Introduction
Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO), influensavirus infisere 5-10% av voksne og 20-30% av barn årlig, og føre til 3-5 millioner tilfeller av alvorlig sykdom og opp til 500.000 dødsfall på verdensbasis en. Årlig vaksinasjon mot influensa er fortsatt det beste alternativet for å forebygge sykdom. Arbeidet som WHOs globale handlingsplanen har økt sesongvaksine bruk, vaksineproduksjonskapasitet, og forskning og utvikling i mer potente vaksinestrategier for å redusere sykelighet og dødelighet i forbindelse med sesonginfluensautbrudd 2. Antivirale medikamenter som neuraminidasehemmere (f.eks zanamivir og Oseltamivir) er tilgjengelig i enkelte land og har vist seg effektive i formildende symptomer, når det gis innen de første 48 timer av utbruddet 3, 4, 5. Til tross for den globale innsatsen, oppdemming av sesonginfluensa outbreaks fortsatt en formidabel utfordring på denne tiden, som influensavirus antigen drift ofte overstiger nåværende evner til å tilpasse seg skiftende genomet av viruset seks. Vaksine strategier rettet mot nye stammer av virus må utvikles på forhånd, og er noen ganger gjøres mindre enn optimalt effektiv på grunn av uforutsette endringer i hvilke typer stammer som til slutt dominerer i influensasesongen. Av disse grunner, er det et klart behov for å utvikle alternative terapeutiske strategier for inneholdende infeksjoner og redusere dødelighet. Ved å oppnå en bedre forståelse av den vert-virus interaksjon, kan det være mulig å utvikle nye anti-influensa legemidler og adjuvant terapi 7, 8.
Den menneskelige verten-influensa A virus (IAV) interaksjon er kompleks. Flere dyremodeller av menneskelig IAV infeksjon har blitt utviklet for å få innsikt i verts-virus interaksjon, inkluing mus, marsvin, bomullsrotter, hamstere, ildere, og makaker 9. Samtidig som det gir viktige data som har forbedret forståelse av verts IAV dynamikk, besitter hver modellorganisme betydelige ulemper som må vurderes når man forsøker å oversette resultatene til humanmedisin. For eksempel mus, som er den mest brukte modellen, ikke lett utvikle IAV-indusert infeksjon symptomer når infisert med menneskelig influensa isolerer 9. Dette er fordi mus mangler den naturlige tropisme for human influensa isolater, siden mus epitel-celler uttrykker a-2,3 sialinsyre-bindinger i stedet for de α-2,6 sialinsyre-bindinger uttrykt på humane epitelceller 10. Hemagglutinin proteiner tilstede i human IAV isolater gunstig å binde og gå inn vertsceller som bærer a-2,6-bindinger sialinsyre via reseptor-mediert endocytose 9, 11, 12, 13. Som en konsekvens, er det nå akseptert at i utviklingen av musemodeller for human influensa, må man sørge for å koble den passende stamme av mus med det passende stamme av influensa for å oppnå sykdoms fenotyper som rekapitulere aspekter ved den menneskelige sykdom. I motsetning til dette, epitelceller i de øvre luftveiene hos ildere har a-2,6 sialinsyre-bindinger som ligner menneskeceller 14. Infiserte ildere deler mange av de patologiske og kliniske trekk observert i menneskelig sykdom, inkludert patogenitet og overførbarhet av menneskelige og fugleinfluensa virus 14, 15. De er også svært mottagelig for vaksine effektstudiene. Likevel ilderen modell for menneskelig influensa har flere ulemper i hovedsak knyttet til deres størrelse og kostnader for dyrehold som gjør kjøp av statistisk signifiskrånende data utfordrende. I tillegg har ildere tidligere vist forskjeller i legemiddel farmakokinetikk, biotilgjengelighet og giftighet som gjør testing effekt vanskelig. For eksempel, ildere vise giftighet for M2 ionekanal inhibitor amantadin 16. Det er således klart at ved valg av en dyremodell for å studere spørsmål om humane IAV infeksjoner, er det viktig å vurdere dens iboende fordeler og begrensninger, og den del av den vert-virus interaksjon som er under undersøkelse.
