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Immunology and Infection

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Published: January 20, 2017 doi: 10.3791/55235

Introduction

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o vírus da gripe infectar 5-10% dos adultos e 20-30% das crianças anualmente e causar 3-5 milhões de casos de doença grave e até 500.000 mortes no mundo 1. vacinação anual contra a gripe continuam a ser a melhor opção para prevenir a doença. Esforços como o Plano de Acção Global da OMS têm aumentado o uso da vacina sazonal, a capacidade de produção de vacinas e pesquisa e desenvolvimento de estratégias de vacinas mais potentes, a fim de reduzir a morbilidade e mortalidade associada a surtos de gripe sazonais 2. Os medicamentos antivirais como inibidores da neuraminidase (por exemplo Zanamivir e oseltamivir) estão disponíveis em alguns países e provaram ser eficazes nos sintomas atenuantes, quando administrado nas primeiras 48 horas de início 3, 4, 5. Apesar dos esforços globais, a contenção da gripe sazonal UOtbreaks continua a ser um desafio formidável neste momento, como o vírus da gripe variação antigénica excede frequentemente capacidades actuais para se adaptar à evolução do genoma do vírus 6. estratégias de vacina visando novas estirpes do vírus devem ser desenvolvidos com antecedência e são, por vezes, tornar-se menos do que optimamente eficaz devido a mudanças imprevistas nos tipos de estirpes que, eventualmente, predominam em uma época de gripe. Por estas razões, existe uma clara necessidade de desenvolver estratégias terapêuticas alternativas para conter infecções e reduzir a mortalidade. Ao atingir uma melhor compreensão da interação vírus-hospedeiro, pode ser possível desenvolver novos medicamentos anti-gripe e terapias adjuvantes 7, 8.

O host-gripe humana A interação do vírus (IAV) é complexa. Vários modelos animais da infecção pelo IAV humana têm sido desenvolvidos, a fim de obter insights sobre a interação vírus-hospedeiro, incluing ratos, cobaias, ratos de algodão, hamsters, furões e macacos 9. Enquanto fornece dados importantes que melhoraram a compreensão da dinâmica de acolhimento-IAV, cada organismo modelo possui desvantagens significativas que devem ser considerados quando se tenta traduzir as descobertas em medicina humana. Por exemplo, os ratos, que são o modelo mais amplamente utilizado, não prontamente desenvolver sintomas de infecção induzidas IAV quando infectadas com gripe humana isola 9. Isto é porque os ratos não têm o tropismo natural para a gripe humana isolados uma vez que as células epiteliais do rato expressam ct-2,3 ligações de ácido siálico, em vez de os α-2,6 ligações de ácido siálico expressos em células epiteliais humanas 10. As proteínas hemaglutinina presentes em isolados humanos IAV favoravelmente ligar e entrar nas células hospedeiras tendo ligações de ácido siálico alfa-2,6 por meio de endocitose mediada por receptores 9, 11, 12, 13. Como consequência, é agora aceite que no desenvolvimento de modelos de rato para a gripe humana, o cuidado deve ser tomado para emparelhar a tensão adequada de rato com a tensão adequada de gripe, de modo a alcançar fenótipos da doença que recapitulam aspectos da doença humana. Em contraste, as células epiteliais no tracto respiratório superior de furões possuem 2,6 a-ligações de ácido siálico que se assemelham a células de origem humana 14. Furões infectados compartilham muitas das características patológicas e clínicas observadas na doença humana, incluindo a patogenicidade e transmissibilidade dos vírus da gripe humanos e aviários 14, 15. Eles também são altamente passíveis de testes de eficácia da vacina. No entanto, o modelo de ferret para a gripe humana tem várias desvantagens relacionadas principalmente ao seu tamanho e custo de criação que fazem aquisição de estatisticamente signifidados signifi desafiadoras. Além disso, furões têm exibido previamente diferenças na farmacocinética dos medicamentos, biodisponibilidade e toxicidade que fazem eficácia teste difícil. Por exemplo, furões apresentar toxicidade para o M2 canal iônico amantadina inibidor 16. Assim, é claro que na escolha de um modelo animal para estudar dúvidas sobre infecções IAV humanos, é importante considerar as suas vantagens e limitações inerentes, e o aspecto da interacção hospedeiro-vírus que está sob investigação.

