Introduction
De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), virus de la gripe infectan a un 5-10% de los adultos y un 20-30% de los niños al año y causan 3-5 millones de casos de enfermedades graves y hasta 500.000 muertes en todo el mundo 1. vacunas anuales contra la gripe siguen siendo la mejor opción para prevenir la enfermedad. Esfuerzos como el Plan de Acción Mundial de la OMS han aumentado el uso de la vacuna estacional, la capacidad de producción de vacunas, y la investigación y el desarrollo de estrategias de vacunas más potentes con el fin de reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas con brotes de gripe estacional 2. Los medicamentos antivirales como inhibidores de la neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir y oseltamivir) están disponibles en algunos países y han demostrado ser eficaces en los síntomas atenuantes, cuando se administra dentro de las primeras 48 h de inicio 3, 4, 5. A pesar de los esfuerzos mundiales, la contención de la gripe estacional outbreaks sigue siendo un desafío formidable en este momento, como el virus de la gripe deriva antigénica a menudo excede capacidades actuales para adaptarse a la genoma cambio de virus 6. estrategias de vacunas dirigidas a nuevas cepas del virus deben ser desarrolladas con antelación y, a veces se vuelven menos de una eficacia óptima debido a los cambios imprevistos en los tipos de cepas que eventualmente predominan en una temporada de gripe. Por estas razones, existe una clara necesidad de desarrollar estrategias terapéuticas alternativas para contener las infecciones y la reducción de la mortalidad. En el logro de una mejor comprensión de la interacción huésped-virus, puede ser posible desarrollar nuevos medicamentos anti-influenza y terapias adyuvantes 7, 8.
El anfitrión de la influenza humana A la interacción del virus (IAV) es compleja. Varios modelos animales de infección IAV humana se han desarrollado con el fin de profundizar en la interacción huésped-virus, INCLUYENDOing ratones, cobayas, ratas del algodón, hámsters, hurones y los macacos 9. Mientras que proporciona datos importantes que han mejorado la comprensión de la dinámica de host-IAV, cada organismo modelo posee inconvenientes importantes que deben ser considerados cuando se trata de traducir los hallazgos en la medicina humana. Por ejemplo, los ratones, que son el modelo más ampliamente utilizado, no desarrollan síntomas de la infección fácilmente inducidas por IAV cuando están infectadas con la gripe humana aísla 9. Esto se debe a que los ratones carecen del tropismo natural para la gripe humana aísla ya que las células epiteliales de ratón expresan alfa-2,3 vínculos de ácido siálico en lugar de los α-2,6 vínculos de ácido siálico expresadas en las células epiteliales humanas 10. Las proteínas hemaglutinina presentes en las cepas humanas IAV favorable se unen y entran en las células anfitrionas teniendo vínculos de ácido siálico alfa-2,6 través de endocitosis mediada por receptor 9, 11, 12, 13. Como consecuencia, ahora se acepta que en el desarrollo de modelos de ratón de la influenza humana, se debe tener cuidado para emparejar la cepa apropiada de ratón con la cepa de la gripe apropiada con el fin de lograr fenotipos de la enfermedad que recapitular aspectos de la enfermedad humana. En contraste, las células epiteliales en el tracto respiratorio superior de los hurones poseen 2,6 a-vínculos de ácido siálico que se asemejan a las células humanas 14. Hurones infectados comparten muchas de las características patológicas y clínicas observadas en la enfermedad humana, incluyendo la patogenicidad y la transmisibilidad de los virus de la gripe humana y aviar 14, 15. También son altamente susceptibles a los ensayos de eficacia de vacunas. Sin embargo, el modelo de hurón para la influenza humana tiene varias desventajas, principalmente relacionados con su tamaño y el costo de la cría que hacen adquisición de estadísticamente signifilos datos de peralte desafiantes. Además, los hurones han mostrado previamente diferencias en la farmacocinética de fármacos, biodisponibilidad y toxicidad que hacen probar la eficacia difícil. Por ejemplo, los hurones presentan toxicidad para el canal iónico M2 amantadina inhibidor 16. Por lo tanto, es evidente que en la elección de un modelo animal para estudiar preguntas sobre infecciones IAV humanos, es importante tener en cuenta sus ventajas y limitaciones inherentes, y el aspecto de la interacción huésped-virus que se encuentra bajo investigación.
