Introduction
Ifølge World Health Organization (WHO), influenzavirus inficere 5-10% af voksne og 20-30% af børn årligt og forårsage 3-5 millioner tilfælde af alvorlig sygdom og op til 500.000 dødsfald på verdensplan en. Årlige vaccinationer mod influenza forblive den bedste mulighed for at forebygge sygdom. Indsatsen som WHO globale handlingsplan har øget sæsonbetinget vaccine brug, vaccine produktionskapacitet, og forskning og udvikling i mere potente vaccine strategier for at reducere sygelighed og dødelighed i forbindelse med årstidens influenzaudbrud 2. Antivirale lægemidler som neuraminidasehæmmere (f.eks Zanamivir og Oseltamivir) er tilgængelige i nogle lande og har vist sig effektive i formildende symptomer, når det gives inden for de første 48 timer af debut 3, 4, 5. Trods den globale indsats, inddæmning af sæsoninfluenza outbreaks bliver en vældig udfordring på dette tidspunkt, som influenzavirus antigen drift ofte overstiger nuværende evner at tilpasse sig den skiftende virussets genom 6. Vaccine strategier rettet mod nye virusstammer skal udvikles på forhånd og er undertiden gøres mindre end optimalt effektive på grund af uforudsete ændringer i de typer af stammer, der i sidste ende dominerer i en influenza sæson. Af disse grunde er der et klart behov for at udvikle alternative terapeutiske strategier for indeholdende infektioner og reducere dødelighed. Ved at opnå en bedre forståelse af vært-virus interaktion, kan det være muligt at udvikle nye anti-influenza-medicin og adjuvans terapier 7, 8.
Den menneskelige vært-influenza A-virus (IAV) interaktion er kompleks. Adskillige dyremodeller for humane IAV infektion er blevet udviklet med henblik på at få indsigt i vært-virus interaktion, herunding mus, marsvin, bomuldsrotter, hamstere, fritter, og makakaber 9. Samtidig med vigtige data, har øget forståelsen af værten-IAV dynamik, hver model organisme besidder betydelige ulemper, der skal overvejes, når du forsøger at oversætte resultaterne i human medicin. For eksempel mus, som er den mest udbredte model, ikke let udvikle IAV-induceret infektion symptomer, når inficeret med human influenzaisolater 9. Dette er fordi mus mangler den naturlige tropisme for human influenza isolater siden muse epitelceller udtrykker a-2,3 sialinsyrebindinger stedet for α-2,6 sialinsyrebindinger udtrykt på humane epitelceller 10. Hæmagglutininet proteiner til stede i human IAV isolater positivt binde og indtast værtsceller bærende a-2,6 sialinsyrebindinger gennem receptor-medieret endocytose 9, 11, 12, 13. Som følge heraf er det nu accepteret, at ved udviklingen musemodeller for human influenza, skal der drages omsorg for at parre den passende stamme af mus med den passende stamme af influenza for at opnå sygdomsfænotyper der rekapitule- aspekter af den menneskelige sygdom. I modsætning hertil epitelceller i de øvre luftveje af fritter besidder a-2,6 sialinsyrebindinger der ligner humane celler 14. Inficerede fritter deler mange af de patologiske og kliniske træk observeret i humane sygdom, herunder sygdomsfremkaldende og overførbarhed af menneskelige og aviær influenza-virus 14, 15. De er også meget modtagelige for vaccine effektivitetsundersøgelserne. Ikke desto mindre er ilder model for human influenza har flere ulemper primært relateret til deres størrelse og omkostningerne ved dyrehold, der gør erhvervelse af statistisk signifisentlige data udfordrende. Derudover har fritter tidligere viste forskelle i farmakokinetik, biotilgængelighed og toksicitet, der gør testning af effektiviteten vanskelig. For eksempel, fritter udviser toksicitet over for M2 ionkanalen inhibitor amantadin 16. Det er således klart, at i at vælge en dyremodel til at undersøge spørgsmål om humane IAV infektioner, er det vigtigt at overveje sine iboende fordele og begrænsninger, samt det aspekt af vært-virus interaktion, der er under undersøgelse.
Den zebrafisk, Danio rerio, er en dyremodel, der giver unikke muligheder for at undersøge mikrobiel infektion, vært immunreaktion, og potentielle lægemiddelterapier 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <sup class = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. Tilstedeværelsen af α-2,6-bundne sialinsyrer på overfladen af celler i zebrafisk foreslog sin modtagelighed for IAV, der blev bekræftet i infektionsstudier og afbildes in vivo ved anvendelse af en fluorescerende reporter stamme af IAV 19. I IAV-inficerede zebrafisk, forøget ekspression af de antivirale ifnphi1 og mxa udskrifter indikerede, at en medfødt immunrespons var blevet stimuleret, og patologi vises af IAV-inficerede zebrafisk, herunder ødem og ødelagt væv, var den samme som observeret i influenzainfektioner menneskelige . Endvidere IAV antivirale neuraminidasehæmmer Zanamivir begrænset mortalitet og reduceret viral replikation i zebrafisk 19.