O peixe-zebra, Danio rerio, é um modelo animal que oferece oportunidades únicas para a investigação de infecção microbiana, resposta imune do hospedeiro, e terapias medicamentosas potenciais 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <classe sup = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. A presença de ácidos siálicos α-2,6-ligadas na superfície de células do peixe-zebra sugeriu a sua susceptibilidade para IAV, o que foi confirmado em estudos de infecção e fotografada in vivo, utilizando uma estirpe repórter fluorescente de 19 IAV. Em peixes-zebra IAV-infectadas, a expressão aumentada dos antivirais ifnphi1 e MXA transcritos indicaram que uma resposta imune inata tinha sido estimulado, e a patologia exibida por peixe-zebra IAV-infectados, incluindo edema e destruição de tecidos, foi semelhante ao observado em infecções por influenza humanos . Além disso, o inibidor da neuraminidase IAV antiviral zanamivir mortalidade limitado e reduzido de replicação viral em peixes-zebra 19.

Neste relatório, um protocolo para o sistema iniciarinfecções IC IAV em embriões de peixe-zebra é descrita. Usando Zanamivir em doses clinicamente relevantes como uma prova de princípio, a utilidade deste modelo de peixe-zebra infecção IAV para rastreio de compostos para a atividade antiviral é demonstrada. Além disso, um protocolo para a geração de uma localizada, infecção epitelial IAV no peixe-zebra nadar bexiga, um órgão que é considerado anatomicamente e funcionalmente análogo ao do pulmão de mamífero 21, 29, 30, 31, é descrito. Usando este modelo de infecção localizada IAV, o recrutamento dos neutrófilos para o local da infecção podem ser rastreados, permitindo que as investigações sobre o papel dos neutrófilos em biologia IAV infecção e inflamação. Estes modelos de peixe-zebra complementar modelos animais existentes de infecções IAV humanos e são particularmente úteis para testar pequenas moléculas e as respostas de células imunitárias, devido à possibilidade de s reforçadapoder Serviço Estatístico, a capacidade de moderado a ensaios de alto rendimento, e as habilidades para rastrear o comportamento de células imunes e função com luz de microscopia.

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Protocol

Todo o trabalho deve ser realizado utilizando nível de biossegurança 2 (ou BSL2) normas descritas pelos Centros de Controle de Doenças (CDC) e de acordo com as diretrizes fixadas pela Institutional Animal Care e Comitês Uso (IACUC). Por favor conferir com as autoridades apropriadas para garantir a segurança e conformidade.

1. Cuidados e Manutenção Zebrafish

  1. Gerar peixe-zebra e recolher o número necessário de embriões para as experiências. Quando necessário, os tanques de criação em massa, como os descritos por Adatto et ai. 32, podem ser empregues para recolher um grande número de embriões desenvolvente-faseados.
  2. Permitir que embriões para desenvolver até o estágio desejado desenvolvimento (48 horas pós-fertilização para uma infecção sistêmica IAV [seção 3] ou 5 dias após a fertilização para um, nadar infecção localizada bexiga [seção 4]) em pratos fundos de Petri em baixa densidade (< 100 embriões / prato) a 28 ° C em água ovo estéril contendo 6/ Sal 0 ug ml mar (por exemplo, Instant Ocean) em água destilada.
    1. Remover embriões mortos com pipetas de transferência de plástico e mudar ovo por dia de água para garantir a saúde eo desenvolvimento ideal.

2. Preparação de Materiais e Reagentes

  1. Prepara-se uma solução de 4 mg / ml de estoque de tricaina-S (ajustar o pH a 7,0-7,4) em água destilada e autoclave. Armazenar a 4 ° C.
  2. Puxe capilares de vidro de borosilicato com filamentos usando um extrator micropipeta (por exemplo Micropipeta Puller com as seguintes configurações: ajuste de pressão = 100, calor = 550, puxe = [qualquer valor], velocidade = 130, tempo = 110).
    NOTA: Antes de aparar a agulha, o comprimento de onde a agulha começa a diminuir para a ponta da agulha seria de aproximadamente 12-15 mm. Isto pode variar, no entanto, com base na preferência e aplicação. Um cone mais, mais gradual pode ser mais preferível por causa do aumento da capacidade para perfurar o embrião e o RI reduzidask da curvatura da agulha ou quebrar.
  3. Derreter 2 g de agarose em 100 ml de água de ovo usando um forno de microondas. Faça placas sobre as quais se alinham e injetar os embriões por verter derretida agarose em placas de Petri profundas e que lhe permita solidificar.
  4. Faça a 10 mg / ml estoque de Zanamivir em água livre de nuclease. Alíquotas e congelamento a -20 ° C.
  5. Derreta 0,5 g de agarose em 50 ml de água ovo usando um forno de microondas para fazer embrião de montagem agarose. Manter em banho-maria a 50 ° C até estar pronto para usar durante o exame.

