Introduction
Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), les virus grippaux infectent 5-10% des adultes et 20-30% des enfants chaque année et causent 3-5 millions de cas de maladie grave et jusqu'à 500.000 décès dans le monde 1. vaccinations annuelles contre la grippe restent la meilleure option pour prévenir les maladies. Des efforts comme le Plan d' action mondial de l' OMS ont augmenté l' utilisation du vaccin saisonnier, la capacité de production de vaccins, et la recherche et le développement dans les stratégies de vaccination plus puissants afin de réduire la morbidité et la mortalité associées à des flambées de grippe saisonnière 2. Les médicaments antiviraux tels que les inhibiteurs de la neuraminidase (par exemple zanamivir et l' oseltamivir) sont disponibles dans certains pays et se sont avérés efficaces dans les symptômes atténuants, lorsqu'il est administré dans les 48 premières heures d'apparition 3, 4, 5. Malgré les efforts mondiaux, le confinement de la grippe saisonnière oustbreaks reste un formidable défi à ce moment, que le virus de la grippe dérive antigénique dépasse souvent les capacités actuelles pour adapter à l'évolution du génome du virus 6. stratégies de vaccins ciblant de nouvelles souches de virus doivent être mis au point à l'avance et sont parfois rendues moins une efficacité optimale en raison de changements imprévus dans les types de souches qui prédominent éventuellement dans une saison grippale. Pour ces raisons, il y a un besoin évident de développer des stratégies thérapeutiques alternatives pour contenir les infections et réduire la mortalité. En obtenant une meilleure compréhension des interactions hôte-virus, il peut être possible d'élaborer de nouveaux médicaments anti-grippaux et des traitements adjuvants 7, 8.
L'hôte-grippe humaine Une interaction virus (IAV) est complexe. Plusieurs modèles animaux d'infection IAV humaine ont été développés afin de mieux comprendre l'interaction hôte-virus, yment les souris, les cobayes, les rats de cotonniers, les hamsters, les furets et les macaques 9. Tout en fournissant des données importantes qui ont amélioré la compréhension de la dynamique hôte-IAV, chaque organisme modèle possède des inconvénients importants qui doivent être considérés lors de la tentative de traduire les résultats en médecine humaine. Par exemple, les souris, qui sont le modèle le plus largement utilisé, ne développent pas facilement des symptômes d'infection IAV induites lorsqu'ils sont infectés par la grippe humaine isole 9. En effet , les souris manquent de tropisme naturel pour les isolats de la grippe humaine étant donné que les cellules epitheliales de souris expriment des liaisons alpha-2,3 d'acide sialique à la place des liaisons α-2,6 d'acide sialique exprimés sur les cellules épithéliales humaines 10. Les protéines hémagglutinine présentes dans IAV isolats humains se lient favorablement et pénètrent dans les cellules hôtes portant des liaisons acide sialique alpha-2,6 par endocytose médiée par le récepteur 9, 11, 12, 13. En conséquence, il est maintenant admis que dans le développement de modèles de souris pour la grippe humaine, il faut prendre soin de jumeler la souche appropriée de la souris avec la souche appropriée de la grippe afin d'atteindre phénotypes de la maladie qui récapitulent les aspects de la maladie humaine. En revanche, les cellules épithéliales des voies respiratoires supérieures du furet possèdent des liaisons alpha-2,6 d'acide sialique qui ressemblent à des cellules humaines 14. Furets infectés partagent plusieurs des caractéristiques pathologiques et cliniques observées dans la maladie humaine, y compris la pathogénicité et la transmissibilité des virus grippaux humains et aviaires 14, 15. Ils sont aussi extrêmement sensibles à des essais d'efficacité du vaccin. Néanmoins, le modèle de furet pour la grippe humaine présente plusieurs inconvénients principalement liés à leur taille et le coût de l'élevage qui font l'acquisition de statistiquement signifidonnées catifs difficiles. En outre, les furets ont déjà affiché des différences dans la pharmacocinétique des médicaments, la biodisponibilité et la toxicité qui rendent les tests d'efficacité difficile. Par exemple, les furets présentent une toxicité pour le canal ionique M2 16 inhibiteur amantadine. Ainsi, il est clair que dans le choix d'un modèle animal pour étudier des questions sur les infections IAV humaines, il est important de tenir compte des avantages et des limites inhérentes, et l'aspect de l'interaction hôte-virus qui est sous enquête.
Le poisson zèbre, Danio rerio, est un modèle animal qui offre des possibilités uniques pour enquêter sur l' infection microbienne, hôte réponse immunitaire, et les thérapies médicamenteuses potentielles 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <classe sup = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. La présence d'acide sialique α-2,6-liés à la surface des cellules dans le poisson zèbre a suggéré sa sensibilité à l' IAV, qui a été confirmé dans des études d'infection et imager in vivo en utilisant une souche rapporteuse fluorescente de 19 IAV. Chez le poisson zèbre IAV infectées, l' augmentation de l' expression des ifnphi1 et MXA transcrits anti - viraux ont indiqué qu'une réponse immunitaire innée a été stimulée, et la pathologie affichée par le poisson zèbre IAV infectés, y compris l' oedème et la destruction des tissus, a été similaire à celui observé dans les infections de la grippe humaine . En outre, l'IAV inhibiteur de neuraminidase antiviral Zanamivir mortalité limitée et la réplication virale réduite dans zebrafish 19.
Dans ce rapport, un protocole de système d'amorçageinfections ic IAV dans des embryons de poisson zèbre est décrite. Utilisation de zanamivir à des doses cliniquement pertinentes comme une preuve de principe, l'utilité de ce modèle d'infection zebrafish IAV pour les composés de criblage pour l'activité antivirale est démontrée. En outre, un protocole pour générer une version localisée, l' infection de l' épithélium IAV dans la vessie natatoire du poisson zèbre, un organe qui est considéré comme anatomiquement et fonctionnellement analogue au poumon de mammifère 21, 29, 30, 31, est décrit. L'utilisation de ce modèle d'infection IAV localisée, le recrutement des neutrophiles au site de l'infection peut être suivi, ce qui permet des enquêtes sur le rôle des neutrophiles dans la biologie infection IAV et de l'inflammation. Ces modèles se complètent de poisson zèbre modèles animaux existants d'infections IAV humaines et sont particulièrement utiles pour tester de petites molécules et les réponses des cellules immunitaires à cause de la possibilité de renforcer spuissance STATISTIQUE, capacité de modérée à des essais à haut débit, et les capacités de suivre le comportement des cellules immunitaires et la fonction de la lumière-microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les travaux doivent être effectués en utilisant le niveau de biosécurité 2 (ou NSB2) normes décrites par les US Centers for Disease Control (CDC) et conformément aux directives établies par Institutional Animal Care et l'utilisation des comités (IACUC). S'il vous plaît conférer avec les fonctionnaires compétents pour assurer la sécurité et la conformité.
1. Zebrafish Entretien et maintenance
- Spawn zebrafish et de recueillir le nombre requis d'embryons pour les expériences. Lorsque, bassins d'élevage de masse nécessaires, comme ceux décrits par Adatto et al. 32, peuvent être utilisés pour recueillir un grand nombre d'embryons au stade de développement mis en scène.
- Permettre aux embryons de développer jusqu'au stade désiré de développement (48 heures après la fécondation pour une infection systémique IAV [section 3] ou 5 jours après la fécondation pour une localisée, nager infection de la vessie [article 4]) dans des boîtes profondes de Petri à faible densité (< 100 embryons / plat) à 28 ° C dans l'eau d'œuf stérile contenant 60 pg / ml de sel de mer (par exemple, Instant Ocean) dans de l' eau distillée.
- Retirer les embryons morts avec des pipettes de transfert en plastique et changer oeuf eau par jour pour assurer la santé et le développement optimal.
2. Préparation des Matériaux et réactifs
- Préparer un ml de solution 4 mg / stock de Tricaine-S (ajuster le pH à 7,0-7,4) dans de l'eau distillée et autoclave. Conserver à 4 ° C.
- Tirez capillaires en verre borosilicate avec des filaments en utilisant un extracteur micropipette (par exemple Micropipette Extracteur avec les paramètres suivants: réglage de la pression = 100, la chaleur = 550, tirez = [aucune valeur], vitesse = 130, temps = 110).
NOTE: Avant de tailler l'aiguille, la longueur de l'endroit où l'aiguille commence à diminuer à la pointe de l'aiguille serait d'environ 12-15 mm. Cela peut toutefois varier en fonction des préférences et de l'application. Un cône plus long et plus progressif peut être plus préférables en raison de la plus grande capacité de percer l'embryon et la réduction risk de la flexion de l'aiguille ou de rupture. - Faire fondre 2 g d'agarose dans 100 ml d'eau d'œuf à l'aide d'un micro-ondes. Faire des plaques sur lesquelles aligner et injecter les embryons en versant fondu agarose dans des boîtes de Pétri profondes et en lui permettant de se solidifier.
- Faire 10 mg / ml stock d'zanamivir dans l'eau sans nucléase. Aliquoter et congeler à -20 ° C.
- Faire fondre 0,5 g d'agarose dans 50 ml d'eau d'œuf à l'aide d'un micro-ondes pour faire l'embryon de montage agarose. Maintenir dans un bain d'eau à 50 ° C jusqu'à l'utilisation lors de l'imagerie.
3. systémique IAV Infection (48 heures après la fécondation)
ATTENTION: Tout le personnel de recherche devraient consulter leurs superviseurs et les médecins en ce qui concerne la vaccination avant de commencer le travail avec IAV.
- dechorionate manuellement les embryons le jour de l'expérience en utilisant # 5 forceps. Prendre soin d'enlever et euthanasier les embryons qui ont été blessés dans le processus de 200 pg / ml de solution Tricaine.
- Préparation of IAV pour microinjection
NOTE: Les souches qui ont été montrés pour infecter des embryons de poisson zèbre sont la grippe A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), la grippe A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), et le rapporteur fluorescent souche de la grippe NS1-GFP 33. Détails sur APR8 et X-31, et d'autres souches, se trouvent à la base de données recherche sur l'influenza- Propager la souche NS1-GFP de IAV dans des œufs de poule embryonnés comme décrit précédemment 34, 35. Collecter, aliquote et titrer le fluide allantoïque contenant IAV, et conserver à -80 ° C. Pré-titrés APR8 et X-31 virus peuvent être achetés dans le commerce.
- Juste avant l'infection, décongeler rapidement une aliquote IAV dans les mains gantées et placez ensuite rapidement sur la glace pour réduire la perte de titre.
- dilution virale
- Si vous utilisez les APR8 ou X-31 des virus, diluer à 3,3 x 10 6 oeuf dose infectieuse 50% (DIO50) / ml dans stérile, PBS glacé supplémENTED avec 0,25% de rouge de phénol (pour aider à la visualisation) dans une hotte à flux laminaire. En même temps mettre en place un contrôle contenant du PBS stérile avec 0,25% de phénol rouge.
- Si l'on utilise la souche NS1-GFP 33, diluer à environ 1,5 x 10 2 unités formant des plages (PFU) par nl dans stérile PBS glacé contenant 0,25% de rouge de phénol (pour aider à la visualisation) dans une hotte à flux laminaire. En même temps mettre en place un contrôle fluide allantoïque contenant des oeufs de poulet non infectés dilué comme le virus dans du PBS stérile avec 0,25% de phénol rouge.
- Maintenir IAV sur la glace jusqu'à utilisation.
- solution de virus Pipet dans des aiguilles de microinjection à l'aide des conseils de microloader juste avant d'utiliser. Insérer l' aiguille de micro - injection dans le support approprié du dispositif d'injection (par exemple 3-MPPI système d'injection sous pression).
- Lors de l'affichage sous le microscope stéréo, couper délicatement la pointe de l'aiguille de microinjection avec tranchants, # stérilisée 5 forceps.
NOTE: Il est recomded que la pointe de microinjection clipser progressivement. - Appuyer sur la pédale du système d'injection sous pression et à injecter dans une goutte d'huile à immersion au microscope sur une lame de calibrage micromètres. Mesurer le diamètre de la goutte. Calculer le volume de la goutte en utilisant l'équation V = 4/3 3πr, où V est le volume en nl et r est le rayon en um.
NOTE: Si le diamètre de la goutte est trop petit, le verre supplémentaire peut être coupé ou des paramètres de pression et de synchronisation peut être ajustée. Si le diamètre des gouttes est trop grande, les paramètres de pression et de temps peuvent être ajustés. - Régler les paramètres de pression et de synchronisation sur l'injecteur de pression et / ou reclipper la pointe de l'aiguille jusqu'à ce que le volume d'injection désirée est atteinte (typiquement 1-3 nl). Réglage de la pression entre 20 et 30 psi et la durée d'impulsion réglages entre 40 et 80 msec sont typiques. Ajustez la contre-pression afin qu'il compteurs pression capillaire, mais ne fuit pas IAV (pression nette zéro).
- Propager la souche NS1-GFP de IAV dans des œufs de poule embryonnés comme décrit précédemment 34, 35. Collecter, aliquote et titrer le fluide allantoïque contenant IAV, et conserver à -80 ° C. Pré-titrés APR8 et X-31 virus peuvent être achetés dans le commerce.
- Alignez Embryons pour injection
- Anesthetize embryons dechorionated à 200 pg / ml Tricaine.
- Une fois que le mouvement cesse, transférer 10-20 embryons à une plaque d'agarose 2% (préparé dans la section 2.3) avec une pipette en plastique. Utilisez la pipette en plastique pour enlever l'excès de liquide.
- alignez délicatement les embryons pour la microinjection d'un capillaire scellé verre borosilicate poli-feu et. En utilisant un microscope stéréo, embryons doucement orienter de telle sorte que le canal de Cuvier ou de la veine cardinale postérieure est en ligne avec l'aiguille de microinjection (figure 1A).
- IAV microinjection
- Insérez délicatement l'aiguille de microinjection dans le canal de Cuvier ou de la veine cardinale postérieure. Enfoncer la pédale pour injecter le volume désiré de IAV dans le système circulatoire de l'embryon (figure 1A). Les embryons peuvent être injectés par plus d'une fois si nécessaire.
NOTE: Le bolus d'injection doit être balayé dans la circulation et distribbué à travers le corps. Si le volume d'injection recueille sur le site d'injection, retirer l'embryon de l'expérience et Euthanasier. - Répéter les injections sur différents embryons avec une solution de contrôle spécifique à la souche du virus choisi. Pour APR8 et X-31, utilisez la commande décrite dans la section 3.2.2.1; pour la NS1-GFP, utilisez la commande décrite dans la section 3.2.2.2.
- Insérez délicatement l'aiguille de microinjection dans le canal de Cuvier ou de la veine cardinale postérieure. Enfoncer la pédale pour injecter le volume désiré de IAV dans le système circulatoire de l'embryon (figure 1A). Les embryons peuvent être injectés par plus d'une fois si nécessaire.
- embryons de transfert aux boîtes de Pétri marqués contenant de l'eau d'œuf stérile et dans des incubateurs à 33 ° C.
NOTE: Infected embryons doivent être cultivées à 33 ° C pour soutenir la réplication virale améliorée. En outre, l'incubation à 33 ° C imite de plus près la température de l'appareil respiratoire supérieur humain, qui est en contact étroit avec des températures plus basses dans l'environnement externe et où les infections IAV se produisent. Les embryons peuvent acclimater à une large plage de température 34.
4. Localisée, vessie natatoire IAV Infection à Tg (mpx: mCherry)
- Préparation de l'IAV pour microinjection
- Diluer la solution d'injection et de contrôle souche NS1-GFP comme décrit dans la section 3.2.
- Préparer des aiguilles comme décrit dans la section 2.2.
- Alignez Tg (mpx: mCherry) 35 larves contenant des vessies natatoires gonflées comme décrit dans la section 3.3 , à l'exception suivante. Aligner les larves de telle manière que l'aiguille puisse percer la vessie natatoire et le virus peut être déposé dans la partie postérieure de la vessie natatoire, comme décrit précédemment 36 (figure 2A).
- IAV microinjection
- Insérez délicatement l'aiguille de microinjection dans la vessie natatoire et injecter le volume désiré (par exemple 5 nl) vers la partie postérieure de la structure (figure 2A).
NOTE: Le bolus d'injection devrait recueillir vers le postérieur et la bulle d'air de la vessie natatoire devrait be déplacé vers l'avant. expression de la GFP devrait commencer à observer au post-injection 3 h. - Répéter les injections avec une solution de contrôle spécifique à la souche du virus choisi, comme décrit dans la section 3.4.2.
- Insérez délicatement l'aiguille de microinjection dans la vessie natatoire et injecter le volume désiré (par exemple 5 nl) vers la partie postérieure de la structure (figure 2A).
- Transfert des larves à des boîtes de Pétri contenant de l'eau d'œuf stérile et dans des incubateurs à 33 ° C.
5. Antiviral traitement de la toxicomanie
NOTE: Le protocole ci - dessous décrit le traitement Zanamivir montré précédemment dans Gabor et al. 19. Ce protocole peut être modifié à l'écran d'autres médicaments antiviraux et a le potentiel d'être modifié à l'écran plusieurs composés dans une plaque à 96 puits, format à haut débit.
- A 3 heures après l'infection, remplacer l'eau d'œuf de NS1-GFP et les poissons témoins infectés avec de l'eau d'œuf stérile contenant 0, 16,7 ou 33,3 ng / ml zanamivir.
NOTE: Ces concentrations ont été choisies afin de tenter de reproduire les niveaux physiologiques obtenus foadministration llowing du zanamivir chez les patients humains (100, 200, ou 600 mg, iv, deux fois par jour ou 10 mg par inhalation, deux fois par jour). Les concentrations sériques chez les patients humains ont varié de 9,83 à 45,3 ng / ml 36. - Au cours de 5 jours, changer l'eau d'œuf toutes les 12 heures et le remplacer par l'eau d'œuf stérile contenant la quantité appropriée de zanamivir.
- Suivre cours de l'infection.
- Anesthetize zebrafish dans 200 pg / ml Tricaine. Surveiller l'expression de la GFP par microscopie à fluorescence stéréo pour observer visuellement les différences dans les schémas d'infection entre les poissons IAV infectés et de contrôle et parmi les poissons immergés dans les différentes concentrations de médicaments.
- Suivre la morbidité et de la mortalité au cours de 5 jours.
- Enregistrer les observations au sujet de la dynamique d'infection liés à la pathologie de la maladie, y compris des signes de léthargie et des preuves de l'œdème, des différences dans la pigmentation, oculaire et malformations cranio-faciales, et la lordose. pathologie de la maladiedevient généralement apparente dans le contrôle des poissons infectés au post-injection 24-48 h, en fonction de la quantité de virus injecté. Collecter des images post-injection de 24 heures.
- Chaque 24 heures pendant 5 jours après l'infection, enregistrer le nombre de larves mortes, morbide, et en bonne santé. La mort est définie par l'absence d'un battement de coeur perceptible. Tracer les données comme vous le souhaitez. Par exemple, les données de tracé sous forme de graphique à barres empilées, avec des pourcentages de poissons en bonne santé, morbide, ou mort tracées sur l'axe y et le groupe de traitement sur l'axe des x. 19
NOTE: Mortalités peuvent être marqués par des estimations de survie de Kaplan-Meier. Selon l'application, il peut être approprié de développer des approches alternatives pour la morbidité de poissons de notation, y compris une matrice de notation qui peut quantifier les degrés de morbidité en fonction des caractéristiques pathologiques mentionnés ci-dessus observés. - Consultez un statisticien pour appliquer les analyses statistiques appropriées.
6. neutrophiles migration
NOTE: Le protocole ci-dessous décrit une méthode pour le suivi de la migration des neutrophiles à la vessie natatoire après une localisée, infection épithéliale IAV. Les procédés décrits peuvent être modifiés pour tester les effets des manipulations génétiques et chimiques. En utilisant cette technique, il sera possible de caractériser les mécanismes sous-jacents le comportement des neutrophiles lors d'une infection IAV.
- Zebrafish Montage for Imaging
- Anesthetize larves à imager dans 200 pg / ml Tricaine.
- Transférer une Tg (mpx: mCherry) individuelle larve qui a été infecté par NS1-GFP à un puits d'une 24 bien, le verre plaque de fond dans une petite goutte d'eau d'œuf (~ 50-100 pi). Répéter l'opération avec d'autres poissons IAV infectés et de contrôle.
- Ajouter lentement 1% milieux de montage embryon agarose à chaque (section 2.5) et, en prenant soin de ne pas introduire de grosses bulles.
- ajuster en douceur de la position de la chenille de sorte qu'il est monté sur le côté.Goody et Henry 37 décrivent comment faire des sondes qui fonctionnent bien dans cette application en utilisant des broches d' insectes qui sont montés dans des capillaires en verre borosilicate avec filaments et superglued en place.
- Une fois que l'agarose durcit, remplir doucement les puits individuels avec de l'eau d'oeuf contenant 200 ug / ml Tricaine.
- Avec un microscope confocal, capture az série pile de fond clair et fluorescence des images en utilisant un objectif 20X concentré sur la vessie natatoire.
- Définissez les limites supérieure et inférieure de sorte qu'ils saisissent toutes la fluorescence verte et rouge visible observable.
- Capture d'images à 2.0 microsecondes / pixel avec des étapes qui sont ≤ 4 um. Augmentant par pixel et en réduisant la distance entre les étapes (par exemple de 0,5 à 1,0 um) augmente la résolution et une qualité d' image.
- Générer une image en deux dimensions par la fusion des couches.
- Comparez le nombre de neutrophiles mpx-mCherry-positifs présents in les vessies natatoires de zebrafish IAV infectés et de contrôle-injecté.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ici, des données montrant comment l' infection IAV systémique chez le poisson zèbre peut être utilisé pour tester l' efficacité des médicaments (figure 1A) sont fournis. Embryons à 48 heures après la fécondation sont injectés avec APR8 (figures 1C, 1E), X-31 (figures 1D, 1G) ou NS1-GFP (figures 1 H-1I) par l' intermédiaire du canal de Cuvier pour initier une infection virale. Une autre cohorte d'embryons à 48 heures après la fécondation ont été injectés pour servir de témoins pour une infection virale (Figures 1B, 1E). En 48 heures après l'infection, zebrafish injecté avec IAV présentait des signes d'œdème péricardique (Figures 1C, 1D) et un arrêt circulatoire (figure 1F), avec des érythrocytes présents tout au long du péricarde (figure 1G). À l'aide NS1-GFP, l'expression initiale de la GFP par microscopie à fluorescence, dès trois heures après l'infection a été observée. À ce moment-là, le poisson zèbre ont été exposés à un ng 33,3/ Ml, la dose de l'inhibiteur de neuraminidase est le zanamivir. Cette dose est à peu près équivalente à la dose de 200 mg administrée à des patients humains. Contrôle des poissons infectés ne sont pas exposés à Zanamivir (figures 1H, 1H) présentait les caractéristiques d'œdème et d' expression systémique de la GFP. Réduction de la pathologie clinique et GFP fluorescence (figures 1I, 1I ') chez les larves NS1-GFP-infectés exposés à zanamivir ont été observées. La réduction de la GFP a été le plus notable dans les corps des larves, alors que très peu de changement n'a été observé dans les vésicules ombilicales. Les poissons traités avec Zanamivir présentait moins de morbidité, comme en témoigne l'amélioration de la motilité de la natation et les niveaux d'œdème réduit dans le cœur, et la survie améliorée. Ces résultats complètent une étude plus complète 19 et montrent la valeur de ce modèle pour le dépistage des drogues.
Un modèle d'infection zebrafish vessie natatoire localisée 31 a été adapté pour IAV infection. Virus NS1-GFP a été injecté dans les vessies natatoires 5 d après la fécondation Tg (mpx: mCherry) larves d'initier une localisée, infection épithéliale (figure 2A). PBS a été injecté dans la vessie natatoire comme témoin pour démontrer la spécificité du recrutement des neutrophiles vers les cellules infectées par IAV. Le recrutement des neutrophiles mCherry marqués dans la vessie natatoire a été suivi. Au post-infection 20 h, la migration considérable de neutrophiles dans les vessies natatoires de IAV-poissons infectés par rapport aux contrôles PBS-injectées (figures 2B, 2B ', 2C, 2C') a été observée. Ces données démontrent que IAV peut recruter neutrophiles à la vessie natatoire, tout comme il recrute les neutrophiles dans le poumon humain.
Figure 1: le traitement médicamenteux Antiviral atténue la gravité de l' infection IAV chez le poisson zèbre. (A (B - I) pathologie brute et GFP fluorescence des embryons de poisson zèbre injectés dans le canal de Cuvier avec IAV. (BG) Poissons infectés par IAV et examinés à 48 heures après l'infection des signes d'infection virale et la maladie. (B - D) plans focaux simples de contrôle ou de poissons IAV infectés ont été recueillis (latéral, antérieur gauche, haut dorsale, 4X grossissement, barre d'échelle = 500 pm). (B) les poissons de contrôle ont été injectés avec PBS et affichent une morphologie normale. (C - D) Les embryons infectés par APR8 (C) ou X-31 (D) œdème péricardique couramment exposés (flèche remplie). Les embryons ont également un tissu nécrotique, évidente dans (C). Poissons (E) de contrôle ont été injectés avec PBS et ne présentent pas de preuve de la pathologie (barre d'échelle = 250 um). (F) Embryons infectées par APR8 affiche un arrêt circulatoire (arrowhead entaillé, barre d' échelle = 250 um). (G) Embryo injecté avec X-31 grippe affiche les deux œdème péricardique (flèche) et des érythrocytes communs à travers le péricarde (arrowhead entaillé, barre d' échelle = 100 um). (H, I) images représentatives montrant les effets d'un médicament antiviral sur zebrafish IAV-infectées (échelle de bar = 200 um). (H) Brightfield et (H) image de fluorescence montrant un embryon injecté avec NS1-GFP (aucun traitement médicamenteux antiviral). Remarquez l'oedème et l'expression de la GFP en particulier dans la région de la veine cardinale commune. (I, I ') Le traitement avec un médicament antiviral qui réduit l'infection, comme le montre la pathologie réduite, y compris un œdème diminué, et l'expression de GFP a diminué dans le contour en pointillé blanc du corps, en particulier dans le système vasculaire, ce qui est une indication de charge virale réduite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les neutrophiles sont recrutés pour des sites d'infection IAV localisée. (A) Schéma montrant l'approche d'injection nécessaire pour déclencher une infection IAV localisée dans une vessie natatoire zebrafish gonflé à 5 d après la fécondation. (B, C) neutrophiles recrutement à la vessie natatoire après l' infection NS1-GFP. images Z-stack (4 um étapes) ont été recueillies par microscopie confocale (20X grossissement). Images ont été stablestened en deux dimensions (latéral, antérieur gauche, haut dorsale). Tg (mpx: mCherry) zebrafish (5 j après la fécondation) ont été injectés avec (B, B ') du liquide allantoïdien dilué avec du PBS et 0,25% de rouge de phénol (C, C') NS1-GFP (7,2 × 10 2 UFP / embryon) dilué dans du liquide allantoïdien et du PBS avec 0,25% de rouge de phénol. À 16 heures après l'infection, les neutrophiles étaient présents dans une vessie natatoire IAV infectées (C, C ': fluorescence verte montre une infection localisée; C': les globules rouges sont les neutrophiles, flèche blanche identifie neutrophiles représentant). (B, B ') Aucun signe d'expression de la GFP révélatrice d' une infection IAV et aucun recrutement de neutrophiles à la vessie natatoire a été observée chez les larves injecté avec le fluide allantoïque dans du PBS. Please cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afin de maximiser les avantages tirés de l'utilisation d'un petit animal pour modéliser les interactions hôte-pathogène humain, il est important d'encadrer les questions de recherche et de tester des hypothèses qui misent sur les avantages inhérents du système modèle. En tant que modèle pour l'infection IAV humaine, le poisson zèbre a plusieurs points forts, y compris une fécondité élevée, la clarté optique, amenability au dépistage de drogues, et la disponibilité des lignées transgéniques qui étiquettent les cellules immunitaires comme les neutrophiles. Le poisson zèbre a été développé comme une alternative plus puissante pour le système de modèle de souris pour l'étude de l'inflammation et de l'immunité innée. Parce qu'ils manquent d' une réponse immunitaire adaptative fonctionne pendant les 4-6 premières semaines de développement, zebrafish monter les réponses immunitaires innées pour protéger contre les blessures et les infections 37. Pendant cette période, au début du développement, il est possible d'isoler et étudier les mécanismes de la réponse antivirale résultant de la réponse immunitaire innée seul. This le travail a été facilité par le développement de lignées transgéniques comme poisson zèbre Tg (mpx: mCherry), qui marque neutrophiles avec une protéine fluorescente rouge.
Modèles Zebrafish pour l' infection IAV qui ressemblent à la maladie humaine ont été récemment décrits 19. Il a été démontré que zebrafish possèdent des résidus d'acide alpha-2,6-sialique liés à leurs cellules qui fournissent des IAV virus du tropisme pour lier, attacher, et entrer dans les cellules. Dans ce manuscrit et Gabor et al. 19, il a été montré que les deux souches différentes de IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] et X-31 A / Aichi / 68 [H3N2]), ainsi que la souche NS1-GFP recombinante qui se traduit par la GFP traduction dans les cellules infectées, pourrait infecter, reproduire, et les causes de mortalité lorsqu'il est injecté dans le système circulatoire du poisson zèbre larvaire. L'injection du virus est essentiel pour ce procédé de l'infection, l'exposition à l'IAV par immersion ne fonctionne pas correctement. Les poissons infectés doivent être transfertrouge à un incubateur à 33 ° pour assurer la réplication virale. Il est important de noter que les voies respiratoires humaines, où se produisent des infections grippales est typiquement 33 ° C. L'incubation à 28 ° C, ce qui est plus typique de la température pour l'incubation zebrafish, ne parvient pas à produire une infection fiable. En outre, il est essentiel de tester chaque lot reçu par le fabricant ou le lot de IAV produit avant de l'utiliser dans une expérience due à la variabilité qui affecte l'infectiosité et de progression de la maladie chez le poisson zèbre. Lorsque la dose infectieuse est titrée correctement, la grande majorité des zebrafish infectées par ces souches de IAV devrait présenter des phénotypes pathologiques bruts caractérisés par un oedème, dès 24 heures après l'infection, qui s'aggraver progressivement, des anomalies craniofaciales par 48 heures après l'infection, lordose de 72 heures après l'infection, et environ 50% devrait succomber à l'infection par 5 d post-infection. Histopathologie à 48 heures après l'infection devrait inclure des preuves de branchies, la tête du rein, etune nécrose du foie, ainsi que des indications de fluide dans le péricarde. Dans l'établissement de ces constatations que le résultat prévisible d'une infection IAV chez le poisson zèbre, il est possible de candidats de l'écran anti-grippe candidats composés de médicaments. Avec cela à l' esprit, un protocole de validation de principe de criblage d' un médicament antiviral basé sur les résultats originaux décrits dans Gabor et al. 19 sont démontrées. En utilisant l'inhibiteur de neuraminidase est le zanamivir, à une dose qui est prévu pour imiter les niveaux observés dans le sang humain, retarder l'apparition de la morbidité et de la mortalité réduite grâce à un effet apparent sur la réplication virale / propagation, tel que déterminé par fluorescence de la GFP-NS1, a été observée. Le modèle IAV zebrafish est idéalement adapté pour modérée à haut débit des écrans de petites molécules. Parce que les infections ne peuvent se produire que par injection manuelle dans la circulation par le canal de Cuvier ou postérieure veine cardinale, la taille des écrans sont limités par le nombre de techniciens Estabblissant les infections et leurs Maniement dans l'exécution de la technique. Néanmoins, il est possible d'injecter au moins 200 embryons de poisson zèbre par technicien par heure. Bien réussi à démontrer une activité antivirale pour Zanamivir dans un modèle d'infection zebrafish, il faut reconnaître que le dépistage des drogues dans tous les modèles animaux, y compris le poisson zèbre, doit être soigneusement contrôlée 38. La façon dont un médicament est absorbé et métabolisé diffère de l'animal à l'animal, et il est difficile de prévoir. Néanmoins, comme un procédé de criblage de nouveaux médicaments anti-grippaux, ce modèle zebrafish d'infection IAV présente une excellente occasion d'étudier plusieurs milliers de petites molécules chez un animal avec des organes orthologues à l'homme et à la physiologie intégrative hautement conservée.
En plus d'être un modèle d'infection systémique, le poisson zèbre peut également servir de modèle pour une infection localisée lorsque IAV est injecté dans la vessie natatoire 19 21, 29, 30, 31. Lorsqu'il est correctement titré, zebrafish qui sont infectés par la souche NS1-GFP à 5 d après la fécondation doit présenter des preuves de fluorescence ponctuée autour du épithéliums de la vessie natatoire par 1 d post-infection. En utilisant cette stratégie d'infection localisée, le comportement des neutrophiles en réponse à l'infection peut être suivie. Comme les neutrophiles humains, les neutrophiles sont un poisson zèbre principale médiateur cellulaire dans l' immunité innée, le fonctionnement au cours des réponses aiguës à une lésion tissulaire et de l' infection et de jouer un rôle critique au cours de l' inflammation chronique 24. Il y a une reconnaissance croissante que les neutrophiles jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire à l'infection grippale. En effet, il est devenu évident que la fonction de neutrophiles comme «à double tranchant» dans la médiation de la réponse immunitaire. while essentielle à la réponse antivirale nécessaire pour lutter contre les infections grippales, les neutrophiles contribuent également à un environnement excessivement inflammatoire dans les poumons qui peut endommager les tissus de l' hôte et d' augmenter le risque de mortalité 39, 40, 41, 42, 43. Il est important de conservation synténie génétique entre le poisson zèbre et le génome humain, et avec ce orthologie, il y a aussi la conservation fonctionnelle significative de neutrophiles biologie. Neutrophiles poisson zèbre portent de nombreuses similitudes avec les neutrophiles humains, y compris un noyau polymorphes, la présence de granules primaires et secondaires, et la myéloperoxydase fonctionnelle et la NADPH oxydase 22. En outre, les neutrophiles peuvent engloutir les bactéries de poisson zèbre et de libérer des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) 44. Plusieurs lignes de poisson zèbre transgénique ont été developed pour aider à identifier et à disséquer les fonctions de neutrophiles biologie 27, 45, 46, 47. Ce protocole d'infection est flexible et peut être modifié afin de tester de multiples fonctions de neutrophile à l'aide de ces outils de remplacement. Ce poisson zèbre localisé IAV modèle d'infection permet des questions liées à la réponse immunitaire de l'hôte à traiter, et en particulier ceux médiés par les neutrophiles.
Des études menées dans des espèces modèles de mammifères ont donné de précieuses informations 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, mais quelques expériences en temps réel impliquant IAV infection have été réalisée, ce qui limite la compréhension de l'interaction complexe entre les composantes de la réponse immunitaire innée de l'hôte vertébré. Au cours de la dernière décennie, l'utilisation du système de modèle animal zebrafish a donné un bassin versant de l' information sur les interactions hôte-pathogène 21, 47, 56, 57, et a également offert des informations importantes comme un outil pour la découverte de médicaments. Une combinaison de techniques moléculaires et la microscopie d'imagerie ont permis une meilleure compréhension des réponses immunitaires innées et comment ceux - ci se manifestent in vivo 17, 18, 27. La découverte que le poisson zèbre peut être infecté par IAV 19, et que les actions des similitudes immunologiques de poisson zèbre importantes avec les systèmes de mammifères, y compris l' homme, a ouvert la porte à l'étuded'un important agent pathogène viral humain. Les protocoles décrits sont adaptables à d'autres applications et ont le potentiel pour produire des découvertes critiques concernant les interactions hôte-virus qui peuvent avoir des impacts cliniques profonds sur la santé humaine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | ||
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
| Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
| Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
| Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 |
References
- W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
- W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
- De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
- von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
- Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
- Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531 (2000).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
- Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
- Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
- Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
- de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
- Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
- Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
- Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
- Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
- Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
- Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
- Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
- Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715 (2011).
- Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
- Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436 (2013).
- Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
- Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
- Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378 (2016).
- Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
- Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
- Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
- Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
- Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
- Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
- Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
- Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).