I denne rapport, en protokol for at indlede systemetic IAV infektioner i zebrafisk embryoner er beskrevet. Brug Zanamivir ved klinisk relevante doser som en proof-of-princippet er nytten af denne zebrafisk IAV infektion model for screening forbindelser til antiviral aktivitet demonstreret. Desuden er en protokol til at frembringe et lokaliseret, epitelial IAV infektion i zebrafisk svømme blære, et organ, der anses for at være anatomisk og funktionelt er analog med den mammale lunge 21, 29, 30, 31, beskrives. Brug af denne lokaliseret IAV infektion model, kan neutrofil rekruttering til infektionsstedet spores, således undersøgelser af den rolle af neutrofil biologi i IAV infektion og inflammation. Disse zebrafisk modeller supplere eksisterende dyremodeller for humane IAV infektioner og er særligt nyttige til afprøvning af små molekyler og immune celleresponser på grund af muligheden for øget sTATISTISK effekt, evne til med moderate high-throughput assays, og evnen til at spore immuncelle adfærd og funktion med lys-mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbejde skal udføres ved hjælp af biosikkerhed niveau 2 (eller BSL2) standarder beskrevet af det amerikanske Centers for Disease Control (CDC) og i overensstemmelse med direktiver fastsat af Institutional Animal Care og Brug udvalg (IACUC). Venligst konferere med de relevante embedsmænd for at sikre sikkerhed og overholdelse.
1. zebrafisk Vedligeholdelse
- Gyde zebrafisk og indsamle det nødvendige antal embryoer til forsøgene. Om nødvendigt masse avl tanke, som dem beskrevet af Adatto et al. 32, kan anvendes til at indsamle et stort antal udviklingsmæssigt-trinvis embryoner.
- Tillad embryoner til at udvikle, indtil den ønskede udviklingsstadiet (48 timer efter befrugtning for en systemisk IAV infektion [§ 3] eller 5 dage efter befrugtning for en lokaliseret, svømme blære infektion [§ 4]) i dybe petriskåle ved lav densitet (< 100 embryoner / skål) ved 28 ° C i sterilt æg vand indeholdende 60 ug / ml havsalt (f.eks Instant Ocean) i destilleret vand.
- Fjern døde fostre med plast transfer pipetter og ændre æg vand dagligt for at sikre optimal sundhed og udvikling.
2. Udarbejdelse af Materialer og reagenser
- Der fremstilles en 4 mg / ml stamopløsning af tricaine-S (justering af pH til 7,0-7,4) i destilleret vand og autoklave. Opbevares ved 4 ° C.
- Træk borosilikatglas kapillærer med filamenter ved hjælp af en mikropipette aftrækker (f.eks Mikropipette Puller med følgende indstillinger: trykindstilling = 100, varme = 550, træk = [ingen værdi], hastighed = 130, tid = 110).
BEMÆRK: Før trimning nålen, vil længden fra, hvor nålen begynder at tilspidse til spidsen af nålen være ca. 12-15 mm. Dette kan variere, imidlertid baseret på præference og anvendelse. En længere, mere gradvis tilspidsning kan være mere foretrukne på grund af den forøgede evne til at gennembore embryo og den reducerede risk af nålen bøjet eller knække. - Smelt 2 g agarose i 100 ml æg vand med en mikrobølgeovn. Foretag plader på at line op og injicere embryoner ved at hælde smeltet agarose i dybe petriskåle og lade den størkne.
- Foretag en 10 mg / ml stamopløsning af zanamivir i nuclease-frit vand. Alikvot og nedfryses til -20 ° C.
- Smelt 0,5 g agarose i 50 ml æg vand med en mikrobølgeovn at gøre embryo montering agarose. Vedligehold i vandbad ved 50 ° C, indtil klar til brug i løbet af billeddannelse.
3. Systemisk IAV Infektion (48 timer efter befrugtningen)
ADVARSEL: Alle forskningsaktiviteter personale bør rådføre sig med deres vejledere og læger vedrørende vaccination før arbejdet påbegyndes med IAV.
- Manuelt dechorionate embryoner på dagen for eksperimentet ved hjælp # 5 pincet. Vær omhyggelig med at fjerne og euthanize embryoner, der er blevet såret i processen i 200 pg / ml tricaine løsning.