3. Systemic IAV Infecção (48 horas pós-fertilização)

ATENÇÃO: Todas as equipes de pesquisa devem consultar seus supervisores e médicos sobre a vacinação antes de iniciar o trabalho com IAV.

  1. dechorionate manualmente embriões no dia do experimento usando fórceps # 5. Tome cuidado para remover e sacrificar embriões que foram feridos no processo em 200 mg / ml solução tricaina.
  2. preparação dof IAV para microinjeção
    NOTA: As estirpes que foram mostrados para infectar embriões de peixe-zebra são vírus influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), vírus influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), e o repórter fluorescente estirpe da gripe NS1-GFP 33. Detalhes sobre APR8 e X-31, e outras estirpes, podem ser encontrados na base de dados de Influenza Investigação
    1. Propagar a estirpe NS1-GFP do IAV em ovos de galinha embrionados, tal como descrito anteriormente 34, 35. Recolha, alíquota, e titular o líquido alantóico contendo IAV, e armazenar a -80 ° C. Pré-titulados APR8 e X-31 os vírus podem ser adquiridos comercialmente.
      1. Imediatamente antes da infecção, descongelar rapidamente uma aliquota IAV em luvas e, em seguida, colocar rapidamente sobre gelo para reduzir a perda de título.
    2. diluição viral
      1. Se utilizar os APR8 ou X-31 vírus, dilui-se a 3,3 x 10 6 de ovo a dose infecciosa a 50% (EID50) / ml em estéril, PBS gelado Supplempondentes com 0,25% de vermelho de fenol (para auxiliar na visualização) numa câmara de fluxo laminar. Simultaneamente configurar um controle que contém estéril PBS com 0,25% de fenol vermelho.
      2. Se usando NS1-GFP estirpe 33, dilui-se a 1,5 x 10 ~ 2 unidades formadoras de placas (PFU) por NL em estéril, PBS gelado contendo 0,25% de vermelho de fenol (para auxiliar na visualização) numa câmara de fluxo laminar. Simultaneamente configurar um controle que contém líquido alantóico de ovos de galinha não infectadas diluído como o vírus em PBS estéril com 0,25% de fenol vermelho.
      3. Manter IAV em gelo até estar pronto para usar.
    3. solução de vírus Pipet em agulhas microinjeção usando dicas microloader imediatamente antes da utilização. Inserção de agulha de microinjecção no suporte adequado do aparelho de injecção (por exemplo, 3-MPPI pressão do sistema de injecção).
    4. Durante a visualização no microscópio estéreo, gentilmente cortar a ponta da agulha microinjeção com afiados, esterilizado # 5 fórceps.
      NOTA: É recoded que a ponta microinjeção ser cortada gradualmente.
    5. Pressione o pedal do sistema de injeção de pressão e injetar uma gota de óleo microscópio de imersão em um slide de calibração do micrômetro. Medir o diâmetro da gota. Calcular o volume da gota usando a equação, V = / 3πr 3 4, em que V é o volume em NL e r é o raio em um.
      NOTA: Se o diâmetro da gota é muito pequeno, de vidro adicional pode ser cortada ou ajustes de pressão e de sincronização pode ser ajustado. Se o diâmetro da gota é muito grande, ajustes de pressão e de sincronização pode ser ajustada.
    6. Ajustar ajustes de pressão e de sincronização no injector de pressão e / ou reclip a ponta da agulha até que o volume de injecção desejado é obtido (tipicamente 1-3 nl). ajustes de pressão entre 20 e 30 configurações PSI e duração do pulso entre 40 e 80 ms são típicos. Ajuste a pressão de retorno para que ele contraria a pressão capilar, mas não vaza IAV (pressão líquida zero).
  3. Alinhar embriões para Injection
    1. Anestesiar embriões dechorionated em 200 ug / ml tricaina.
    2. Uma vez que o movimento cessa, transferir 10-20 embriões para uma placa de agarose a 2% (preparado na seção 2.3) com uma pipeta de plástico. Usar uma pipeta de plástico para remover o excesso de líquido.
    3. Alinhe delicadamente embriões para microinjeção com um capilar de fogo-polido e vidro de borosilicato selado. Usando um microscópio estéreo, embriões suavemente orientar de modo que a conduta de Cuvier ou da veia cardinal posterior está em linha com a agulha de microinjecção (Figura 1A).
  4. IAV microinjeção
    1. Insira com cuidado a agulha microinjeção no duto de Cuvier ou a veia posterior cardeal. Pressionar o pedal de pé para injectar o volume desejado de IAV para o sistema circulatório do embrião (Figura 1A). Os embriões podem ser injectada mais de uma vez, se necessário.
      NOTA: O bolus injecção deve ser varrido para a circulação e distribbuído por todo o corpo. Se o volume de injecção recolhe no local da injecção, remover embrião de experiência e eutanásia.
    2. Repita injecções em diferentes embriões com solução de controlo específico para a estirpe do vírus escolhido. Para APR8 e X-31, utilize o controlo descrito no ponto 3.2.2.1; para o NS1-GFP, use o controle descrito no ponto 3.2.2.2.
  5. Transferência de embriões para placas de Petri rotulados contendo água ovo estéril e coloque em incubadoras a 33 ° C.
    NOTA: Infected embriões devem ser cultivadas a 33 ° C, para suportar a replicação viral aumentada. Além disso, a incubação a 33 ° C imita mais de perto a temperatura do tracto respiratório superior humano, que está em contacto estreito com temperaturas mais baixas no ambiente externo e é, onde ocorrem as infecções IAV. Embriões podem aclimatar a uma ampla faixa de temperatura de 34.

4. localizada, bexiga natatória IAV Infecção em Tg (mpx: mCherry)

  1. Preparação do IAV para microinjeção
    1. Dilui-se a solução de injecção de tensão e controle de NS1-GFP, conforme descrito no ponto 3.2.
    2. Prepare agulhas conforme descrito na seção 2.2.
    3. Alinhar Tg (mpx: mCherry) 35 larvas contendo bexigas natatórias inflados como descrito no ponto 3.3 com a seguinte exceção. Alinhar larvas, de tal maneira que a agulha pode penetrar a bexiga natatória e o vírus pode ser depositado na parte posterior da bexiga natatória, como previamente descrito 36 (Figura 2A).
  2. IAV microinjeção
    1. Inserir a agulha suavemente microinjecção na bexiga natatória e injectar o volume desejado (por exemplo, 5 nl) para a parte posterior da estrutura (Figura 2A).
      NOTA: O bolus injecção deve recolher para o posterior e bolha de ar da bexiga natatória deve be deslocada para a frente. expressão da GFP deve começar a ser observada às 3 horas pós-injecção.
    2. injecções repetidas com a solução de controlo específico para a estirpe do vírus escolhido, como descrito na secção 3.4.2.
  3. Transferir larvas de placas de Petri contendo água ovo estéril e coloque em incubadoras a 33 ° C.

5. Antiviral Drug Treatment

NOTA: O protocolo abaixo descreve o tratamento zanamivir anteriormente mostrado na Gabor et ai. 19. Este protocolo pode ser modificado para rastrear outras drogas antivirais e tem o potencial de ser modificado para rastrear múltiplos compostos numa placa de 96 poços, formato de alto rendimento.

  1. Às 3 horas após a infecção, substituir a água do ovo de NS1-GFP e peixes infectados com o controle com água de ovo estéril contendo 0, 16,7, ou 33,3 ng / ml Zanamivir.
    NOTA: Estas concentrações foram escolhidas de modo a tentar reproduzir os níveis fisiológicos obtidos following administração de zanamivir em pacientes humanos (100, 200, ou 600 mg, iv, duas vezes por dia ou 10 mg inalados, duas vezes por dia). As concentrações séricas em pacientes humanos variou 9,83-45,3 ng / mL 36.
  2. Ao longo de 5 dias, troque a água ovo a cada 12 horas e substituir com água de ovo estéril contendo a quantidade adequada de Zanamivir.
  3. Acompanhe curso da infecção.
    1. Anestesiar peixe-zebra em 200 ug / ml tricaina. Monitorar a expressão GFP por microscopia de fluorescência estéreo para observar visualmente as diferenças nos padrões de infecção entre peixes IAV-infectados e controle e entre os peixes imerso nas diferentes concentrações de drogas.
    2. Controlar a morbidade e mortalidade ao longo de 5 dias.
      1. Registre as observações sobre a dinâmica da infecção relacionados com a patologia da doença, incluindo os sinais de letargia e evidência de edema, diferenças de pigmentação, ocular e deformidades craniofaciais, e lordose. patologia da doençatipicamente, torna-se aparente nos peixes infectados controlo em 24-48 h pós-injecção, dependendo da quantidade de vírus injectado. Coletar imagens 24 horas após a injecção.
      2. A cada 24 horas, durante 5 dias após a infecção, registrar o número de larvas mortas, mórbido, e saudável. A morte é definida pela ausência de uma pulsação discernível. Traçar dados conforme desejado. Por exemplo, os dados do gráfico como um gráfico de barras empilhados, com percentagens de peixe saudável, mórbida, ou mortos representados graficamente no eixo dos Y e o grupo de tratamento no eixo dos x. 19
        NOTA: As mortalidades pode ser marcado por estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier. Dependendo da aplicação, pode ser adequado para o desenvolvimento de abordagens alternativas para a morbidade pontuação de peixe, incluindo uma matriz de pontuação que pode quantificar os graus de morbilidade com base nas características patológicas acima mencionadas observados.
      3. Consultar com um estatístico para aplicar as análises estatísticas apropriadas.

6. migração de neutrófilos

NOTA: O protocolo seguinte descreve um método para rastrear a migração de neutrófilos para a bexiga natatória na sequência de uma infecção localizada, epitelial IAV. Os métodos descritos podem ser modificados para testar os efeitos das manipulações genéticas e químicas. Usando esta técnica, será possível caracterizar os mecanismos subjacentes ao comportamento de neutrófilos durante a infecção IAV.

  1. Montagem Zebrafish for Imaging
    1. Anestesiar as larvas a ser trabalhada em 200 ug / ml tricaina.
    2. Transferir um indivíduo Tg (MPX: mCherry) larva que tenha sido infectado com NS1-GFP para um poço de um de 24 cavidades, placas com fundo de vidro em uma pequena gotícula de água do ovo (~ 50-100 ul). Repita com outros peixes IAV-infectado e controle.
    3. Lentamente, adicionar 1% de mídia embrião agarose de montagem a cada poço (seção 2.5), tendo o cuidado de não introduzir grandes bolhas.
      1. Suavemente ajustar a posição da larva de modo que ele é montado no seu lado.Goody e Henry 37 descrevem como fazer sondas que funcionam bem neste aplicativo usando os pinos de insetos que são montados em capilares de vidro de borosilicato com filamentos e superglued no lugar.
    4. Uma vez que a agarose endureça, suavemente encher os poços individuais com água ovo contendo 200 ug / ml tricaina.
    5. Com um microscópio confocal, a captura az série pilha de campo claro e de fluorescência imagens utilizando uma objectiva 20X focada na bexiga natatória.
      1. Definir os limites superior e inferior para que eles capturar toda a fluorescência verde e vermelho visivelmente observável.
      2. capturam imagens com 2.0 ms / pixel com etapas que são ≤ 4 mm. O aumento do tempo por pixel e reduzindo a distância entre as etapas (por exemplo, 0,5-1,0 mm) aumenta a resolução e qualidade de imagem.
      3. Gerar uma imagem bidimensional através da fusão de camadas.
      4. Compare o número de neutrófilos mpx-mCherry-positivos presente in as bexigas natatórias de peixe-zebra IAV-infectados e com injecção de controle.

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Representative Results

Aqui, os dados que mostram como a infecção sistémica IAV no peixe-zebra pode ser usado para testar a eficácia do fármaco (Figura 1A) são fornecidos. Embriões em 48 horas pós-fertilização são injectados com APR8 (Figuras 1C, 1F), X-31 (Figuras 1E, 1G), ou NS1-GFP (Figuras 1 H-1I) através da conduta de Cuvier para iniciar uma infecção viral. Outro grupo de embriões em 48 horas pós-fertilização foram injetados para servir como controles para a infecção viral (Figuras 1B, 1E). Por 48 h pós-infecção, peixe-zebra injectados com IAV exibiu evidência de edema pericárdico (Figuras 1C, 1D) e paragem circulatória (Figura 1F), com os eritrócitos presentes ao longo do pericárdio (Figura 1G). Usando NS1-GFP, a expressão inicial de GFP por microscopia de fluorescência tão cedo como foi observado 3 horas após a infecção. Nesse ponto, peixe-zebra foram expostos a uma ng 33,3/ ML de dose do inibidor da neuraminidase zanamivir. Esta dose é aproximadamente equivalente à dose de 200 mg administrado a pacientes humanos. Controle de peixes infectados não expostos ao Zanamivir (Figuras 1H, 1H ") apresentaram características de edema e expressão GFP sistêmica. Reduzido patologia grave e GFP de fluorescência (Figuras 1I, 1I ') em larvas NS1-GFP-infectados expostos ao Zanamivir foram observados. A redução da GFP era mais visível nos corpos das larvas, quando muito pouca mudança foi observada nos sacos de gema. Os peixes tratados com zanamivir exibiu menor morbidade, tal como evidenciado pela melhoria da motilidade natação e níveis reduzidos de edema no coração, e melhorou a sobrevivência. Esses achados complementam um estudo mais abrangente 19 e mostrar o valor deste modelo para a triagem de drogas.

Um modelo de infecção peixe-zebra bexiga natatória localizada 31 foi adaptado para IAV INFEcção. Vírus NS1-GFP foi injetada nas bexigas natatórias de pós-fertilização 5 d Tg (mpx: mCherry) larvas para iniciar uma localizada, infecção epitelial (Figura 2A). PBS foi injectada na bexiga natatória como um controlo para demonstrar a especificidade do recrutamento de neutrófilos em relação às células infectadas IAV. O recrutamento de neutrófilos mCherry-rotulados para a bexiga natatória foi rastreado. Em 20 horas após a infecção, a migração de neutrófilos para considerável as bexigas de natação de peixe IAV-infectadas relativamente aos controlos injectados com PBS (Figuras 2B, 2B ', 2C, 2C ") foi observado. Estes dados demonstram que podem recrutar IAV neutrófilos para a bexiga natatória, da mesma forma que recruta neutrófilos para o pulmão humano.

figura 1
Figura 1: tratamento antiviral reduz a gravidade da infecção em peixes-zebra IAV. (A (B - I) patologia grave e fluorescência da GFP de embriões de peixe-zebra injetadas no ducto de Cuvier com IAV. (BG) peixes infectados com IAV e examinados 48 horas após a infecção para sinais de infecção virai e doença. (B - D) planos individuais focais de controle ou peixe IAV-infectados foram recolhidos (montados lado, anterior esquerda, superior dorsal, uma ampliação de 4X, barra de escala = 500 mm). (B) Os peixes de controlo foram injectados com PBS e exibir morfologia normal. (C - D) Os embriões infectados com APR8 (C) ou X-31 (D) comumente exibiu edema de pericárdio (seta cheia). Os embriões também tinha tecido necrótico, evidente em (C). Peixes (E) de controlo foram injectados com PBS e mostrar nenhuma evidência de patologia (barra de escala = 250 mm). (F) Os embriões infectados com APR8 mostra parada circulatória (ponta de seta entalhado, barra de escala = 250 mm). (G) de embriões injectados com X-31 de influenza exibe ambos edema pericárdico (seta) e eritrócitos reunidas durante todo o pericárdio (ponta de seta com entalhe, barra de escala = 100 pm). (H, I) Imagens representativas que mostram efeitos de uma droga antiviral em peixes-zebra IAV-infectados (barra de escala = 200 mm). (H) e de campo claro (H ') imagem de fluorescência mostrando um embrião injectados com NS1-GFP (sem tratamento antiviral). Observe edema e expressão GFP especialmente na região da veia comum cardeal. (I, I ') O tratamento com uma droga anti-viral reduzida a Infectião, como evidenciado pela patologia reduzida, incluindo edema diminuída, e a expressão da GFP diminuído dentro do contorno tracejado branco do corpo, particularmente na vasculatura, o que é indicativo da carga viral reduzida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Os neutrófilos são recrutados para os locais de infecção localizada IAV. (A) Esquema demonstrando a abordagem de injeção necessária para iniciar uma infecção localizada IAV em uma bexiga natatória do peixe-zebra inflado a 5 d pós-fertilização. Recrutamento (B, C) de neutrófilos para a bexiga natatória após infecção NS1-GFP. imagens Z-stack (4 mm passos) foram coletadas por meio de microscopia confocal (20x). Imagens foram planatened em duas dimensões (montados lado, anterior esquerda, superior dorsal). Tg (MPX: mCherry) do peixe-zebra (5 d pós-fertilização) foram injectados com (B, B ') de fluido alantóico diluído com PBS e 0,25% de vermelho de fenol ou (C, C') NS1-GFP (7,2 × 10 2 PFU / embrião) diluída em fluido alantóico e PBS com 0,25% de vermelho de fenol. Em 16 horas após a infecção, os neutrófilos estavam presentes em uma bexiga natatória IAV-infectados (C, C ': fluorescência verde mostra infecção localizada; C': glóbulos vermelhos são os neutrófilos, seta branca identifica neutrófilos representante). (B, B ') Nenhuma evidência de expressão de GFP indicativa de infecção e nenhuma IAV recrutamento dos neutrófilos para a bexiga natatória foi observado nas larvas injectadas com o fluido alantóide em PBS. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Para maximizar os benefícios obtidos com o uso de um pequeno animal para modelar interações patógeno-hospedeiro humano, é importante para enquadrar questões de pesquisa e testar hipóteses que capitalizar sobre as vantagens inerentes do sistema modelo. Como um modelo para a infecção pelo IAV humano, o peixe-zebra tem vários pontos fortes, incluindo alta fecundidade, claridade óptica, receptividade ao rastreio de drogas, e da disponibilidade de linhas transgénicas que rotulam células do sistema imunológico, como neutrófilos. O peixe-zebra foi desenvolvido como uma alternativa cada vez mais potentes para o sistema de modelo de ratinho para o estudo da inflamação e da imunidade inata. Porque eles não têm uma resposta imune adaptativa funcionando durante as primeiras 4-6 semanas de desenvolvimento, peixe-zebra montar resposta imune inata para se proteger contra lesões e infecções 37. Durante este período inicial de desenvolvimento, é possível isolar e estudar os mecanismos da resposta antiviral decorrente da resposta imune inata por si só. This trabalho tem sido facilitada pelo desenvolvimento de linhas de peixes-zebra transgénicos como Tg (MPX: mCherry), que rotula neutrófilos com uma proteína fluorescente vermelha.

Modelos de peixe-zebra para a infecção pelo IAV que se assemelham a doença humana foram recentemente descritas 19. Foi demonstrado que os peixes-zebra possuem resíduos de ácido alfa-2,6-ligadas siálico em suas células que fornecem IAV vírus do tropismo de se ligar, unir, e entrar nas células. Neste manuscrito e em Gabor et al. 19, demonstrou-se que duas estirpes diferentes de IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] e X-31 A / Aichi / 68 [H3N2]), bem como a estirpe recombinante de NS1-GFP que resulta em GFP tradução em células infectadas, pode infectar, replicar, e a mortalidade de causa, quando injectadas no sistema circulatório do peixe-zebra larval. A injecção do vírus é fundamental para este método de infecção, como a exposição a IAV através de imersão não funciona de forma fiável. peixes infectados deve ser a transferênciavermelho para uma incubadora de 33 ° C para assegurar a replicação virai. É importante notar que o tracto respiratório humano, onde as infecções de gripe ocorrem, é tipicamente 33 ° C. A incubação a 28 ° C, o que é mais típico para a temperatura de incubação de peixe-zebra, deixa de produzir uma infecção fiável. Além disso, é essencial testar cada lote recebido do fabricante ou do lote de IAV produzido antes da utilização em uma experiência, devido à variabilidade que afecta a infecciosidade e a progressão da doença no peixe-zebra. Quando a dose infecciosa é titulado correctamente, a grande maioria dos peixes-zebra infectados com estas estirpes de IAV deve exibem fenótipos da doença brutas tipificados por edema, tão cedo quanto 24 h pós-infecção, que piorar progressivamente, anomalias craniofaciais por 48 h pós-infecção, lordose por 72 h pós-infecção, e cerca de 50% deve sucumbir à infecção por 5 d pós-infecção. Histopatologia em 48 horas após a infecção deve incluir evidência de emalhar, rim cabeça, enecrose do fígado, bem como indicações de fluido no pericárdio. Ao estabelecer estes resultados como o resultado previsível de uma infecção IAV no peixe-zebra, é possível anti-gripe candidatos compostos droga candidatos tela. Com isto em mente, um protocolo de prova de princípio para o rastreio de uma droga antiviral com base nos achados originais descritas no Gabor et al. 19 são demonstradas. Usando o inibidor da neuraminidase zanamivir, a uma dose que é previsto para imitar níveis observados no sangue humano, atraso no aparecimento de morbidade e mortalidade reduzida através de um efeito aparente sobre a replicação virai / difusão, tal como determinado por fluorescência de NS1-GFP foi observada. O modelo IAV peixe-zebra é ideal para moderado a alto throughput telas pequenas moléculas. Por causa infecções só pode ocorrer apenas através de injecção manual do para a circulação através da conduta de Cuvier ou veia cardinal posterior, o tamanho das telas são limitados pelo número de técnicos Estabinstitui as infecções e suas proficiências em realizar a técnica. No entanto, é possível injectar, pelo menos, cerca de 200 embriões de peixe-zebra por técnico por hora. Embora bem sucedida em demonstrar a atividade antiviral pelo Zanamivir em um modelo de infecção peixe-zebra, é preciso reconhecer que a triagem de drogas em todos os modelos animais, incluindo peixes-zebra, deve ser cuidadosamente controlado 38. A forma como o medicamento é absorvido e metabolizado difere de animal para animal, e é difícil de prever. No entanto, como um método para o rastreio de novas drogas anti-influenza, este modelo de infecção IAV peixe-zebra apresenta uma excelente oportunidade para examinar milhares de moléculas pequenas em um animal com órgãos ortólogos para os seres humanos e com a fisiologia integrativa altamente conservada.

Além de ser um modelo para a infecção sistémica, o peixe-zebra também podem servir como um modelo para infecção localizada, quando IAV é injectado na bexiga natatória 19 21, 29, 30, 31. Quando devidamente titulada, peixe-zebra que estão infectadas com a estirpe NS1-GFP em 5 d pós-fertilização deve apresentar provas da fluorescência pontuada em todo o epitélio da bexiga natatória por 1 d pós-infecção. Usando essa estratégia infecção localizada, o comportamento de neutrófilos em resposta à infecção pode ser rastreado. Como neutrófilos humanos, os neutrófilos peixe-zebra é um principal mediador celular na imunidade inata, funcionando durante as respostas agudas à lesão tecidual e infecção e jogar um papel crítico durante a inflamação crônica 24. Há um reconhecimento crescente de que os neutrófilos desempenham um papel crucial na resposta imune a infecção por influenza. De facto, tornou-se evidente que a função de neutrófilos como "espadas de dois gumes" na mediação da resposta imune. while essencial para a resposta antiviral necessário para controlar infecções de gripe, os neutrófilos contribuem também para um ambiente excessivamente inflamatória no pulmão que podem danificar os tecidos hospedeiros e aumentam o risco de mortalidade de 39, 40, 41, 42, 43. Existe uma considerável conservação de sintenia de genes entre o peixe-zebra e genomas humanos, e com este ortologia, há também a conservação funcional significativa na biologia de neutrófilos. Neutrófilos Zebrafish suportar muitas semelhanças com neutrófilos humanos, incluindo um núcleo polimórfico, a presença de grânulos primários e secundários, e a mieloperoxidase funcional de NADPH-oxidase e 22. Além disso, os neutrófilos peixe-zebra podem engolir bactérias e liberar armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) 44. Várias linhas de peixes-zebra transgénicos foram developed para ajudar a identificar e dissecar as funções de biologia neutrófilos 27, 45, 46, 47. Este protocolo de infecção é flexível e pode ser modificado para testar várias funções dos neutrófilos utilizando estes instrumentos alternativos. Este peixe-zebra localizada modelo de infecção IAV permite questões relacionadas com a resposta imune do hospedeiro a tratar, e em particular as mediadas por neutrófilos.

Estudos realizados em espécies de mamíferos modelo produziram informações 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 valiosos, mas algumas experiências em tempo real envolvendo IAV infecção have sido realizada, o que limita a compreensão da interacção complexa entre os componentes da resposta imune inata de vertebrados no hospedeiro. Durante a última década, o uso do peixe-zebra sistema de modelo animal rendeu um divisor de águas de informações sobre interações patógeno-hospedeiro 21, 47, 56, 57, e tem também ofereceu informações importantes como uma ferramenta para a descoberta de medicamentos. Uma combinação de técnicas moleculares e de microscopia de imagem têm permitido uma melhor compreensão da resposta imune inata e como estes se manifestam in vivo 17, 18, 27. A descoberta de que peixe-zebra podem ser infectados com IAV 19, e que as ações de peixe-zebra semelhanças imunológicas importantes com sistemas de mamíferos, incluindo humanos, abriu a porta para o estudode um importante agente patogénico virai humana. Os protocolos descritos são adaptáveis ​​a outras aplicações e têm o potencial para produzir descobertas críticas sobre interações vírus-hospedeiro que podem ter impactos clínicos profundas na saúde humana.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR 89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

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Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

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