Sebrafisk, Danio rerio, er en dyremodell som gir unike muligheter for å undersøke mikrobiell infeksjon, vert immunrespons, og potensielle legemiddelterapi 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <sup class = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. Tilstedeværelsen av α-2,6-bundne sialinsyrer på overflaten av celler i sebrafisk slått dens mottakelighet for IAV, som ble båret på infeksjonsstudier og avbildes in vivo ved bruk av en fluorescerende reporter stamme av IAV 19. I IAV-smittet sebrafisk, økt uttrykk av antivirale ifnphi1 og MXA transkripsjoner indikerte at en medfødt immunrespons hadde blitt stimulert, og patologi vises av IAV-infisert sebrafisk, inkludert ødem og ødeleggelse vev, var lik den som ble observert i menneskelige influensa infeksjoner . Videre IAV antiviral neuraminidase inhibitor zanamivir begrenset dødelighet og redusert virusreplikasjon i sebrafisk 19.
I denne rapporten, en protokoll for initieringssystemic IAV infeksjoner i sebrafisk embryoer er beskrevet. Ved hjelp av zanamivir ved klinisk relevante doser som et proof-of-prinsippet, er nytten av denne sebrafisk IAV infeksjonsmodell for screening forbindelser for antiviral aktivitet demonstrert. I tillegg er en protokoll for generering av en lokalisert, epitelial IAV infeksjon i sebrafisk svømmeblæren, et organ som er ansett for å være anatomisk og funksjonelt analog til pattedyr lunge 21, 29, 30, 31, er beskrevet. Ved hjelp av denne lokaliserte IAV infeksjonsmodell, kan nøytrofile rekruttering til stedet for infeksjon spores, slik undersøkelser i rollen som nøytrofile biologi i IAV infeksjon og betennelse. Disse modellene sebrafisk utfylle eksisterende dyremodeller av humane IAV infeksjoner og er særlig nyttig for å teste små molekyler og immun celle responser på grunn av muligheten for forbedrede statistical kraft, kapasitet for moderat-til high-throughput analyser, og muligheter til å spore immun celle atferd og funksjon med lys-mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbeid skal utføres ved hjelp av biosikkerhetsnivå 2 (eller BSL2) standarder beskrevet av US Centers for Disease Control (CDC) og i samsvar med direktiver fastsatt av Institutional Animal Care og Bruk komiteer (IACUC). Vennligst konferere med de aktuelle myndigheter for å sikre sikkerhet og etterlevelse.
1. Sebrafisk Stell og vedlikehold
- Gyte sebrafisk og samle det nødvendige antall embryoer for forsøkene. Ved behov masse avl tanks, som de beskrevet av Adatto et al. 32, kan anvendes for å samle et stort antall utviklingsmessig trinns embryoer.
- Tillat embryoer til å utvikle til ønsket utviklingsstadiet (48 timer etter befruktning for en systemisk IAV infeksjon [del 3] eller 5 dager etter befruktning for en lokalisert, svømme blære infeksjon [§ 4]) i dype petriskåler ved lav tetthet (< 100 embryo / oppvask) ved 28 ° C i sterile egg vann som inneholder 60 ug / ml havsalt (f.eks Instant Ocean) i destillert vann.
- Fjern døde fostre med plast overføring pipetter og endre egg vann daglig for å sikre optimal helse og utvikling.
2. Utarbeidelse av materialer og reagenser
- Fremstille en 4 mg / ml stamløsning av Tricaine-S (juster pH til 7,0-7,4) i destillert vann og autoklav. Oppbevar ved 4 ° C.
- Trekk borsilikatglass kapillærer med filamenter med en mikropipette avtrekker (f.eks Mikropipette Puller med følgende innstillinger: trykkinnstilling = 100, varme = 550, trekker = [ingen verdi], hastighet = 130, tid = 110).
MERK: Før trimming nålen, vil lengden fra hvor nålen begynner å avta til spissen av kanylen være omkring 12-15 mm. Dette kan imidlertid variere, basert på preferanse og anvendelse. En lengre, mer gradvis avsmalning kan være mer å foretrekke på grunn av den økte evne til å gjennombore embryo og den reduserte risk av nålen bøyes eller brekker. - Smelt 2 g agarose i 100 ml vann egg ved bruk av en mikrobølgeovn. Gjør plater som å stille opp og injisere embryoer ved å helle smeltet agarose inn i dype petriskåler og la det stivne.
- Lag en 10 mg / ml lager av zanamivir i nukleasefritt vann. Delmengde og fryse ved -20 ° C.
- Smelt 0,5 g agarose i 50 ml egg vann ved hjelp av en mikrobølgeovn til å lage embryo montering agarose. Opprettholde i vannbad ved 50 ° C inntil de er klare til bruk under avbildning.
3. Systemisk IAV infeksjon (48 timer etter befruktning)
FORSIKTIG: All forskning personell bør rådføre seg med sine veiledere og leger om vaksinering før arbeidet med IAV starter.