- Forberedelse of IAV til mikroinjektion
BEMÆRK: Stammer, der har vist sig at inficere zebrafisk embryoner er influenza A / PR / 8/34-(H1N1) (APR8), influenza A X 31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), og det fluorescerende reporter influenza-stamme NS1-GFP 33. Detaljer om APR8 og X-31, og andre stammer, kan findes på Influenza Forskningsdatabase- Udbrede NS1-GFP stamme af IAV i befrugtede hønseæg som tidligere beskrevet 34, 35. Saml, portion, og titrere allantoisvæske indeholdende IAV, og opbevares ved -80 ° C. Pre-titreret APR8 og X-31 virus kan købes kommercielt.
- Lige før infektion, hurtigt tø en IAV alikvot i behandskede hænder og derefter hurtigt placere på is for at reducere tab af titer.
- Viral fortynding
- Hvis du bruger de APR8 eller X-31 virus, fortyndes til 3,3 x 10 6 æg infektiøs dosis 50% (EID50) / ml i sterilt, iskoldt PBS supplemteret med 0,25% phenolrødt (for at hjælpe med visualisering) i en laminær strømning. Samtidig oprettes en kontrol indeholdende steril PBS med 0,25% phenolrødt.
- Hvis der anvendes NS1-GFP-stamme 33, fortyndes til ca. 1,5 x 10 2 plaque-dannende enheder (PFU) pr nl i sterilt, iskoldt PBS indeholdende 0,25% phenolrødt (for at hjælpe med visualisering) i en laminær strømning. Samtidig oprettes en kontrol indeholdende allantoisvæske fra inficerede hønseæg fortyndet ligesom virus i sterilt PBS med 0,25% phenolrødt.
- Bevar IAV på is, indtil klar til brug.
- Pipette virus opløsning ind mikroinjektion nåle under anvendelse microloader tips lige før brug. Indsæt mikroinjektion nålen ind i passende indehaveren af injektionsapparatet (f.eks MPPI-3 tryk indsprøjtningssystem).
- Mens du ser under stereomikroskop, forsigtigt klippe mikroinjektion nålespidsen med skarpe, steriliseret # 5 pincet.
BEMÆRK: Det er henstilded at mikroinjektion spids blive klippet gradvist. - Træd på pedalen af presset indsprøjtningssystem og tilføre en dråbe mikroskop fordybelse olie på en kalibrering mikrometer dias. Mål diameteren af dråben. Beregn rumfanget af dråben ved anvendelse af ligningen, V = 4 / 3πr 3, hvor V er volumen i nl og r er radius i um.
BEMÆRK: Hvis drop diameter er for lille, kan yderligere glas blive klippet eller trykindstillinger og timing kan justeres. Hvis dråben diameter er for stor, kan trykindstillinger og timing justeres. - Juster tryk og timing af trykket injektor og / eller reclip nålespidsen, indtil den ønskede injektionsvolumen er opnået (typisk 1-3 nl). Trykindstillinger mellem 20 og 30 psi og puls varighed indstillinger mellem 40 og 80 ms er typiske. Juster modtryk, så det tællere kapillartryk men ikke lækker IAV (netto nul tryk).
- Udbrede NS1-GFP stamme af IAV i befrugtede hønseæg som tidligere beskrevet 34, 35. Saml, portion, og titrere allantoisvæske indeholdende IAV, og opbevares ved -80 ° C. Pre-titreret APR8 og X-31 virus kan købes kommercielt.
- Juster Embryoner til injektion
- Bedøver dechorionated embryoner i 200 pg / ml tricaine.
- Når bevægelse ophører, overføre 10-20 embryoer til en 2% agarose plade (udarbejdet i afsnit 2.3) med en plastik pipette. Brug plastik pipette til at fjerne overskydende væske.
- Forsigtigt tilpasse embryoner til mikroinjektion med en brand-poleret og forseglet borosilikatglas kapillarrør. Ved hjælp af en stereomikroskop, forsigtigt orient embryoer, således at kanalen af Cuvier eller den posteriore cardinal vene er i overensstemmelse med mikroinjektion nålen (figur 1A).
- IAV Mikroinjektion
- Sæt forsigtigt mikroinjektion nål ind i kanalen af Cuvier eller den bageste kardinal vene. Træd pedalen til at injicere den ønskede mængde IAV i kredsløbssystemet af embryo (figur 1A). Embryoner kan injiceres mere end én gang, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: injektion bolus skal fejes op i omløb og distribFullrate i hele kroppen. Hvis injektionsvolumen indsamler ved injektionsstedet, fjern embryo fra eksperiment og aflive. - Gentag injektioner på forskellige fostre med kontrol specifik for virusstamme valgte løsning. For APR8 og X-31, skal du bruge kontrol beskrevet i afsnit 3.2.2.1; for NS1-GFP, bruge kontrol beskrevet i afsnit 3.2.2.2.
