альтернативой модельной системе мыши для изучения воспаления и врожденного иммунитета. Поскольку у них нет функционирования адаптивного иммунного ответа в течение первых 4-6 недель развития, данио горе врожденные иммунные реакции для защиты от травм и инфекции 37. В течение этого раннего периода в развитии, можно выделить и изучить механизмы противовирусного ответа, возникающего из врожденной иммунной реакции в одиночку. Тхиs работа способствовала развитию трансгенных данио линий как Tg (пикс: mCherry), который маркирует нейтрофилы с красным флуоресцентным белком.

Рыбок данио модели для IAV инфекции , которые напоминают заболевание человека недавно были описаны 19. Было показано, что данио обладают альфа-2,6-связанных остатков сиаловой кислоты на их клетки, которые обеспечивают IAV вирусы тропизм для связывания, прикрепить к нему, и входить в клетки. В этой рукописи и Габор и др. 19, было показано , что два различных штаммов IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] и Х-31 А / Aichi / 68 [H3N2]), а также рекомбинантный штамм НС1-GFP , что приводит к GFP перевод в инфицированных клетках, может инфицировать, репликации, и причиной смертности при введении в кровеносную систему личиночной данио рерио. Инъекция вируса имеет решающее значение для этого метода инфекции, так как воздействие IAV с помощью погружения не работает надежно. Зараженные рыба должна быть передачакрасный до 33 ° С инкубатор для обеспечения вирусной репликации. Важно отметить, что респираторного тракта человека, где происходят гриппозной инфекции, как правило, составляет 33 ° C. Инкубация при температуре 28 ° С, что более типично для температуры данио инкубации, не обеспечивает надежную инфекцию. Кроме того, важно, чтобы проверить каждую партию полученных от производителя или партии IAV производится перед использованием в эксперименте из-за изменчивости, которая влияет на прогрессирование инфекционности и заболевания в данио. Когда доза инфекционный правильно титровать, подавляющее большинство данио инфицированных этих штаммов IAV должны проявлять грубые фенотипы заболевания, типичными примерами отеком, а уже в 24 ч после инфекции, которые постепенно ухудшаются, краниофациальные нарушения по 48 ч после заражения, лордоз 72 ч после инфицирования, а также приблизительно 50% должны поддаваться инфекции 5 г после инфицирования. Гистологическое в 48 ч после инфекции должна включать доказательства Гилл, головы и почек,некроз печени, а также признаки жидкости в перикарде. При установлении этих выводов в качестве предсказуемого исхода инфекции IAV в данио, можно противогриппозных кандидатов лекарственное соединение кандидатов экран. Имея это в виду, протокол проверка и подтверждение принципа действия для скрининга противовирусный препарат , основанный на оригинальных находок , описанных в Габора и соавт. 19 демонстрируются. Используя ингибитор нейраминидазы занамивир, в дозе, которая прогнозируется, чтобы имитировать уровни, наблюдаемые в человеческой крови, замедленное начало заболеваемости и снижение смертности за счет явного влияния на вирусной репликации / распространения, как определено NS1-GFP флуоресценции наблюдалось. Данио модель IAV идеально подходит для умеренной до высокой пропускной способности экранов небольшой молекулы. Поскольку инфекции могут происходить только лишь через ручной инъекции в кровоток через проток Кювье или задней кардинальной вены, размеры экранов ограничены количеством технических специалистов Estabливающим инфекций и их умений в выполнении техники. Тем не менее, можно вводить по меньшей мере 200 эмбрионов данио за техником в час. В то время как успешно демонстрирует противовирусную активность для Занамивир в данио модели инфекции, следует признать , что скрининг лекарств во всех моделях на животных, в том числе данио, необходимо тщательно контролировать 38. Способ препарат абсорбируется и метаболизируется отличается от животного к животному, и трудно предсказать. Тем не менее, в качестве метода для скрининга новых противогриппозных препаратов, этот данио модель инфекция IAV представляет захватывающий возможность обследовать несколько тысяч малых молекул в организме животного с органами ортологичных для человека и с высокой сохранившегося интегративной физиологии.