- Manuelt dechorionate embryoer på dagen av forsøket ved hjelp av # 5 tang. Vær nøye med å fjerne og avlive embryoer som har blitt skadet i prosessen i 200 mikrogram / ml Tricaine løsning.
- forberedelse of IAV for Mikroinjeksjon
MERK: Stammer som har vist seg å infisere sebrafisk embryoer er influensa A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), influensa A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), og den fluorescerende reporter influensavirus NS1-GFP 33. Detaljer om APR8 og X-31, og andre stammer kan bli funnet på Influensa forskningsinformasjon- Forplante NS1-GFP stamme av IAV i embryon kylling egg som tidligere beskrevet 34, 35. Samle, delmengde, og titrere allantoinvæsken inneholder IAV, og oppbevar ved -80 ° C. Pre-titered APR8 og X-31 virus kan kjøpes kommersielt.
- Like før infeksjon, raskt tine en IAV delmengde i hansker og deretter raskt plassere på is for å redusere tap av titer.
- viral fortynning
- Ved hjelp av APR8 eller X-31 virus, fortynnet til 3,3 x 10 6 egg infeksiøs dose 50% (EID50) / ml i steril, iskald PBS kompletteresi avdelinger med 0,25% fenolrødt (som en hjelp i visualisering) i en laminær strømningshette. Samtidig setter opp en kontroll inneholdende sterilt PBS med 0,25% fenolrødt.
- Ved bruk av NS1-GFP-stamme 33, fortynn til ~ 1,5 x 10 2 plakkdannende enheter (PFU) pr nl i sterilt, iskald PBS inneholdende 0,25% fenolrødt (som en hjelp i visualisering) i en laminær strømningshette. Samtidig setter opp en kontroll inneholdende allantoinvæsken fra uinfiserte kyllingegg utvannet som viruset i steril PBS med 0,25% fenolrødt.
- Oppretthold IAV på is inntil den er klar til bruk.
- Pipet virus løsning i mikroinjeksjon nåler bruker microloader tips like før bruk. Sett mikroinjeksjon nål inn i riktig innehaver av injeksjonsapparatet (f.eks mppi-3 trykkinjeksjonssystemet).
- Mens du ser under stereomikroskop, forsiktig klippet mikroinjeksjon nålespissen med skarpe, sterilisert # 5 tang.
MERK: Det er anbefalingended at mikroinjeksjon spissen bli avkuttet gradvis. - Trå pedalen til trykkinnsprøytningssystem og injisere i en dråpe mikroskop nedsenking olje på en kalibrering mikrometer lysbilde. Måle diameteren av dråpen. Beregne volumet av dråpen ved hjelp av ligningen, V = 4 / 3πr 3, hvor V er volumet i nl og r er radius i um.
MERK: Hvis rullediameter er for liten, kan ytterligere glass klippes eller trykk- og tidsinnstillingene kan justeres. Hvis rullediameter er for stor, kan trykk- og tidsinnstillingene justeres. - Juster trykk- og tidsinnstillingene på trykk injektoren og / eller reclip nålespissen til ønsket injeksjonsvolum er oppnådd (vanligvis 1-3 nl). Trykk innstillinger mellom 20 og 30 psi og puls varighet innstillinger mellom 40 og 80 ms er typiske. Juster mottrykk slik at den motvirker kapillærtrykk, men ikke lekker IAV (netto null trykk).
- Forplante NS1-GFP stamme av IAV i embryon kylling egg som tidligere beskrevet 34, 35. Samle, delmengde, og titrere allantoinvæsken inneholder IAV, og oppbevar ved -80 ° C. Pre-titered APR8 og X-31 virus kan kjøpes kommersielt.
- Rett embryoer for injeksjon
- Anesthetize dechorionated embryoer i 200 mikrogram / ml Tricaine.
- Når bevegelsen opphører, overføre 10-20 embryo til en 2% agarose plate (utarbeidet i kapittel 2.3) med en plast pipette. Bruk plast pipette for å fjerne overflødig væske.
- Forsiktig justere embryoer for mikroinjeksjon med en brann-polert og forseglet borsilikatglass kapillær. Ved hjelp av en stereo mikroskop, forsiktig orientere embryoer slik at kanalen av Cuvier eller bakre kardinal blodåre er i tråd med mikroinjeksjon nålen (figur 1A).
- IAV Mikroinjeksjon
- Skyv forsiktig mikroinjeksjon nål inn i kanalen av Cuvier eller bakre kardinal blodåre. Trå fotpedal for å injisere det ønskede volum på IAV inn i sirkulasjonssystemet av embryoet (figur 1A). Embryo kan injiseres mer enn en gang om nødvendig.
MERK: Injeksjonen bolus bør bli blåst opp i blodsirkulasjonen og distribuertUted i hele kroppen. Hvis injeksjonsvolum samler på injeksjonsstedet, fjerne embryo fra forsøket og avlive. - Gjenta injeksjoner på forskjellige embryoer med kontrolløsning spesifikk for stamme av viruset valgt. For APR8 og X-31, bruker kontroll beskrevet i punkt 3.2.2.1; for NS1-GFP, bruker kontroll beskrevet i punkt 3.2.2.2.
- Skyv forsiktig mikroinjeksjon nål inn i kanalen av Cuvier eller bakre kardinal blodåre. Trå fotpedal for å injisere det ønskede volum på IAV inn i sirkulasjonssystemet av embryoet (figur 1A). Embryo kan injiseres mer enn en gang om nødvendig.
- Overfør embryoene til merket petriskåler som inneholder sterilt egg vann og legg i kuvøser ved 33 ° C.
MERK: Infected embryo bør dyrkes ved 33 ° C for å støtte økt virusreplikasjon. I tillegg, inkubering ved 33 ° C etterligner nærmere temperaturen for den humane øvre luftveier, som er i nær kontakt med lavere temperatur i det eksterne miljø, og er der IAV infeksjoner forekommer. Embryoet kan akklimatisere seg til et bredt temperaturområde 34.
4. Lokalisert, svømmeblæren IAV Infeksjon i Tg (MPX: mCherry)
- Utarbeidelse av IAV for Mikroinjeksjon
- Fortynne NS1-GFP belastning og kontroll injeksjon løsning som beskrevet i kapittel 3.2.
- Forbered nåler som beskrevet i kapittel 2.2.
- Rett Tg (MPX: mCherry) 35 larver som inneholder oppblåst svømmeblære som beskrevet i kapittel 3.3 med følgende unntak. Juster larver på en slik måte at nålen kan stikke hull i svømmeblæren og viruset kan bli satt inn i det bakre av svømmeblæren, som tidligere beskrevet 36 (figur 2A).
- IAV Mikroinjeksjon
- Skyv forsiktig mikroinjeksjon nål inn i svømmeblæren og injisere ønsket volum (f.eks 5 nl) mot bakre av strukturen (figur 2A).
MERK: Injeksjonen bolus skal samle mot bakre og svømmeblæren luftboble skal væe fortrengt fremover. GFP uttrykk skal begynne å bli observert ved 3 timer etter injeksjon. - Gjentatte injeksjoner med kontrolløsning spesifikk for stamme av viruset valgt, som beskrevet i kapittel 3.4.2.
- Skyv forsiktig mikroinjeksjon nål inn i svømmeblæren og injisere ønsket volum (f.eks 5 nl) mot bakre av strukturen (figur 2A).
- Overfør larver til petriskåler som inneholder sterilt egg vann og legg i kuvøser ved 33 ° C.
5. Antiviral Drug Treatment
MERK: Protokollen nedenfor beskriver zanamivir behandling tidligere vist i Gabor et al. 19. Denne protokollen kan bli modifisert for å screene andre antivirale midler, og har potensiale til å bli modifisert for å screene flere forbindelser i en 96-brønners plate, high-throughput format.
- På tre timer etter infeksjon, erstatte egg vann fra NS1-GFP- og kontroll-infisert fisk med sterilt egg vann som inneholder 0, 16,7 eller 33,3 ng / ml zanamivir.
MERK: Disse konsentrasjonene ble valgt for å forsøke å gjenskape de fysiologiske nivåene oppnådd following administrasjon av zanamivir hos mennesker (100, 200, eller 600 mg, iv, to ganger daglig eller 10 mg inhalert, to ganger daglig). Serumkonsentrasjonene i humane pasienter varierte 9,83 til 45,3 ng / ml 36. - I løpet av 5 dager, endrer egg vann hver 12 time og erstatte med sterilt egg vann som inneholder riktig mengde zanamivir.
- Spor Løpet av infeksjon.
- Anesthetize sebrafisk i 200 mikrogram / ml Tricaine. Overvåk GFP uttrykk ved stereo fluorescens mikroskopi for å visuelt observere forskjeller i infeksjonsmønsteret mellom IAV-smittet og kontroll fisk og hos fisken midt i de ulike konsentrasjoner av narkotika.
- Spor sykelighet og dødelighet i løpet av 5 dager.
- Rekord observasjoner om infeksjonsdynamikk knyttet til sykdom patologi, inkludert tegn på sløvhet og bevis for ødem, forskjeller i pigmentering, okulær og kraniofaciale misdannelser, og lordose. sykdom patologiblir vanligvis tydelig i kontroll infisert fisk ved 24-48 timer etter injeksjonen, avhengig av mengden av virus injiseres. Samle bildene 24 timer etter injeksjon.
- Hver 24. time i 5 dager etter infeksjon, registrere antall døde, morbid, og sunn larver. Døden er definert av fraværet av en merkbar hjerteslag. Plott data som ønsket. For eksempel, tomt data som et stablet søylediagram, med prosenter av sunn, morbid, eller død fisk plottet på y-aksen og behandlingsgruppen på x-aksen. 19
MERK: Dødeligheten kan bli scoret av Kaplan-Meier overlevelsesestimatene. Avhengig av programmet, kan det være hensiktsmessig å utvikle alternative metoder for å score fisk sykelighet, inkludert en scoringsmatrise som kan kvantifisere grad av sykelighet basert på de nevnte patologiske funksjoner observert. - Rådfør deg med en statistiker til å bruke de riktige statistiske analyser.
6. nøytrofilmigrasjon
MERK: Protokollen nedenfor beskriver en metode for å spore nøytrofilmigrasjon til svømmeblæren etter en lokalisert, epitelial IAV infeksjon. Metodene som er beskrevet kan modifiseres for å teste effekten av genetiske og kjemiske manipulasjoner. Ved hjelp av denne teknikk, vil det være mulig å karakterisere de mekanismer som ligger til grunn for nøytrofil oppførsel under en IAV infeksjon.
- Monteringssebrafisk for Imaging
- Bedøve larver som skal bli avbildet i 200 ug / ml Tricaine.
- Overføre en enkelt Tg (MPX: mCherry) larven som er blitt infisert med NS1-GFP til en brønn av en 24 brønn, glassbunnplate i en liten dråpe av egg vann (~ 50-100 ul). Gjenta med andre IAV-smittet og kontroll fisk.
- Sakte legger på 1% agarose embryo monterings media til hver brønn (§ 2.5), tar seg ikke å innføre store bobler.
- Forsiktig justere plasseringen av larven slik at den er montert på høykant.Goody og Henry 37 beskriver hvordan du gjør sonder som fungerer godt i dette programmet bruker insekt pinner som er montert i borsilikatglass kapillærer med filamenter og superglued på plass.
- Når agarose stivner, forsiktig fylle individuelle brønner med egg vann som inneholder 200 mikrogram / ml Tricaine.
- Med en konfokalmikroskop, fangst az stabel serie lysfelt og fluorescens bilder med en 20X objektiv fokusert på svømmeblæren.
- Sett de øvre og nedre grense, slik at de fanger all synlig observerbar grønn og rød fluorescens.
- Ta bilder på 2,0 usekunder / pixel med trinn som er ≤ 4 mikrometer. Økende tid per piksel og redusere avstanden mellom trinn (for eksempel 0,5 til 1,0 mikrometer) øker bildeoppløsning og kvalitet.
- Generere et todimensjonalt bilde ved å slå sammen lagene.
- Sammenligne antall MPX-mCherry-positive nøytrofile jeg presenteren svømmeblære av IAV-infiserte og kontroll-injisert sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her blir data som viser hvordan systemisk IAV infeksjon i sebrafisk kan brukes til å teste medikament effekt (figur 1A) tilgjengelig. Embryoer ved 48 timer etter befruktning blir injisert med APR8 (figurene 1C, 1F), X-31 (figurene 1D, 1G), eller NS1-GFP (fig 1H-1I) via kanalen av Cuvier å initiere en viral infeksjon. En annen kohort av embryoer på 48 timer etter befruktning ble injisert for å tjene som kontroller for virusinfeksjon (Tall 1B, 1E). Ved 48 timer etter infeksjon, sebrafisk injisert med IAV oppviste tegn på pericardial ødem (figurene 1C, 1D) og sirkulasjons arrest (figur 1F), med erytrocytter til stede gjennom hele posen (figur 1G). Ved hjelp av NS1-GFP, den første ekspresjon av GFP ved fluorescens mikroskopi så tidlig som ble observert 3 timer etter infeksjon. På dette tidspunktet ble sebrafisk utsatt for en 33,3 ng/ Ml dose av neuraminidase inhibitor zanamivir. Denne dosen tilsvarer omtrent 200 mg dose gitt til menneskelige pasienter. Kontroll smittet fisk ikke utsettes for zanamivir (Tall 1H, 1H ') viste trekk ved ødem og systemisk GFP uttrykk. Redusert brutto patologi og GFP fluorescens (Tall 1I, 1I ') i NS1-GFP-infiserte larver utsettes for zanamivir ble observert. Reduksjonen i GFP var mest merkbar i kroppene til larver, mens svært liten endring ble observert i eggeplomme sacs. Fisk behandlet med zanamivir utstilt mindre sykelighet, noe som gjenspeiles av økt svømme motilitet og reduserte nivåer av ødem i hjertet, og forbedret overlevelse. Disse funnene utfylle et mer omfattende studie 19 og vise verdien av denne modellen for narkotika screening.
En lokalisert sebrafisk svømme blære infeksjon modell 31 er tilpasset for IAV infeDette skjer. NS1-GFP viruset ble injisert inn i svømmeblæren av 5 d etter befruktning Tg (MPX: mCherry) larvene å initiere en lokalisert, epitelial infeksjon (figur 2A). PBS ble injisert inn i svømmeblæren som en kontroll for å demonstrere spesifisiteten av neutrofil rekruttering mot IAV-infiserte celler. Rekrutteringen av mCherry-merket nøytrofile i svømmeblæren ble sporet. Ved 20 timer etter infeksjon, betydelig migrering av nøytrofiler inn i svømmeblæren av IAV-infisert fisk i forhold til PBS-injiserte kontroller (figurene 2B, 2B ', 2C, 2C') ble observert. Disse dataene viser at IAV kan rekruttere nøytrofile til svømmeblæren, akkurat som det rekrutterer nøytrofile til den menneskelige lunge.
Figur 1: Antiviral behandling reduserer alvorlighetsgraden av IAV infeksjon i sebrafisk. (En (B - I) Brutto patologi og GFP fluorescens av sebrafisk embryoer injisert inn i kanalen av Cuvier med IAV. (BG) Fish infisert med IAV og undersøkt på 48 timer etter infeksjon etter tegn på viral smitte og sykdom. (B - D) Enkelt fokale plan av kontroll eller IAV-infisert fisk ble samlet (sidemontert, fremre venstre, rygg topp, 4X forstørrelse, skala bar = 500 mikrometer). (B) Kontroll Fisken ble injisert med PBS og viser normal morfologi. (C - D) embryoer infisert med APR8 (C) eller X-31 (D) som vanligvis fremviste perikardial ødem (fylt pil). Embryoer hadde også nekrotisk vev, tydelig i (C). (E) Kontroll fisk ble injisert med PBS og vise ingen tegn på patologi (skala bar = 250 nm). (F) Embryoet infisert med APR8 viser sirkulasjons arrest (laftet pilspiss, skala bar = 250 nm). (G) Embryo injisert med X-31 influensa skjermer både perikard ødem (pil) og sammenslåtte erytrocytter gjennom hjerteposen (laftet pilspiss, skala bar = 100 nm). (H, I) Representative bilder som viser effektene av en antiviral medikament på IAV-infisert sebrafisk (skala bar = 200 nm). (H) Lysfelt og (H ') fluorescens bilde som viser et embryo injisert med NS1-GFP (ingen antiviral behandling). Legg merke til ødem og GFP uttrykk spesielt i felles kardinal vene regionen. (I, I ') Behandling med et antiviralt legemiddel redusert infisereion, noe som gjenspeiles ved redusert patologi, herunder redusert ødem, og redusert GFP uttrykk innenfor hvitstiplede omrisset av kroppen, særlig i vaskulaturen, noe som er en indikasjon på nedsatt virusbelastningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Nøytrofile rekrutteres til områder av lokaliserte IAV infeksjon. (A) Skjematisk demonstrere injeksjons tilnærming er nødvendig for å sette i gang en lokalisert IAV infeksjon i en oppblåst sebrafisk svømmeblæren på 5 d etter befruktning. (B, C) nøytrofile rekruttering til svømmeblæren følgende NS1-GFP infeksjon. Z-stack bilder (4 mikrometer trinn) ble samlet av konfokal mikroskopi (20X forstørrelse). Bilder var flattet i to dimensjoner (sidemontert, fremre venstre, rygg toppen). Tg (MPX: mCherry) sebrafisk (5 d etter befruktning) ble injisert med (B, B ') allantoinvæske fortynnet med PBS og 0,25% fenol rødt eller (C, C') NS1-GFP (7,2 × 10 2 PFU / embryo) fortynnet i allantoinvæske og PBS med 0,25% fenol rødt. Ved 16 timer etter infeksjon, nøytrofile var til stede i en IAV-infisert svømmeblæren (C, C ': grønn fluorescens viser til lokaliserte infeksjoner; C': røde celler er neutrofiler, hvit pil identifiserer representative nøytrofil). (B, B ') Ingen bevis for GFP uttrykk som indikerer IAV infeksjon og ingen rekruttering av nøytrofiler til svømmeblæren ble observert i larver injisert med den allantoiske væske i PBS. Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å maksimere nytten av å bruke et lite dyr å modellere menneskelige vert-patogen interaksjoner, er det viktig å ramme problemstillinger og teste hypoteser som kapitalisere på de iboende fordelene av modellsystemet. Som modell for menneskelig IAV infeksjon, har sebrafisk flere styrker, inkludert høy fruktbarhet, optisk klarhet, amenability til narkotika screening, og tilgjengeligheten av transgene linjer den etiketten immunceller som nøytrofile. Sebrafisk har blitt utviklet som en stadig kraftigere alternativ til musemodellsystem for studier av betennelse og medfødt immunitet. Fordi de mangler en fungerende adaptiv immunrespons i løpet av de første 4-6 ukene av utvikling, sebrafisk montere medfødte immunresponser for å beskytte mot skader og infeksjon 37. I løpet av denne første perioden i utvikling, er det mulig å isolere og studere mekanismer av antiviral respons som følge av den medfødte immunrespons alene. This arbeid har blitt tilrettelagt av utviklingen av transgene sebrafisk linjer som Tg (MPX: mCherry), som etiketter nøytrofile med en rød fluorescerende protein.
Sebrafisk modeller for IAV infeksjon som ligner menneskelig sykdom ble nylig beskrevet 19. Det ble demonstrert at sebrafisk har alfa-2,6-bundne sialsyreresiduer på sine celler som gir IAV virus den tropisme å binde, feste, og inn i cellene. I dette manuskriptet og Gabor et al. 19, har det vist seg at to forskjellige stammer av IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] og X-31 A / Aichi / 68 [H3N2]), såvel som det rekombinante NS1-GFP belastning som resulterer i GFP oversettelse i infiserte celler, kunne infisere, replikere, og dødelighet når injiseres i sirkulasjonssystemet av larvesebrafisk. Injeksjon av viruset er avgjørende for denne infeksjon Fremgangsmåte eksponering for IAV via nedsenking ikke virker på en pålitelig måte. Infiserte fisken bør være overføringrød til en 33 ° C inkubator for å sikre at virusreplikasjon. Det er viktig å merke seg at den menneskelige luftrøret, hvor influensainfeksjoner oppstår, er typisk 33 ° C. Inkubering ved 28 ° C, noe som er mer typisk temperatur for sebrafisk inkubering, ikke klarer å fremstille en pålitelig infeksjon. Videre er det viktig å teste hvert parti fra produsent eller batch av IAV produsert før bruk i et eksperiment på grunn av variasjoner som påvirker smittsomhet og sykdomsutvikling hos sebrafisk. Når infeksiøs dose titreres riktig, bør de aller fleste av sebrafisk infisert med disse stammer av IAV vise brutto sykdoms fenotyper preget av ødem, så tidlig som 24 timer etter infeksjon, som gradvis forverres, kraniofaciale misdannelser etter 48 timer etter infeksjon, lordose av 72 timer etter infeksjon, og ca 50% bør gi etter for smitte av 5 d post-infeksjon. Histopatologi på 48 timer etter infeksjon bør inneholde bevis for gill, hodenyre, oglevernekrose, såvel som indikasjoner på væske i hjerteposen. I å etablere disse funnene som forutsigbart resultat av en IAV infeksjon i sebrafisk, er det mulig å skjerm kandidat anti-influensa narkotika sammensatte kandidater. Med dette i bakhodet, en proof-of-prinsippet protokoll for screening et antiviralt legemiddel basert på originale funn er beskrevet i Gabor et al. 19 er påvist. Ved hjelp av neuraminidase inhibitor Legemidlet, i en dose som er forutsagt for å etterligne nivåene observert i humant blod, forsinket inntreden av sykelighet og dødelighet redusert gjennom en tydelig effekt på viral replikasjon / spredning, som bestemt ved NS1-GFP fluorescens, ble observert. Sebrafisk IAV modellen er ideell for moderat-til high-throughput lite molekyl skjermer. Fordi infeksjoner kan bare skje bare gjennom en manuell injeksjon i sirkulasjonen via kanalen av Cuvier eller bakre kardinal vene, er størrelsen på skjermene begrenset av antall teknikere Establishing infeksjoner og deres proficiencies i å utføre teknikken. Likevel er det mulig å sprøyte inn minst 200 sebrafisk embryoer pr tekniker per time. Mens lykkes i å demonstrere antiviral aktivitet for zanamivir i en sebrafisk smitte modell, må det erkjennes at narkotika screening i alle dyremodeller, inkludert sebrafisk, må være nøye kontrollert 38. Måten et medikament absorberes og metaboliseres forskjellig fra dyr til dyr, og er vanskelig å forutsi. Likevel, som en metode for screening nye anti-influensa legemidler, presenterer denne sebrafisk IAV infeksjonsmodell en spennende mulighet til å kartlegge mange tusen små molekyler i et dyr med organer ortologe for mennesker og med høyt konservert integrerende fysiologi.
I tillegg til å være en modell for systemisk infeksjon, kan sebrafisk også tjene som en modell for lokal infeksjon når IAV injiseres inn i svømmeblæren 19 21, 29, 30, 31. Når riktig titrert, bør sebrafisk som er smittet med NS1-GFP belastning på 5 d etter befruktning vise bevis for punktat fluorescens rundt epitel av svømmeblæren av en d post-infeksjon. Ved hjelp av denne lokalisert infeksjon strategi, kan nøytrofil oppførsel som reaksjon på infeksjon spores. Som menneske nøytrofile, sebrafisk nøytrofile er en rektor cellular megler i medfødt immunitet, fungerer under akutte reaksjoner på vevsskade og smitte og å spille viktige roller under kronisk betennelse 24. Det er en økende erkjennelse av at nøytrofile spille en avgjørende rolle i immunresponsen mot influensainfeksjon. Faktisk har det blitt klart at nøytrofile funksjon som "dobbel-edged sverd" i formidling immunresponsen. While avgjørende for antiviral respons er nødvendig for å kontrollere influensainfeksjoner, nøytrofiler også bidra til en for inflammatorisk miljø i lungene som kan skade vertsvev og øke risikoen for dødelighet 39, 40, 41, 42, 43. Det er betydelig bevaring av gen synteny mellom sebrafisk og humane genomer, og med dette orthology, er det også viktig funksjonell bevarings i nøytrofil biologi. Sebrafisk nøytrofile bærer mange likhetstrekk med humane neutrofiler, inkludert en polymorfe kjernen, tilstedeværelsen av primære og sekundære granuler og funksjonell myeloperoxidase og NADPH oksidase 22. I tillegg kan sebrafisk nøytrofile sluker bakterier og slipp nøytrofile ekstracellulære feller (NETS) 44. Flere transgene sebrafisk linjene er developed for å identifisere og dissekere funksjoner nøytrofile biologi 27, 45, 46, 47. Denne infeksjonen protokollen er fleksibel og kan bli endret for å teste flere nøytrofile funksjoner ved hjelp av disse alternative verktøy. Dette lokalisert sebrafisk IAV infeksjonsmodell gjør at spørsmål knyttet til vertens immunrespons som skal behandles, og særlig de som formidles av nøytrofile.
Studier utført i pattedyrmodellarter har gitt verdifull informasjon 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, men få sanntids forsøk med IAV infeksjon have blitt utført, noe som begrenser forståelsen av det komplekse samspill mellom komponentene i virveldyr medfødte immunrespons hos verten. I løpet av det siste tiåret, har bruken av sebrafisk dyremodellsystemet ga et vannskille av informasjon om host-patogen interaksjoner 21, 47, 56, 57, og har også tilbudt viktig informasjon som et verktøy for medisiner. En kombinasjon av molekylære teknikker og bildebehandling mikroskopi har tillatt en bedre forståelse av medfødte immunresponser og hvordan disse kommer til uttrykk in vivo 17, 18, 27. Oppdagelsen av at sebrafisk kan bli smittet med IAV 19, og at sebrafisk aksjer viktige immunologiske likheter med pattedyrsystemer, inkludert menneske, har åpnet døren til studietav en viktig menneskelig viral patogen. Protokollene er beskrevet er tilpasningsdyktig til andre applikasjoner, og har potensial til å gi kritiske funn angå host-virus interaksjoner som kan ha dyptgripende kliniske virkninger på menneskers helse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | ||
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
| Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
| Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
| Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 |
References
- W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
- W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
- De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
- von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
- Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
- Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531 (2000).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
- Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
- Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
- Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
- de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
- Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
- Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
- Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
- Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
- Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
- Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
- Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
- Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715 (2011).
- Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
- Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436 (2013).
- Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
- Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
- Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378 (2016).
- Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
- Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
- Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
- Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
- Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
- Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
- Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
- Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).