El pez cebra, Danio rerio, es un modelo de animal que proporciona oportunidades únicas para la investigación de la infección microbiana, el anfitrión de la respuesta inmune, y las posibles terapias de drogas 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <SUP = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. La presencia de ácidos siálicos unidos a α-2,6 en la superficie de células en el pez cebra sugirió su susceptibilidad a la IAV, que fue confirmada en estudios de infección y la imagen in vivo usando una cepa fluorescente reportero de IAV 19. En el pez cebra infectados por el IAV, aumento de la expresión de los ifnphi1 y MXA transcripciones antivirales indicó que una respuesta inmune innata había sido estimulado, y la patología que se muestra por pez cebra infectados por el IAV, incluyendo edema y la destrucción del tejido, fue similar a la observada en las infecciones de la gripe humana . Por otra parte, el inhibidor de la neuraminidasa antiviral Zanamivir mortalidad limitada IAV y la reducción de la replicación viral en el pez cebra 19.
En este informe, un protocolo para el sistema de iniciacióninfecciones ic IAV en embriones de pez cebra se describe. El uso de zanamivir a dosis clínicamente relevantes como una prueba de principio, la utilidad de este modelo de pez cebra infección IAV para el cribado de compuestos para la actividad antiviral se demuestra. Además, un protocolo para la generación de una infección IAV localizada, epitelial en el pez cebra nadar vejiga, un órgano que se considera que es anatómica y funcionalmente análoga a la de pulmón de mamífero 21, 29, 30, 31, se describe. El uso de este modelo de infección IAV localizada, el reclutamiento de neutrófilos al sitio de la infección se puede seguir, lo que permite las investigaciones sobre el papel de la biología de los neutrófilos en la infección IAV y la inflamación. Estos modelos de pez cebra complementan modelos animales existentes de infecciones IAV humanos y son particularmente útiles para el ensayo de moléculas pequeñas y respuestas de las células inmunitarias debido a la posibilidad de una mayor sATOS ESTADÍSTICOS potencia, capacidad de moderada a ensayos de alto rendimiento, y las habilidades para rastrear el comportamiento celular inmune y la función con la luz-microscopía.
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Protocol
Todo el trabajo debe realizarse con nivel de bioseguridad 2 (o BSL2) normas descritas por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) y de conformidad con las directrices establecidas por Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités (IACUC). Por favor, consultar con los funcionarios adecuados para garantizar la seguridad y el cumplimiento.
1. El pez cebra Cuidado y mantenimiento
- Desovar pez cebra y recoger el número necesario de embriones para los experimentos. Cuando sea necesario, los tanques de cría en masa, como los descritos por Adatto et al. 32, se puede emplear para recoger un gran número de embriones por etapas de desarrollo.
- Permitir que los embriones se desarrollen hasta la fase deseada del desarrollo (48 horas después de la fertilización para una infección sistémica IAV [artículo 3] o 5 días después de la fertilización para una infección de la vejiga localizada, nadar [artículo 4]) en platos profundos de Petri de baja densidad (< 100 embriones / placa) a 28 ° C en agua estéril que contiene el huevo 60 mg / ml de sal de mar (por ejemplo, Instant Ocean) en agua destilada.
- Retire embriones muertos con pipetas de transferencia de plástico y cambie el huevo diario de agua para asegurar la salud y el desarrollo óptimos.
2. Preparación de Materiales y Reactivos
- Preparar una solución de 4 mg / ml de stock de tricaína-S (ajustar el pH a 7,0-7,4) en agua destilada y se autoclave. Almacenar a 4 ° C.
- Tire capilares de vidrio borosilicato con filamentos utilizando un extractor de micropipeta (por ejemplo Micropipeta Tirador con la siguiente configuración: ajuste de presión = 100, el calor = 550, tire = [valor], velocidad = 130, tiempo = 110).
NOTA: Antes de recorte de la aguja, la longitud desde donde la aguja comienza a disminuir a la punta de la aguja sería de aproximadamente 12 a 15 mm. Esto puede variar, sin embargo, basándose en las preferencias y la aplicación. A, conicidad más gradual más largo puede ser más preferible debido a la mayor capacidad de perforar el embrión y el reducido risk de la flexión de la aguja o de ruptura. - Derretir 2 g de agarosa en agua de huevo 100 ml usando un horno de microondas. Hacer placas en los que alinear e inyectar los embriones por vertido funde de agarosa en placas de Petri profundas y permitiendo que se solidifique.
- Hacer a 10 mg / ml de solución madre de zanamivir en agua libre de nucleasa. Alícuota y se congelan a -20 ° C.
- Derretir 0,5 g de agarosa en agua de huevo 50 ml usando un horno de microondas para hacer embriones de montaje de agarosa. Mantener en el baño de agua a 50 ° C hasta que esté listo para usar durante la exploración.
3. sistémica IAV infección (48 horas después de la fecundación)
PRECAUCIÓN: Todo el personal de investigación deben consultar con sus supervisores y médicos con respecto a la vacunación antes de iniciar el trabajo con IAV.
- dechorionate manualmente embriones en el día del experimento usando # 5 fórceps. Tenga cuidado de eliminar la eutanasia y los embriones que han sido heridos en el proceso en 200 g solución Tricaína / ml.
- preparación df IAV para la microinyección
NOTA: Las cepas que se han demostrado para infectar embriones de pez cebra son la influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), y el indicador fluorescente cepa de la gripe NS1-GFP 33. Los detalles sobre APR8 y X-31, y otras cepas, se pueden encontrar en la base de datos de investigación Influenza- Propagar la cepa NS1-GFP de IAV en huevos embrionados de pollo como se ha descrito previamente 34, 35. Recoger, alícuota, y titule el fluido alantoideo que contiene IAV, y se almacena a -80 ° C. Pre-titularon APR8 y X-31 virus se pueden adquirir comercialmente.
- Justo antes de la infección, descongelar rápidamente una alícuota IAV en las manos enguantadas y luego se coloca rápidamente en hielo para reducir la pérdida de título.
- dilución viral
- Si el uso de los APR8 o X-31 virus, se diluye hasta 3,3 x 10 6 huevos dosis infectiva 50% (EID50) / ml en, suplem helada PBS estérilentados con 0,25% de rojo fenol (para ayudar en la visualización) en una campana de flujo laminar. Al mismo tiempo establecer un control que contenía PBS estéril con un 0,25% de rojo fenol.
- Si se utiliza NS1-GFP cepa 33, diluir a ~ 1,5 x 10 2 unidades formadoras de placas (UFP) por nl en, PBS que contenía enfriado con hielo rojo fenol 0,25% estéril (para ayudar en la visualización) en una campana de flujo laminar. Al mismo tiempo establecer un control que contiene el fluido alantoideo de huevos de gallina no infectadas diluido como el virus en PBS estéril con un 0,25% de rojo fenol.
- Mantener IAV en hielo hasta que esté listo para su uso.
- solución de virus de la pipeta de microinyección en agujas que utilizan puntas Microloader justo antes de su uso. Insertar la aguja de microinyección en el soporte apropiado del aparato de inyección (por ejemplo, sistema de inyección de presión MPPI-3).
- Mientras ve bajo el microscopio estereoscópico, el clip suavemente la punta de la aguja de microinyección con afilados, esterilizada # 5 pinzas.
NOTA: Es recoded que la punta microinyección ser recortado gradualmente. - Presione el pedal del sistema de inyección a presión e inyectar en una gota de aceite de inmersión microscopio en un portaobjetos de calibración del micrómetro. Medir el diámetro de la gota. Calcular el volumen de la gota utilizando la ecuación, V = 4 / 3πr 3, donde V es el volumen en nl y r es el radio en micras.
NOTA: Si el diámetro de la gota es demasiado pequeño, vidrio adicional puede ser cortada, o ajustes de presión y de temporización se puede ajustar. Si el diámetro de la gota es demasiado grande, ajustes de presión y de tiempo se pueden ajustar. - Ajustar la configuración de presión y de tiempo en el inyector de presión y / o Reclip la punta de la aguja hasta que el volumen de inyección deseado se alcanza (típicamente 1-3 nl). Los ajustes de presión entre 20 y 30 psi configuración y duración del pulso entre 40 y 80 ms son típicos. Ajustar la presión de retorno de modo que contrarresta la presión capilar, pero no se escapa IAV (neto presión cero).
- Propagar la cepa NS1-GFP de IAV en huevos embrionados de pollo como se ha descrito previamente 34, 35. Recoger, alícuota, y titule el fluido alantoideo que contiene IAV, y se almacena a -80 ° C. Pre-titularon APR8 y X-31 virus se pueden adquirir comercialmente.
- Alinear embriones para Inyección
- Anestesiar a los embriones dechorionated en 200 g / ml Tricaína.
- Una vez que cesa el movimiento, la transferencia de embriones 10-20 a una placa de agarosa al 2% (preparado en el apartado 2.3) con una pipeta de plástico. Utilice una pipeta de plástico para eliminar el exceso de líquido.
- alinee con cuidado los embriones para la microinyección con un capilar de vidrio de borosilicato sellados al fuego pulido y. El uso de un microscopio estereoscópico, los embriones suavemente orientar de manera que el conducto de Cuvier o la vena cardinal posterior está en línea con la aguja de microinyección (Figura 1A).
- La microinyección IAV
- Suavemente inserte la aguja de microinyección en el conducto de Cuvier o la vena cardinal posterior. Presione el pedal para inyectar el volumen deseado de IAV en el sistema circulatorio del embrión (Figura 1A). Los embriones se pueden inyectar más de una vez si es necesario.
NOTA: El bolo de inyección debe ser barrido en la circulación y distribbuido por todo el cuerpo. Si el volumen de inyección se acumula en el sitio de la inyección, retire embrión a partir de la experimentación y la eutanasia a. - Repetir las inyecciones en diferentes embriones con solución de control específica para la cepa del virus elegido. Para APR8 y X-31, utilice el control descrito en el apartado 3.2.2.1; para la NS1-GFP, utilice el control descrito en el apartado 3.2.2.2.
- Suavemente inserte la aguja de microinyección en el conducto de Cuvier o la vena cardinal posterior. Presione el pedal para inyectar el volumen deseado de IAV en el sistema circulatorio del embrión (Figura 1A). Los embriones se pueden inyectar más de una vez si es necesario.
- embriones de transferencia a placas de Petri marcadas que contienen agua estéril huevo y el lugar en incubadoras a 33 ° C.
NOTA: Infected embriones deben ser cultivadas a 33 ° C para apoyar la replicación viral mejorada. Además, la incubación a 33 ° C imita más de cerca la temperatura del tracto respiratorio superior humano, que está en estrecho contacto con las temperaturas más bajas en el ambiente externo y es donde se producen infecciones IAV. Los embriones pueden aclimatarse a un amplio rango de temperatura de 34.
4. localizada, Vejiga natatoria IAV infección en Tg (mpx: mCherry)
- Preparación de IAV para la microinyección
- Diluir la solución de inyección tensión y control de NS1-GFP como se describe en la sección 3.2.
- Preparar agujas como se describe en la sección 2.2.
- Alinear Tg (mpx: mCherry) 35 larvas que contiene vejigas natatorias inflados como se describe en la sección 3.3 con la siguiente excepción. Alinear larvas de tal manera que la aguja puede perforar la vejiga natatoria y el virus puede ser depositado en la parte posterior de la vejiga natatoria, como se describió anteriormente 36 (Figura 2A).
- La microinyección IAV
- Suavemente inserte la aguja de microinyección en la vejiga natatoria e inyectar el volumen deseado (por ejemplo 5 nl) hacia la parte posterior de la estructura (Figura 2A).
NOTA: El bolo inyección debe recoger hacia el posterior y la burbuja de aire de la vejiga natatoria debe be desplazado hacia delante. La expresión de GFP debe comenzar a ser observados a las 3 horas después de la inyección. - Repetir las inyecciones con solución de control específica para la cepa del virus elegido, como se describe en el apartado 3.4.2.
- Suavemente inserte la aguja de microinyección en la vejiga natatoria e inyectar el volumen deseado (por ejemplo 5 nl) hacia la parte posterior de la estructura (Figura 2A).
- Transferir las larvas a placas de Petri que contenían agua estéril huevo y el lugar en incubadoras a 33 ° C.
5. Antiviral Drug Treatment
NOTA: El protocolo siguiente se describe el tratamiento Zanamivir anteriormente se muestra en la Gabor et al. 19. Este protocolo puede ser modificado para la pantalla de otros medicamentos antivirales y tiene el potencial de ser modificado para detectar múltiples compuestos en una placa de 96 pocillos, formato de alto rendimiento.
- A las 3 horas después de la infección, reemplazar el agua de huevo de NS1-GFP y control de los peces infectados con agua estéril que contiene el huevo 0, 16.7, o 33.3 ng / ml zanamivir.
NOTA: Estas concentraciones fueron elegidos con el fin de tratar de replicar los niveles fisiológicos obtenidos foadministración llowing de Zanamivir en pacientes humanos (100, 200, o 600 mg, iv, dos veces al día o 10 mg inhalados, dos veces al día). Las concentraciones en suero en pacientes humanos variaron desde 9,83 hasta 45,3 ng / ml 36. - En el transcurso de 5 días, cambiar el agua huevo cada 12 horas y reemplazar con agua estéril que contiene el huevo la cantidad apropiada de zanamivir.
- Realizar un seguimiento del curso de la infección.
- Anestesiar el pez cebra en 200 g / ml Tricaína. Monitor de la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia estéreo para observar visualmente diferencias en los patrones de infección entre los peces infectados-IAV y control y entre los peces inmerso en las diferentes concentraciones de fármacos.
- Seguimiento de la morbilidad y la mortalidad en el transcurso de 5 días.
- Registra las observaciones acerca de la dinámica de infección relacionados con la patología de la enfermedad, incluidos los signos de letargo y la evidencia de edema, las diferencias en la pigmentación ocular, y deformidades craneofaciales, y lordosis. patología de la enfermedadtípicamente se hace evidente en los peces infectados de control a las 24-48 horas después de la inyección, dependiendo de la cantidad de virus inyectado. Recoge imágenes de 24 horas después de la inyección.
- Cada 24 horas durante 5 días después de la infección, registrar el número de larvas muertas, morbosa, y saludable. La muerte se define por la ausencia de un latido del corazón perceptible. Trazar datos si lo deseas. Por ejemplo, los datos de la trama como un gráfico de barras apiladas, con porcentajes de peces sanos, mórbida, o muertos representan en el eje y, y el grupo de tratamiento en el eje x. 19
NOTA: Las mortalidades pueden ser anotados por las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier. Dependiendo de la aplicación, puede ser apropiado para desarrollar enfoques alternativos para la morbilidad peces de puntuación, incluyendo una matriz de puntuación que pueden cuantificar los grados de morbilidad en base a las características patológicas mencionadas anteriormente observados. - Consulte con un experto en estadística para aplicar los análisis estadísticos apropiados.
6. la migración de neutrófilos
NOTA: El protocolo siguiente se describe un método para el seguimiento de la migración de neutrófilos a la vejiga natatoria después de una infección localizada, epitelial IAV. Los métodos descritos pueden ser modificados para probar los efectos de las manipulaciones genéticas y químicas. Usando esta técnica, será posible caracterizar los mecanismos subyacentes comportamiento de neutrófilos durante una infección IAV.
- Montaje de pez cebra de la Imagen
- Anestesiar a las larvas de obtener imágenes en 200 g / ml Tricaína.
- Transferir un individuo Tg (mpx: mCherry) larva que ha sido infectado con NS1-GFP a un pozo de un 24 pocillos, placa de fondo de cristal en una pequeña gota de agua de huevo (~ 50-100 l). Repetir con otros peces IAV-infectada y control.
- Poco a poco agregue 1% de agarosa al embrión medios de montaje para cada uno (sección 2.5) y, teniendo cuidado de no introducir burbujas grandes.
- Ajuste cuidadosamente la posición de la larva de modo que se monta en su lado.Goody y Henry 37 describen cómo hacer que las sondas que funcionan bien en esta aplicación utilizando pasadores de insectos que se montan en capilares de vidrio borosilicato con filamentos y superglued en su lugar.
- Una vez que la agarosa se endurece, llenar con cuidado los pocillos individuales con agua huevo que contiene 200 mg / ml Tricaína.
- Con un microscopio confocal, la captura az serie pila de campo claro y fluorescencia imágenes utilizando un objetivo 20X se centró en la vejiga natatoria.
- Establecer los límites superior e inferior de forma que capturen toda la fluorescencia verde y roja visiblemente observable.
- Capturar imágenes en 2.0 microsegundos / píxel con pasos que son ≤ 4 micras. El aumento del tiempo por píxel y la reducción de la distancia entre los pasos (por ejemplo, 0,5 - 1,0 micra) aumenta la resolución de la imagen y la calidad.
- Generar una imagen en dos dimensiones mediante la fusión de las capas.
- Comparar el número de neutrófilos mpx-mCherry-positivas presentes in las vejigas natatorias de pez cebra IAV-infectada y se inyecta el control.
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Representative Results
Aquí, se proporcionan datos que muestran cómo la infección sistémica IAV en el pez cebra se puede utilizar para probar la eficacia del fármaco (Figura 1A). Los embriones en 48 horas después de la fertilización se inyectan con APR8 (figuras 1C, 1F), X-31 (figuras 1D, 1G), o NS1-GFP (Figuras 1H-1i) a través del conducto de Cuvier para iniciar una infección viral. Otra cohorte de embriones en 48 horas después de la fertilización se inyectaron para servir como controles para la infección viral (figuras 1B, 1E). Por 48 horas después de la infección, el pez cebra inyectados con IAV exhibió evidencia de edema pericárdico (figuras 1C, 1D) y paro circulatorio (Figura 1F), con los eritrocitos presentes en todo el pericardio (Figura 1G). Uso de NS1-GFP, la expresión inicial de GFP mediante microscopía de fluorescencia tan pronto como se observó después de la infección 3 hr. En ese momento, el pez cebra fueron expuestos a una ng 33,3/ Ml de dosis del inhibidor de la neuraminidasa zanamivir. Esta dosis es aproximadamente equivalente a la dosis de 200 mg se administra a pacientes humanos. Control de peces infectados no expuesto a Zanamivir (Figuras 1H, 1H ') exhibió características de edema y la expresión de GFP sistémica. Se observó patología macroscópica reducida y GFP fluorescencia (Figuras 1I, 1I ') en las larvas infectadas con NS1-GFP expuesto a zanamivir. La reducción de la GFP fue más notable en los cuerpos de las larvas, mientras que se observó muy poco cambio en las bolsas de la yema. Peces tratados con Zanamivir exhibió menos morbilidad, como lo demuestra la mejora de la motilidad natación y niveles de edema reducida en el corazón, y la supervivencia mejorada. Estos resultados complementan un estudio más exhaustivo y 19 muestran el valor de este modelo para la detección de drogas.
Un modelo de pez cebra infección de la vejiga natatoria localizado 31 ha sido adaptado para IAV infección. Virus NS1-GFP se inyectó en las vejigas natatorias de post-fertilización 5 d Tg (mpx: mCherry) larvas para iniciar una localizada, infección epitelial (Figura 2A). PBS se inyectó en la vejiga natatoria como control para demostrar la especificidad de reclutamiento de neutrófilos hacia las células infectadas por el IAV. fue localizado el reclutamiento de neutrófilos marcados con mCherry en la vejiga natatoria. En 20 horas después de la infección, la migración considerable de neutrófilos en las vejigas natatorias de pescado infectada con IAV respecto a los controles inyectados con PBS (Figuras 2B, 2B ', 2C, 2C') se observó. Estos datos demuestran que IAV puede reclutar neutrófilos a la vejiga natatoria, al igual que recluta neutrófilos en el pulmón humano.
Figura 1: tratamiento con medicamentos antivirales reduce la severidad de la infección IAV en el pez cebra. (A (B - I) anatomía patológica macroscópica y la fluorescencia de GFP de los embriones de pez cebra inyectados en el conducto de Cuvier con IAV. (BG) Los peces infectados con IAV y examinó a las 48 horas después de la infección para detectar signos de infección viral y la enfermedad. (B - D) planos focales individuales de control o peces infectados-IAV se recogieron (montaje lateral, anterior izquierda, la parte superior dorsal, magnificación 4X, barra de escala = 500 micras). (B) los peces control fueron inyectados con PBS y muestran una morfología normal. (C - D) Los embriones infectados con APR8 (C) o X-31 (D) comúnmente exhibido edema pericárdico (flecha lleno). Los embriones también tenían tejido necrótico, evidente en (C). Peces (E) control fueron inyectados con PBS y no muestran evidencia de patología (barra de escala = 250 micras). (F) Los embriones infectados con APR8 muestra paro circulatorio (punta de flecha con muescas, barra de escala = 250 micras). (G) de embriones inyectados con X-31 muestra la gripe ambos edema pericárdico (flecha) y eritrocitos agrupados en todo el pericardio (punta de flecha con muescas, barra de escala = 100 m). (H, I) Imágenes representativas que muestran los efectos de un fármaco antiviral en el pez cebra infectados por el IAV (barra de escala = 200 micras). (H) de campo claro y (H ') de imágenes de fluorescencia que muestra un embrión inyectado con NS1-GFP (sin tratamiento de drogas antiviral). Observe edema y la expresión de GFP especialmente en la región de la vena cardinal común. (I, I ') El tratamiento con un fármaco antiviral reduce la habilidad de infectarion, como se evidencia por la patología reducida, incluyendo edema disminuido, y la expresión de GFP disminuido dentro del blanco esquema rayado del cuerpo, particularmente en la vasculatura, lo que es indicativo de la carga viral reducida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los neutrófilos son reclutados a los sitios de infección localizada IAV. (A) Esquema de demostración del enfoque de inyección necesaria para iniciar una infección IAV localizada en una vejiga natatoria del pez cebra inflado a las 5 d después de la fertilización. (B, C) de neutrófilos reclutamiento a la vejiga natatoria después de la infección NS1-GFP. imágenes Z-Stack (4 micras pasos) se recogieron mediante microscopía confocal (20X). Imágenes se mantuvieron establestened en dos dimensiones (montaje lateral, anterior izquierda, la parte superior dorsal). Tg (mpx: mCherry) pez cebra (5 d después de la fertilización) se inyectaron con (B, B ') de fluido alantoideo se diluye con PBS y 0,25% de fenol rojo o (C, C') NS1-GFP (7,2 × 10 2 PFU / embrión) diluido en fluido alantoideo y PBS con 0,25% de rojo de fenol. A las 16 horas después de la infección, los neutrófilos estaban presentes en una vejiga natatoria infectada por el IAV (C, C ': la fluorescencia verde muestra infección localizada; C': glóbulos rojos son los neutrófilos, flecha blanca identifica neutrófilos representante). (B, B ') No hay pruebas de la expresión de GFP indicativo de infección IAV y no reclutamiento de neutrófilos a la vejiga natatoria se observó en las larvas inyectado con el fluido alantoideo en PBS. Please clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para maximizar los beneficios obtenidos por el uso de un pequeño animal para modelar las interacciones huésped-patógeno humano, es importante formular preguntas e hipótesis de investigación prueba que aprovechan las ventajas inherentes del sistema modelo. Como modelo para la infección IAV humana, el pez cebra tiene varios puntos fuertes, incluyendo una alta fecundidad, la claridad óptica, receptividad en la detección de drogas, y la disponibilidad de líneas transgénicas que etiquetan las células inmunes como los neutrófilos. El pez cebra se ha desarrollado como un cada vez más poderosa alternativa al sistema de modelo de ratón para el estudio de la inflamación y la inmunidad innata. Porque carecen de una respuesta inmune adaptativa funcionando durante las primeras 4-6 semanas de desarrollo, montaje en el pez cebra respuesta inmune innata para proteger contra las lesiones y la infección 37. Durante este período temprano en el desarrollo, es posible aislar y estudiar los mecanismos de la respuesta antiviral derivados de la respuesta inmune innata solo. This obra ha sido facilitado por el desarrollo de líneas de pez cebra transgénico como Tg (mpx: mCherry), que las etiquetas de los neutrófilos con una proteína fluorescente de color rojo.
Modelos de pez cebra para la infección IAV que se asemejan a la enfermedad humana se describieron recientemente 19. Se demostró que el pez cebra posee residuos de ácido siálico-2,6-alfa vinculados en sus células que proporcionan IAV virus del tropismo para unir, conectar, y entrar en las células. En este manuscrito y de Gabor et al. 19, se ha demostrado que dos cepas diferentes de IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] y X-31 A / Aichi / 68 [H3N2]), así como la cepa recombinante NS1-GFP que resulta en GFP traducción en las células infectadas, podría infectar, replicarse, y las causas de mortalidad cuando se inyecta en el sistema circulatorio de larvas de pez cebra. La inyección de la virus es crítico para este método de la infección, como la exposición a IAV a través de la inmersión no funciona de forma fiable. Los peces infectados deben ser transferenciarojo a un 33 ° C incubadora para asegurar la replicación viral. Es importante señalar que el tracto respiratorio humano, en donde se producen infecciones de gripe, es típicamente 33 ° C. La incubación a 28 ° C, que es más típico de temperatura para la incubación de pez cebra, no puede producir una infección fiable. Además, es esencial para poner a prueba cada lote recibido del fabricante o lote de IAV produce antes de su uso en un experimento debido a la variabilidad que afecta a la infectividad y la progresión de la enfermedad en el pez cebra. Cuando la dosis infectiva se valora correctamente, la gran mayoría de pez cebra infectadas con estas cepas de IAV debe exhibir fenotipos de la enfermedad brutos tipificados por el edema, tan pronto como 24 horas después de la infección, que empeoran progresivamente, anomalías craneofaciales por 48 horas después de la infección, lordosis por 72 horas después de la infección, y aproximadamente el 50% debe sucumbir a la infección por 5 días post-infección. Histopatología a las 48 horas después de la infección debe incluir evidencia de enmalle, riñón cabeza, ynecrosis hepática, así como indicaciones de líquido en el pericardio. En el establecimiento de estos resultados como el resultado predecible de una infección IAV en el pez cebra, es posible candidatos pantalla anti-influenza candidatos compuesto de fármaco. Con esto en mente, un protocolo de prueba de principio para la selección de un fármaco antiviral basada en los hallazgos originales descritos en Gabor et al. 19 son demostradas. Uso del inhibidor de la neuraminidasa Zanamivir, a una dosis que se prevé para imitar los niveles observados en la sangre humana, retraso en la aparición de la morbilidad y redujo la mortalidad a través de un efecto aparente sobre la replicación viral / propagación, como se determina por fluorescencia NS1-GFP, se observó. El modelo de pez cebra IAV es ideal para pantallas de moderada a moléculas pequeñas de alto rendimiento. Debido a que las infecciones pueden ocurrir solamente sólo a través de la inyección manual en la circulación a través del conducto de Cuvier o vena cardinal posterior, el tamaño de las pantallas están limitados por el número de técnicos Estabconstitutivos de las infecciones y sus competencias en la realización de la técnica. Sin embargo, es posible inyectar al menos 200 embriones de pez cebra por técnico por hora. Mientras éxito en demostrar la actividad antiviral para Zanamivir en un modelo de infección pez cebra, hay que reconocer que la detección de drogas en todos los modelos animales, incluyendo el pez cebra, debe controlarse cuidadosamente 38. La forma en que un fármaco se absorbe y metaboliza difiere de animal a animal, y es difícil de predecir. Sin embargo, como un método para la detección de nuevos fármacos anti-influenza, este modelo de pez cebra infección IAV presenta una excelente oportunidad para examinar muchos miles de moléculas pequeñas en un animal con órganos ortólogos a los humanos y con la fisiología integrativa altamente conservadas.
Además de ser un modelo para la infección sistémica, el pez cebra también puede servir como un modelo para la infección localizada cuando IAV se inyecta en la vejiga natatoria 19 21, 29, 30, 31. Cuando titula de forma inadecuada, el pez cebra que están infectados con la cepa NS1-GFP a las 5 d después de la fertilización debe mostrar evidencia de fluorescencia punteada alrededor del epitelio de la vejiga natatoria por 1 d después de la infección. Usando esta estrategia infección localizada, el comportamiento de neutrófilos en respuesta a la infección puede ser rastreado. Al igual que los neutrófilos humanos, neutrófilos pez cebra son un mediador celular principal en la inmunidad innata, que funciona durante las respuestas agudas a la lesión tisular y la infección y jugando un papel crítico durante la inflamación crónica 24. Hay un creciente reconocimiento de que los neutrófilos desempeñan un papel crucial en la respuesta inmune a la infección por influenza. De hecho, se ha hecho evidente que la función de los neutrófilos como "armas de doble filo" en la mediación de la respuesta inmune. WHILe esencial para la respuesta antiviral necesario para controlar las infecciones de gripe, los neutrófilos también contribuyen a un ambiente excesivamente inflamatoria en el pulmón que puede dañar los tejidos del huésped y aumentar el riesgo de mortalidad 39, 40, 41, 42, 43. Existe una considerable conservación de synteny gen entre el pez cebra y los genomas humanos, y con esta orthology, también existe la conservación funcional significativa en la biología de los neutrófilos. Neutrófilos pez cebra tienen muchas similitudes con los neutrófilos humanos, incluyendo un núcleo polimórfico, la presencia de gránulos primarios y secundarios, y la mieloperoxidasa funcional y NADPH oxidasa 22. Además, los neutrófilos de pez cebra pueden fagocitar las bacterias y liberar trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) 44. Varias líneas de pez cebra transgénico han sido developed para ayudar a identificar y diseccionar las funciones de la biología de los neutrófilos 27, 45, 46, 47. Este protocolo de infección es flexible y puede ser modificado para probar múltiples funciones de los neutrófilos usando estas herramientas alternativas. Este pez cebra localizada IAV modelo de infección permite a preguntas relacionadas con la respuesta inmune del huésped a tratar, y en particular los que están mediados por los neutrófilos.
Los estudios llevados a cabo en las especies de mamíferos modelo experimentos han arrojado información valiosa 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, pero pocos en tiempo real que contengan IAV infección have ha realizado, lo que limita la comprensión de la compleja interacción entre los componentes de la respuesta inmune innata de los vertebrados en el huésped. Durante la última década, el uso del sistema de modelo animal pez cebra ha producido un punto de inflexión de la información relativa a las interacciones huésped-patógeno 21, 47, 56, 57, y también ha ofrecido información importante como herramienta para el descubrimiento de fármacos. Una combinación de técnicas moleculares y de imágenes de microscopía han permitido una mejor comprensión de la respuesta inmune innata y cómo estos se manifiestan in vivo 17, 18, 27. El descubrimiento de que el pez cebra puede estar infectada con IAV 19, y que las acciones de pez cebra importantes similitudes inmunológicas con los sistemas de mamíferos, incluidos los humanos, ha abierto la puerta al estudiode un importante patógeno viral humana. Los protocolos descritos son adaptables a otras aplicaciones y tienen el potencial de producir descubrimientos fundamentales relacionadas con la interacción huésped-virus que pueden tener profundos efectos clínicos sobre la salud humana.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | ||
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
| Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
| Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
| Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 |
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