В дополнение к модели для системной инфекции, данио также может служить моделью для локализованной инфекции , когда IAV впрыскивается в плавательном пузыре 19 21, 29, 30, 31. При правильном титруют, данио, которые заражены штаммом NS1-GFP на 5 г после оплодотворения должны демонстрировать доказательства точечными флуоресценции вокруг эпителии плавательного пузыря по 1 г после инфицирования. Используя эту локализованную стратегию инфекции, нейтрофилы поведение в ответ на инфекцию можно отследить. Как нейтрофилах человека, данио нейтрофилы являются основным посредником в сотовой врожденного иммунитета, функционирующий при острых реакций на повреждение ткани и инфекции и играет решающую роль в процессе хронического воспаления 24. Существует растущее признание того, что нейтрофилы играют ключевую роль в иммунной реакции на инфекцию гриппа. Действительно, стало очевидным, что функция нейтрофилы как "обоюдоострые шпаги" в опосредовании иммунного ответа. Whiле важное значение для противовирусного ответа , необходимого для управления гриппозной инфекции, нейтрофилы также способствуют чрезмерно воспалительной среде в легких , что может привести к повреждению тканей хозяина и повышает риск смертности 39, 40, 41, 42, 43. Существует значительное сохранение генов синтении между данио и геномов человека, и с этим Ортология, есть также значительный функционал сохранения в нейтрофильной биологии. Рыбок данио нейтрофилы имеют много сходства с нейтрофилами человека, в том числе полиморфного ядра, наличие первичных и вторичных гранул, а также функциональной миелопероксидазы и NADPH оксидазы 22. Кроме того, данио нейтрофилы могут поглощать бактерии и освободить нейтрофильных внеклеточных ловушек (НРТ) 44. Несколько трансгенные данио линии были developed , чтобы помочь идентифицировать и разграничить функции нейтрофилов биологии 27, 45, 46, 47. Этот протокол инфекция является гибким и может быть изменен, чтобы проверить несколько функций нейтрофильных, используя эти альтернативные средства. Это локализованная данио IAV модель инфекции позволяет вопросы, связанные с иммунной реакцией хозяина решать, и, в частности, те, опосредованными нейтрофилами.

Исследования , проведенные в модельных видах млекопитающих, дали ценную информацию 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, но несколько экспериментов в режиме реального времени с участием Iav инфекции часпр выполнены, ограничивая понимание сложного взаимодействия между компонентами позвоночной врожденного иммунного ответа у хозяина. За последнее десятилетие, использование данио системы модельных экспериментов на животных дала водораздел информации о хозяин-патоген взаимодействий 21, 47, 56, 57, а также предложил важную информацию в качестве инструмента для обнаружения наркотиков. Сочетание методов молекулярной и обработки изображений микроскопии позволили более глубокое понимание врожденных иммунных реакций , и как они проявляются в естественных условиях 17, 18, 27. Открытие того, что данио рерио могут быть инфицированы IAV 19, и что данио разделяет важные иммунологические сходства с системами млекопитающих, включая человека, открыл дверь в кабинетважного человеческого вирусного патогена. Описанные протоколы могут быть адаптированы к другим приложениям и имеют потенциал с получением критических открытий относительно хост-вирусных взаимодействий, которые могут иметь весьма серьезные клинические последствия для здоровья человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR 89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531 (2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715 (2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436 (2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378 (2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

Tags

Инфекция выпуск 119 данио Грипп Вирус врожденный иммунитет хозяин-патоген противовирусная лекарствах Нейтрофильная миграция
Использование данио рерио модели человеческого вируса гриппа А инфекций экрана противовирусных препаратов и характеризации иммунных клеток-хозяев ответов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, More

Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter