Introduction
Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), i virus influenzali infettano il 5-10% degli adulti e il 20-30% dei bambini ogni anno e causano 3-5 milioni di casi di malattie gravi e fino a 500.000 morti in tutto il mondo 1. vaccinazioni annuali contro l'influenza rimangono l'opzione migliore per prevenire la malattia. Gli sforzi come il piano d'azione globale che hanno aumentato l'uso vaccino stagionale, la capacità di produzione di vaccini, e la ricerca e lo sviluppo in più potenti strategie vaccinali al fine di ridurre la morbilità e la mortalità associate con focolai di influenza stagionale 2. I farmaci antivirali come gli inibitori della neuraminidasi (ad esempio Zanamivir e Oseltamivir) sono disponibili in alcuni paesi e si sono dimostrati efficaci nei sintomi attenuanti, quando somministrato entro le prime 48 ore di insorgenza 3, 4, 5. Nonostante gli sforzi a livello mondiale, il contenimento dell'influenza stagionale outbreaks rimane una sfida formidabile in questo momento, come virus dell'influenza deriva antigenica spesso supera capacità attuali di adattarsi al cambiamento genoma del virus 6. strategie vaccinali di targeting di nuovi ceppi di virus devono essere sviluppate in anticipo e sono a volte resi meno di ottimale efficace a causa di cambiamenti imprevisti nei tipi di ceppi che alla fine predominano in una stagione influenzale. Per queste ragioni, vi è una chiara necessità di sviluppare strategie terapeutiche alternative per contenere le infezioni e riducendo la mortalità. Con il raggiungimento di una migliore comprensione delle interazioni ospite-virus, potrebbe essere possibile sviluppare nuovi farmaci anti-influenzali e terapie adiuvanti 7, 8.
L'host-influenza umana A interazione virus (IAV) è complessa. Diversi modelli animali di infezione umana IAV sono stati sviluppati in modo da ottenere una visione in l'interazione ospite-virus, inclusa,ing topi, cavie, ratti, criceti cotone, furetti e macachi 9. Oltre a fornire dati importanti che hanno migliorato la comprensione delle dinamiche di accoglienza-IAV, ogni organismo modello possiede svantaggi significativi che devono essere considerati quando si tenta di tradurre le scoperte in medicina umana. Ad esempio, i topi, che sono il modello più diffuso, non facilmente sviluppano sintomi di infezione IAV-indotte quando infettati con il virus dell'influenza umana isolati 9. Questo perché i topi non hanno il trofismo naturale per l'influenza umana isolati da cellule epiteliali del mouse esprimono alfa-2,3 legami acido sialico invece delle α-2,6 collegamenti acido sialico espressi sulle cellule epiteliali umane 10. Le proteine emoagglutinina presenti in IAV ceppi umani favorevolmente legano ed entrano cellule ospiti cuscinetto legami alfa-2,6 acido sialico attraverso endocitosi mediata dai recettori 9, 11, 12, 13. Di conseguenza, è ormai accettato che nello sviluppo di modelli murini per l'influenza umana, la cura deve essere presa per abbinare la tensione appropriata del mouse con il ceppo di influenza appropriata al fine di ottenere fenotipi di malattia che ricapitolano aspetti della malattia umana. In contrasto, cellule epiteliali del tratto respiratorio superiore furetti possiedono alfa-2,6 legami di acido sialico che assomigliano cellule umane 14. Furetti infetti condividono molte delle caratteristiche patologiche e cliniche osservate nella malattia umana, compresa la patogenicità e trasmissibilità del virus 14 di influenza umana e aviaria, 15. Essi sono anche altamente suscettibili di prove di efficacia del vaccino. Tuttavia, il modello furetto per l'influenza umana ha diversi svantaggi principalmente legati alla loro dimensione e il costo di allevamento che fanno acquisizione di statisticamente signifidati sopraelevazione impegnativi. Inoltre, furetti hanno già mostrato differenze nella farmacocinetica di droga, la biodisponibilità e tossicità che rendono l'efficacia di prova difficile. Ad esempio, i furetti presentano tossicità per il canale ionico M2 amantadina inibitore 16. Pertanto, è chiaro che nella scelta di un modello animale per studiare domande circa infezioni IAV umani, è importante considerare vantaggi e limiti intrinseci, e l'aspetto della interazione ospite-virus che è indagato.
Il zebrafish, Danio rerio, è un modello animale che fornisce opportunità uniche per studiare l'infezione microbica, ospiterà la risposta immunitaria, e potenziali terapie farmacologiche 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <class = sup "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. La presenza di acidi sialici α-2,6-legate sulla superficie delle cellule nel zebrafish suggerito la sua suscettibilità al IAV, che è stata confermata in studi infezione e ripreso in vivo utilizzando un ceppo reporter fluorescente di IAV 19. In zebrafish IAV-infetti, un aumento dell'espressione dei antivirali ifnphi1 e MXA trascrizioni indicato che una risposta immunitaria innata era stato stimolato, e la patologia visualizzato da zebrafish IAV-infettati, incluso edema e la distruzione dei tessuti, era simile a quella osservata nelle infezioni influenzali umani . Inoltre, la IAV inibitore della neuraminidasi antivirali Zanamivir mortalità limitata e ridotta la replicazione virale in zebrafish 19.
In questo rapporto, un protocollo per l'avvio del sistemainfezioni ic IAV in embrioni di zebrafish è descritto. Utilizzando Zanamivir a dosi clinicamente rilevanti come una prova di principio, è dimostrata l'utilità di questo zebrafish modello di infezione IAV per i composti di screening per l'attività antivirale. Inoltre, un protocollo per la generazione di un localizzata, epiteliale infezione IAV nel zebrafish nuotare vescica, un organo che è considerato anatomicamente e funzionalmente analogo al polmone mammiferi 21, 29, 30, 31, è descritto. Usando questo modello di infezione IAV localizzata, il reclutamento dei neutrofili al sito di infezione possono essere monitorati, consentendo indagini il ruolo della biologia dei neutrofili nelle infezioni IAV e l'infiammazione. Questi modelli zebrafish integrano modelli animali esistenti di infezioni IAV umane e sono particolarmente utili per testare piccole molecole e le risposte delle cellule immunitarie a causa della possibilità di una maggiore spotere Istituti statistici, capacità di moderata a test high-throughput, e le capacità per monitorare il comportamento delle cellule immunitarie e la funzione di luce-microscopia.
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Protocol
Tutti i lavori devono essere eseguiti utilizzando il livello di biosicurezza 2 (o BSL2) standard descritti dai Centri statunitensi per il controllo delle malattie (CDC) e in conformità con le direttive stabilite dalla Institutional Animal Care e sull'uso di comitati (IACUC). Si prega di conferire con i funzionari competenti per garantire la sicurezza e la conformità.
1. Zebrafish Cura e manutenzione
- Spawn zebrafish e raccogliere il numero necessario di embrioni per gli esperimenti. Quando necessario, vasche di allevamento di massa, come quelli descritti dal Adatto et al. 32, possono essere impiegati per raccogliere un gran numero di embrioni evolutivamente-messa in scena.
- Lasciare embrioni a svilupparsi fino stadio desiderato di sviluppo (48 ore post-fertilizzazione per un'infezione sistemica IAV [sezione 3] o 5 giorni dopo la fecondazione per una, nuotare infezione della vescica localizzata [sezione 4]) in piatti profondi Petri a bassa densità (< 100 embrioni / piatto) a 28 ° C in acqua uovo sterile contenente 60 mg / ml sale marino (es Instant Ocean) in acqua distillata.
- Rimuovere embrioni morti con pipette di trasferimento in plastica e cambiare uovo acqua al giorno per garantire la salute e lo sviluppo ottimale.
2. Preparazione dei Materiali e reagenti
- Preparare un 4 mg / ml soluzione stock di Tricaine-S (aggiustare il pH a 7,0-7,4) in acqua distillata e autoclave. Conservare a 4 ° C.
- Tirare capillari di vetro borosilicato con filamenti con un estrattore micropipetta (ad es Micropipetta Estrattore con le seguenti impostazioni: impostazione della pressione = 100, il calore = 550, tirare = [nessun valore], velocità = 130, tempo = 110).
NOTA: Prima di rifilatura l'ago, la lunghezza da dove l'ago comincia a cono alla punta dell'ago sarebbe di circa 12-15 mm. Questo può variare, tuttavia, in base alle preferenze e applicazione. A lungo, conicità più graduale può essere preferibile a causa della maggiore capacità di perforare l'embrione e la ri ridottask della piegatura dell'ago o rottura. - Sciogliere 2 g di agarosio in acqua uovo 100 ml usando un forno a microonde. Fai piastre su cui allineare ed iniettare gli embrioni versando fuso agarosio in piatti profondi Petri e permettendogli di solidificare.
- Fare un 10 mg / ml magazzino del Zanamivir in acqua priva di nucleasi. Aliquotare e congelare a -20 ° C.
- Sciogliere 0,5 g di agarosio in acqua uovo 50 ml utilizzando un forno a microonde per rendere il montaggio degli embrioni di agarosio. Mantenere a bagnomaria a 50 ° C fino al momento dell'uso durante l'imaging.
3. sistemica IAV infezione (48 ore post-fecondazione)
ATTENZIONE: Tutto il personale di ricerca devono consultarsi con i loro supervisori e medici per quanto riguarda la vaccinazione prima di iniziare il lavoro con IAV.
- dechorionate manualmente embrioni il giorno dell'esperimento utilizzando # 5 pinze. Fare attenzione a rimuovere e euthanize embrioni che sono stati feriti nel processo a 200 mg / ml di soluzione Tricaine.
- preparazione of IAV per microiniezione
NOTA: I ceppi che hanno dimostrato di infettare embrioni di zebrafish sono l'influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), l'influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), e il reporter fluorescente ceppo di influenza NS1-GFP 33. Dettagli sulla APR8 e X-31, e altri ceppi, si possono trovare presso il database Influenza Research- Propagare il ceppo NS1-GFP di IAV in uova di gallina embrionate come descritto in precedenza 34, 35. Raccogliere, un'aliquota, e titolare del liquido allantoico contenente IAV, e conservare a -80 ° C. Pre-titolati APR8 e X-31 virus possono essere acquistati in commercio.
- Poco prima infezione, rapidamente scongelare un'aliquota IAV nelle mani guantate e poi rapidamente mettere in ghiaccio per ridurre la perdita di titolo.
- diluizione virale
- Se si utilizza il APR8 o X-31 virus, diluire a 3,3 x 10 6 uova dose infettiva 50% (DIU50) / ml in sterili, ghiacciata PBS supplemENTED con 0,25% di rosso fenolo (per aiutare nella visualizzazione) in una cappa a flusso laminare. Allo stesso tempo impostare un controllo contenente PBS sterile con il 0,25% rosso fenolo.
- Se si utilizza NS1-GFP ceppo 33, diluire a ~ 1,5 x 10 2 formando la placca unità (PFU) per NL in sterile, ghiacciata PBS contenente 0,25% rosso fenolo (per aiutare nella visualizzazione) in una cappa a flusso laminare. Allo stesso tempo impostare un controllo contenente liquido allantoico da uova di gallina infette diluiti come il virus in PBS sterile con lo 0,25% rosso fenolo.
- Mantenere IAV sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
- soluzione virus pipetta in aghi microiniezione utilizzando punte microloader appena prima dell'uso. Inserire l'ago microiniezione nel supporto adeguato dell'apparato di iniezione (ad es MPPI-3 sistema di iniezione a pressione).
- Durante la visualizzazione al microscopio stereo, clip delicatamente la punta dell'ago microiniezione con taglienti, sterilizzato # 5 pinze.
NOTA: E 'raccoded che la punta microiniezione essere ritagliato a poco a poco. - Premere il pedale del sistema di iniezione pressione e iniettare in una goccia di olio microscopio immersione in un vetrino micrometrico di calibrazione. Misurare il diametro della goccia. Calcolare il volume della goccia usando l'equazione V = 4 / 3πr 3, dove V è il volume in nl ed r è il raggio in micron.
NOTA: Se il diametro calo è troppo piccolo, vetro supplementare può essere tagliato o impostazioni di pressione e di sincronizzazione può essere regolata. Se il diametro di goccia è troppo grande, impostazioni di pressione e di temporizzazione possono essere regolati. - Regolare impostazioni di pressione e di temporizzazione sull'iniettore pressione e / o Reclip la punta dell'ago fino a quando il volume di iniezione desiderato si ottiene (tipicamente 1-3 nl). impostazioni di pressione tra 20 e 30 impostazioni psi e durata degli impulsi tra 40 e 80 msec sono tipici. Regolare la contropressione in modo che contrasta pressione capillare, ma non perde IAV (pressione di rete pari a zero).
- Propagare il ceppo NS1-GFP di IAV in uova di gallina embrionate come descritto in precedenza 34, 35. Raccogliere, un'aliquota, e titolare del liquido allantoico contenente IAV, e conservare a -80 ° C. Pre-titolati APR8 e X-31 virus possono essere acquistati in commercio.
- Allineare embrioni per iniezione
- Anestetizzare gli embrioni dechorionated a 200 mg / ml Tricaine.
- Una volta che il movimento cessa, trasferire 10-20 embrioni ad una piastra di agarosio al 2% (preparata nella sezione 2.3) con una pipetta di plastica. Utilizzare pipetta di plastica per rimuovere il liquido in eccesso.
- Allineare delicatamente embrioni per la microiniezione con un capillare fuoco lucido e vetro borosilicato sigillato. Utilizzando un microscopio stereo, embrioni delicatamente orientare in modo che il condotto di Cuvier o la vena posteriore cardinale è in linea con l'ago microiniezione (Figura 1A).
- IAV microiniezione
- inserire delicatamente l'ago microiniezione nel condotto di Cuvier o la vena posteriore cardinale. Premere pedale per iniettare il volume desiderato di IAV nel sistema circolatorio dell'embrione (Figura 1A). Gli embrioni possono essere iniettati più di una volta, se necessario.
NOTA: Il bolo iniezione deve essere travolti nella circolazione e distribbuite in tutto il corpo. Se il volume di iniezione raccoglie al sito di iniezione, rimuovere embrione da esperimento e Eutanasia. - Ripetere iniezioni su diversi embrioni con la soluzione di controllo specifica per il ceppo di virus scelti. Per APR8 e X-31, utilizzare il controllo di cui al punto 3.2.2.1; per la NS1-GFP, utilizzare il controllo di cui al punto 3.2.2.2.
- inserire delicatamente l'ago microiniezione nel condotto di Cuvier o la vena posteriore cardinale. Premere pedale per iniettare il volume desiderato di IAV nel sistema circolatorio dell'embrione (Figura 1A). Gli embrioni possono essere iniettati più di una volta, se necessario.
- Trasferimento degli embrioni a piastre di Petri etichettati contenenti acqua uovo sterile e posto in incubatori a 33 ° C.
NOTA: Infected embrioni devono essere coltivate a 33 ° C per sostenere la replicazione virale maggiore. Inoltre, l'incubazione a 33 ° C imita più da vicino la temperatura del tratto respiratorio superiore umana, che è in stretto contatto con temperature più basse in ambiente esterno ed è dove si verificano infezioni IAV. Gli embrioni possono ambientarsi ad un ampio intervallo di temperature 34.
4. localizzato, vescica natatoria IAV infezione a Tg (mpx: mCherry)
- Preparazione di IAV per microiniezione
- Diluire la tensione e la soluzione di controllo dell'iniezione NS1-GFP come descritto nella sezione 3.2.
- Preparare aghi come descritto nella sezione 2.2.
- Allineare Tg (mpx: mCherry) 35 larve contenente vesciche natatorie gonfiati come descritto nel paragrafo 3.3 con la seguente eccezione. Allineate larve in modo tale che l'ago può forare la vescica natatoria e il virus può essere depositato nel posteriore della vescica natatoria, come precedentemente descritto 36 (Figura 2A).
- IAV microiniezione
- Inserire delicatamente l'ago microiniezione nella vescica natatoria e iniettare il volume desiderato (ad esempio 5 nl) verso la parte posteriore della struttura (Figura 2A).
NOTA: Il bolo iniezione deve raccogliere verso il posteriore e bolla d'aria della vescica natatoria dovrebbe be spostato in avanti. espressione GFP dovrebbe iniziare ad essere osservato dopo l'iniezione 3 ore. - Ripetere l'iniezione con soluzione di controllo specifica per il ceppo di virus scelti, come descritto nella sezione 3.4.2.
- Inserire delicatamente l'ago microiniezione nella vescica natatoria e iniettare il volume desiderato (ad esempio 5 nl) verso la parte posteriore della struttura (Figura 2A).
- Trasferimento larve di piastre di Petri contenenti acqua uovo sterile e posto in incubatori a 33 ° C.
5. Il trattamento farmaco antivirale
NOTA: Il protocollo di seguito descrive il trattamento Zanamivir precedentemente mostrato in Gabor et al. 19. Questo protocollo può essere modificato per lo screening altri farmaci antivirali e ha il potenziale per essere modificato per lo screening più composti in un piatto ben 96, formato ad alta produttività.
- A 3 ore dopo l'infezione, sostituire l'acqua uovo di NS1-GFP e pesce di controllo-infettati con acqua uovo sterile contenente 0, 16,7 o 33,3 ng / ml Zanamivir.
NOTA: Queste concentrazioni sono state scelte in modo da tentare di replicare i livelli fisiologici raggiunti FOamministrazione llowing di Zanamivir nei pazienti umani (100, 200, o 600 mg, IV, due volte al giorno o 10 mg per via inalatoria, due volte al giorno). Le concentrazioni sieriche nei pazienti umani variava 9,83-45,3 ng / ml 36. - Nel corso di 5 giorni, cambiare l'acqua uovo ogni 12 ore e sostituire con acqua uovo sterile contenente la giusta quantità di Zanamivir.
- Traccia corso di infezione.
- Anestetizzare zebrafish a 200 mg / ml Tricaine. Monitorare l'espressione GFP al microscopio a fluorescenza stereo per osservare visivamente differenze nei modelli di infezione tra i pesci IAV-infetti e di controllo e tra i pesci immersi nelle diverse concentrazioni di farmaci.
- Traccia morbilità e mortalità nel corso di 5 giorni.
- Registra osservazioni circa le dinamiche di infezione legati alla patologia della malattia, compresi i segni di letargia e prove di edema, differenze di pigmentazione, oculare e deformità cranio-facciali, e lordosi. patologia delle malattietipicamente diventa evidente nel controllo pesci infetti in post-iniezione 24-48, a seconda della quantità di virus iniettato. Raccogliere le immagini post-iniezione 24 ore.
- Ogni 24 ore per 5 giorni dopo l'infezione, registrare il numero di larve morte, morbosa, e sano. La morte è definito dall'assenza di un battito cardiaco discernibile. Tracciare i dati, se lo desideri. Ad esempio, i dati di scena come un grafico a barre in pila, con percentuali di pesci sani, morbosa, o morto tracciati sul l'asse y e il gruppo di trattamento sul l'asse x. 19
NOTA: Le mortalità possono essere segnati da stime di sopravvivenza di Kaplan-Meier. A seconda dell'applicazione, può essere opportuno sviluppare approcci alternativi per la morbilità pesce di punteggio, tra cui una matrice di punteggio che può quantificare i livelli di morbilità in base alle suddette caratteristiche patologiche osservate. - Consultare uno statistico di applicare le analisi statistiche appropriate.
6. la migrazione dei neutrofili
NOTA: Il protocollo di seguito descrive un metodo per il monitoraggio della migrazione dei neutrofili alla vescica natatoria a seguito di una localizzata, epiteliale infezione IAV. I metodi descritti possono essere modificati per verificare gli effetti di manipolazioni genetiche e chimiche. Usando questa tecnica, sarà possibile caratterizzare i meccanismi sottostanti comportamento neutrofili durante un'infezione IAV.
- Montaggio Zebrafish per l'imaging
- Anestetizzare le larve di essere ripreso in 200 mg / ml Tricaine.
- Trasferire un individuo Tg (mpx: mCherry) larva che è stato infettato con NS1-GFP ad un pozzo di un 24 ben, piatto fondo di vetro in una piccola goccia d'acqua uovo (~ 50-100 ml). Ripetere con altri pesci IAV-infetto e di controllo.
- Lentamente aggiungere 1% mezzi di montaggio degli embrioni agarosio a ciascuna (sezione 2.5) e, facendo attenzione a non introdurre bolle di grandi dimensioni.
- Regolare delicatamente la posizione della larva modo che è montato su un lato.Goody e Henry 37 descrivono come fare le sonde che funzionano bene in questa applicazione utilizzando perni di insetti che sono montati nei capillari di vetro borosilicato con filamenti e superglued a posto.
- Una volta che l'agarosio si indurisce, riempire delicatamente i singoli pozzi con acqua uovo contenente 200 mg / ml Tricaine.
- Con un microscopio confocale, cattura az serie pila di immagini campo chiaro e fluorescenza utilizzando un obiettivo 20X incentrata sulla vescica natatoria.
- Impostare i limiti superiore ed inferiore in modo che catturano tutti visibilmente osservabile fluorescenza verde e rosso.
- catturare immagini a 2.0 msec / pixel con passaggi che sono ≤ 4 micron. Aumentare il tempo per pixel e di ridurre la distanza tra i passaggi (ad esempio 0,5-1,0 micron) aumenta la risoluzione dell'immagine e la qualità.
- Generare una immagine bidimensionale unendo strati.
- Confrontare il numero di neutrofili MPX-mCherry-positive presenti in le vesciche natatorie di IAV-infetti e di controllo a iniezione zebrafish.
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Representative Results
Qui, vengono forniti dati che dimostrano come infezioni sistemiche IAV in zebrafish può essere utilizzato per testare l'efficacia dei farmaci (Figura 1A). Embrioni a 48 ore post-fertilizzazione sono iniettati con APR8 (figure 1C, 1F), X-31 (figure 1D, 1G), o NS1-GFP (Figure 1H-1I) attraverso il condotto di Cuvier di avviare una infezione virale. Un altro coorte di embrioni a 48 ore post-fertilizzazione sono stati iniettati per servire come controlli per infezioni virali (figure 1B, 1E). Con 48 ore dopo l'infezione, zebrafish iniettato con IAV esibito prove di edema pericardico (Figure 1C, 1D) e arresto circolatorio (Figura 1F), con eritrociti presenti su tutto il pericardio (Figura 1G). Utilizzando NS1-GFP, l'espressione iniziale della GFP al microscopio a fluorescenza più presto è stata osservata dopo l'infezione 3 ore. A quel punto, zebrafish sono stati esposti a 33,3 ng/ Ml dose di inibitore della neuraminidasi Zanamivir. Questa dose è più o meno equivalente a 200 mg di dose somministrata a pazienti umani. Controllo pesce infetto non esposti a Zanamivir (Figure 1H, 1H ') espone le caratteristiche di edema e di espressione GFP sistemica. Ridotto patologia grave e fluorescenza GFP (figure 1I, 1I ') in larve NS1-GFP-infettati esposti a Zanamivir sono state osservate. La riduzione della GFP era più evidente nei corpi di larve, mentre molto piccolo cambiamento è stato osservato nei sacchi tuorlo. Pesci trattati con Zanamivir esposto minore morbilità, come evidenziato da una migliore motilità nuoto e livelli di edema ridotto nel cuore, e la sopravvivenza migliorata. Questi risultati integrano uno studio più completo e 19 mostrano il valore di questo modello per lo screening farmacologico.
Un localizzato zebrafish vescica natatoria infezione modello 31 è stato adattato per IAV infection. Virus NS1-GFP è stato iniettato nelle vesciche natatorie su 5 d post-fertilizzazione Tg (mpx: mCherry) larve di avviare un localizzata, infezione epiteliale (Figura 2A). PBS è stato iniettato nella vescica natatoria come controllo per dimostrare la specificità del reclutamento dei neutrofili verso le cellule IAV-infettate. Il reclutamento di neutrofili mCherry-etichettati nella vescica natatoria è stato rintracciato. A 20 ore dopo l'infezione, una notevole migrazione dei neutrofili nelle vesciche natatorie di pesci IAV-infetti rispetto ai controlli PBS-iniettati (figure 2B, 2B ', 2C, 2C') è stato osservato. Questi dati dimostrano che IAV può reclutare neutrofili alla vescica natatoria, così come recluta neutrofili al polmone umano.
Figura 1: trattamento farmacologico antivirale attenua la gravità dell'infezione IAV in zebrafish. (A (B - I) Patologia macroscopica e fluorescenza GFP di embrioni di zebrafish iniettato nel condotto di Cuvier con IAV. (BG) Pesce infettati con IAV ed esaminate a livello post-infezione 48 ore per segni di infezione virale e malattia. (B - D) aerei singole focali di controllo o di pesce IAV-infettati sono stati raccolti (laterale, anteriore sinistra, dorsale superiore, ingrandimento 4X, barra della scala = 500 micron). (B) i pesci di controllo sono stati iniettati con PBS e visualizzazione normale morfologia. (C - D) Gli embrioni infetti da APR8 (C) o X-31 (D) comunemente esposto edema pericardico (freccia piena). Gli embrioni avevano anche il tessuto necrotico, evidente in (C). Pesce (E) di controllo sono stati iniettati con PBS e mostrano alcuna evidenza di patologia (bar scala = 250 micron). (F) Gli embrioni infetti da APR8 visualizza arresto circolatorio (punta di freccia dentellata, scala bar = 250 micron). (G) degli embrioni iniettati con X-31 mostra l'influenza sia l'edema pericardico (freccia) ed eritrociti pool durante il pericardio (punta di freccia dentellata, scala bar = 100 micron). (H, I) Immagini rappresentative che mostrano effetti di un farmaco antivirale in zebrafish IAV-infettati (scala bar = 200 micron). (H) Campo chiaro e (H ') immagine di fluorescenza che mostra un embrione iniettato con NS1-GFP (nessun trattamento farmaco antivirale). Si noti l'edema e l'espressione GFP in particolare nella regione della vena comune cardinale. (I, I ') Il trattamento con un farmaco antivirale riduce la infettareione, come evidenziato dalla riduzione patologie, incluso edema diminuita, e l'espressione GFP diminuita nel bianco contorno tratteggiato del corpo, in particolare nel sistema vascolare, che è indicativo di una ridotta carica virale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I neutrofili sono reclutati per siti di infezione IAV localizzata. (A) Schema che dimostra l'approccio di iniezione necessaria per avviare una infezione IAV localizzata in una gonfiato vescica natatoria zebrafish al 5 d post-fertilizzazione. (B, C) neutrofili reclutamento alla vescica natatoria a seguito di infezione NS1-GFP. immagini Z-stack (4 micron passi) sono stati raccolti mediante microscopia confocale (20X di ingrandimento). Le immagini sono state piattaperturbazioni in due dimensioni (laterale, anteriore sinistra, in alto dorsale). Tg (mpx: mCherry) zebrafish (5 d post-fecondazione) sono stati iniettati con (B, B ') liquido allantoico diluito con PBS e lo 0,25% rosso fenolo o (C, C') NS1-GFP (7.2 × 10 2 PFU / embrione) diluito in liquido allantoico e PBS con 0,25% rosso fenolo. A dopo l'infezione 16 ore, neutrofili erano presenti in una vescica natatoria IAV-infetti (C, C ': fluorescenza verde mostra l'infezione localizzata; C': globuli rossi sono i neutrofili, freccia bianca identifica neutrofili rappresentante). (B, B ') Nessuna evidenza di espressione GFP indicativa di infezione IAV e nessun reclutamento di neutrofili alla vescica natatoria è stata osservata nelle larve iniettato il liquido allantoico in PBS. Please clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per massimizzare i benefici ottenuti dall'utilizzo di un piccolo animale di modellare interazioni ospite-patogeno umano, è importante per inquadrare domande di ricerca e ipotesi di test che capitalizzare i vantaggi intrinseci del sistema modello. Come modello per l'infezione IAV umana, il pesce zebra ha diversi punti di forza, tra cui ad alta fecondità, chiarezza ottica, subordinazione al vaglio di farmaci, e la disponibilità di linee transgeniche che etichetta le cellule immunitarie come neutrofili. Il zebrafish è stato sviluppato come una sempre più potente alternativa al sistema modello di topo per lo studio di infiammazione e di immunità innata. Perché non hanno una risposta immunitaria adattativa funzionante durante le prime 4-6 settimane di sviluppo, zebrafish montare risposte immunitarie innate di protezione contro lesioni e infezioni 37. Durante questo primo periodo di sviluppo, è possibile isolare e studiare i meccanismi della risposta antivirale derivanti dalla risposta immunitaria innata solo. Thilavoro s è stata facilitata dallo sviluppo di linee di zebrafish transgenici come Tg (mpx: mCherry), che etichetta i neutrofili con una proteina fluorescente rossa.
Modelli zebrafish per l'infezione da IAV che assomigliano malattia umana sono stati recentemente descritti 19. È stato dimostrato che zebrafish possiede residui di acido alfa-2,6-legati sialico sulle loro cellule che forniscono IAV virus il tropismo per legare, attaccare, e entrare nelle cellule. In questo manoscritto e Gabor et al. 19, è stato dimostrato che due diversi ceppi di IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] e X-31 A / Aichi / 68 [H3N2]), nonché il ricombinante ceppo NS1-GFP che provoca GFP traduzione in cellule infettate, potrebbe infettare, replicarsi, e le cause di mortalità quando iniettato nel sistema circolatorio di zebrafish larvale. Iniezione del virus è fondamentale per questo metodo infezione, l'esposizione a IAV tramite immersione non funziona correttamente. pesci infetti dovrebbero essere il trasferimentorosso per un 33 ° C incubatore per garantire la replicazione virale. È importante notare che il tratto respiratorio umano, dove si verificano infezioni influenzali, tipicamente 33 ° C. L'incubazione a 28 ° C, che è più temperatura tipica all'incubazione zebrafish, non riesce a produrre una infezione affidabile. Inoltre, è essenziale per testare ogni partita ricevuta dal produttore o il lotto di IAV prodotto prima dell'uso in un esperimento a causa della variabilità che colpisce la progressione infettività e malattia nel pesce zebra. Quando la dose infettiva viene titolato correttamente, la stragrande maggioranza degli zebrafish infettati con questi ceppi di IAV dovrebbe presentare fenotipi malattia lordi caratterizzato da edema, già nel post-infezione 24 ore, che progressivamente peggiorare, anomalie cranio-facciali di post-infezione 48 ore, lordosi per 72 ore dopo l'infezione, e circa il 50% dovrebbe soccombere all'infezione da 5 d post-infezione. Istopatologia a dopo l'infezione 48 ore dovrebbe includere la prova di Gill, rene testa, enecrosi epatica, così come indicazioni di liquido nel pericardio. Nello stabilire questi risultati come il risultato prevedibile di un'infezione IAV in zebrafish, è possibile schermo candidati anti-influenzali candidati composti di droga. Con questo in mente, un protocollo prova di principio per lo screening un farmaco antivirale basata su dati originali descritti in Gabor et al. 19 sono dimostrati. Utilizzando l'inibitore della neuraminidasi Zanamivir, ad una dose che è previsto per simulare i livelli osservati nel sangue umano, insorgenza ritardata di morbilità e mortalità ridotto attraverso un effetto apparente sulla virale replica / diffusione, come determinato dal NS1-GFP fluorescenza, è stato osservato. Il modello IAV zebrafish è ideale per moderato a elevato throughput schermi piccole molecole. Poiché infezioni possono avvenire solo solo attraverso iniezione manuale nella circolazione attraverso il condotto di Cuvier o posteriore della vena cardinale, la dimensione degli schermi sono limitati dal numero di tecnici Estabistituisce le infezioni e le loro Competenza nello svolgimento della tecnica. Tuttavia, è possibile iniettare almeno 200 zebrafish embrioni per tecnico all'ora. Mentre successo a dimostrare attività antivirale per Zanamivir in un modello di infezione zebrafish, si deve riconoscere che il vaglio di farmaci in tutti i modelli animali, tra cui zebrafish, deve essere attentamente controllato 38. Il modo in cui un farmaco viene assorbito e metabolizzato differisce da animale a animale, ed è difficile da prevedere. Tuttavia, come metodo per lo screening di nuovi farmaci anti-influenzali, il pesce zebra modello di infezione IAV presenta una interessante opportunità di esaminare molte migliaia di piccole molecole in un animale con gli organi ortologhi per gli esseri umani e con la fisiologia integrativa altamente conservata.
Oltre ad essere un modello per un'infezione sistemica, il pesce zebra può anche servire da modello per infezione localizzata quando IAV viene iniettato nella vescica natatoria 19 21, 29, 30, 31. Se correttamente titolato, zebrafish che sono infettati con il ceppo NS1-GFP a 5 d post-fertilizzazione deve esibire la prova di puntata fluorescenza intorno al epiteli della vescica natatoria da 1 d post-infezione. Usando questa strategia infezione localizzata, comportamento neutrofili in risposta alla infezione può essere monitorato. Come neutrofili umani, i neutrofili zebrafish sono un mediatore cellulare principale immunità innata, il funzionamento durante le risposte acute a lesioni dei tessuti e l'infezione e giocare un ruolo critico durante l'infiammazione cronica 24. Vi è un crescente riconoscimento che i neutrofili giocano un ruolo cruciale nella risposta immunitaria all'infezione influenzale. In effetti, è diventato evidente che la funzione neutrofili come "spade a doppio taglio" nel mediare la risposta immunitaria. While fondamentali per la risposta antivirale necessario per controllare infezioni influenzali, neutrofili contribuiscono anche ad un ambiente eccessivamente infiammatoria nel polmone che può danneggiare tessuti dell'ospite e aumentare il rischio di mortalità 39, 40, 41, 42, 43. Vi è una notevole conservazione del gene synteny tra il pesce zebra e genomi umani, e con questo ortologia, vi è anche significativo conservazione funzionale nel campo della biologia dei neutrofili. Neutrofili zebrafish moltissime similitudini neutrofili umani, tra cui un nucleo polimorfico, la presenza di granuli primari e secondari, e mieloperossidasi funzionale e NADPH ossidasi 22. Inoltre, i neutrofili zebrafish possono fagocitare i batteri e rilasciare trappole extracellulari dei neutrofili (reti) 44. Diverse linee di zebrafish transgenici sono stati developed per aiutare a identificare e sezionare le funzioni dei neutrofili biologia 27, 45, 46, 47. Questo protocollo infezione è flessibile e può essere modificato per testare più funzioni neutrofili utilizzano questi strumenti alternativi. Questo IAV modello di infezione localizzata zebrafish permette questioni relative alla risposta immunitaria da affrontare, e in particolare quelli mediati dai neutrofili.
Gli studi effettuati in specie modello di mammiferi hanno dato esperimenti in tempo reale informazioni 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 di valore, ma pochi che coinvolgono IAV infezione have state eseguite, limitando la comprensione della complessa interazione tra i componenti della risposta immunitaria innata vertebrato nell'ospite. Negli ultimi dieci anni, l'utilizzo del sistema di zebrafish modello animale ha dato uno spartiacque di informazioni riguardanti interazioni ospite-patogeno 21, 47, 56, 57, e si è anche offerto informazioni importanti come strumento per la scoperta di nuovi farmaci. Una combinazione di tecniche molecolari e la microscopia di imaging hanno consentito una migliore comprensione delle risposte immunitarie innate e come questi si manifestano in vivo 17, 18, 27. La scoperta che zebrafish può essere infettato da IAV 19, e che le azioni di zebrafish importanti similitudini immunologiche con i sistemi di mammiferi, compresi gli esseri umani, ha aperto la porta allo studiodi un importante patogeno virale umana. I protocolli descritti sono adattabili ad altre applicazioni e hanno il potenziale per produrre scoperte critiche per quanto riguarda le interazioni ospite-virus che possono avere impatti clinici profondi sulla salute umana.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | ||
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
| Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
| Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
| Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 |
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