- Sæt forsigtigt mikroinjektion nål ind i kanalen af Cuvier eller den bageste kardinal vene. Træd pedalen til at injicere den ønskede mængde IAV i kredsløbssystemet af embryo (figur 1A). Embryoner kan injiceres mere end én gang, hvis det er nødvendigt.
- Overfør embryoner til mærket petriskåle indeholdende sterilt æg vand og plads i væksthuse ved 33 ° C.
BEMÆRK: Inficerede embryoer bør dyrkes ved 33 ° C for at understøtte udvidet virusreplikation. Desuden inkubering ved 33 ° C mere nøje efterligner temperaturen af den humane øvre luftveje, som er i tæt kontakt med lavere temperaturer i det eksterne miljø og er hvor IAV infektioner opstår. Embryoner kan akklimatisere sig til et bredt temperaturområde 34.
4. Lokaliseret, svømmeblære IAV infektion i Tg (MPX: mCherry)
- Fremstilling af IAV til mikroinjektion
- Fortynd NS1-GFP stamme og kontrol injektion løsning som beskrevet i afsnit 3.2.
- Forbered nåle som beskrevet i afsnit 2.2.
- Juster Tg (MPX: mCherry) 35 larver indeholder oppustede svømmeblære som beskrevet i afsnit 3.3 med følgende undtagelse. Juster larver på en sådan måde, at nålen kan gennembore svømme blære, og viruset kan deponeres ind bagende over svømmeblære, som tidligere beskrevet 36 (figur 2A).
- IAV Mikroinjektion
- Sæt forsigtigt mikroinjektion nål ind i svømme blæren og injicere den ønskede mængde (f.eks 5 nl) mod den bageste af strukturen (figur 2A).
BEMÆRK: Injektionen bolus bør indsamle mod bageste og svømme blære s luftboble skal be forskudt fremad. GFP-ekspression bør begynde at blive observeret ved 3 timer efter injektion. - Gentagne injektioner med kontrol specifik for stamme af virus valgt, som beskrevet i afsnit 3.4.2 løsning.
- Sæt forsigtigt mikroinjektion nål ind i svømme blæren og injicere den ønskede mængde (f.eks 5 nl) mod den bageste af strukturen (figur 2A).
- Overfør larver til petriskåle indeholdende sterilt æg vand og plads i væksthuse ved 33 ° C.
5. Antiviral Drug Treatment
BEMÆRK: Protokollen nedenfor beskriver zanamivir behandling tidligere vist i Gabor et al. 19. Denne protokol kan modificeres til at screene andre antivirale lægemidler og har potentiale til at modificeres til at screene multiple forbindelser i en plade med 96 brønde, high-throughput format.
- På 3 timer efter infektion, erstatte æg vand af NS1-GFP- og kontrol-inficerede fisk med sterilt æg vand indeholdende 0, 16,7, eller 33,3 ng / ml Zanamivir.
BEMÆRK: Disse koncentrationer blev valgt for at forsøge at replikere de fysiologiske niveauer opnået following administration af zanamivir i humane patienter (100, 200, eller 600 mg, iv, to gange dagligt eller 10 mg inhaleret, to gange dagligt). De serumkoncentrationer i mennesker varierede fra 9,83 til 45,3 ng / ml 36. - I løbet af 5 dage, skifte æg vand hver 12 timer og erstatte med sterilt æg vand, der indeholder den passende mængde Zanamivir.
- Spor Kursus af infektion.
- Bedøver zebrafisk i 200 pg / ml tricaine. Overvåg GFP-ekspression ved stereo fluorescensmikroskopi til visuelt observere forskelle i smittemønstrene mellem IAV-inficerede og kontrol fisk og blandt fiskene nedsænket i de forskellige koncentrationer af lægemidler.
- Spor sygelighed og dødelighed i løbet af 5 dage.
- Optag observationer om infektion dynamik relateret til sygdom patologi, herunder tegn på sløvhed og dokumentation af ødem, forskelle i pigmentering, okulær og kraniofaciale misdannelser, og lordose. sygdom patologitypisk viser sig i kontrol inficeret fisk på 24-48 timer efter injektion, afhængigt af mængden af virus injiceret. Saml billeder 24 timer efter injektion.
- Hver 24 timer i 5 dage efter infektion, registrere antallet af døde, morbid, og sunde larver. Døden er defineret ved fravær af en mærkbar hjertebanken. Plot data som ønsket. For eksempel plot data som et stablet søjlediagram, med procentdele af sund, sygelig eller døde fisk afbildet på y-aksen og behandlingsgruppen på x-aksen. 19
BEMÆRK: Døde kan scoret af Kaplan-Meier-overlevelse skøn. Afhængig af anvendelsen, kan det være hensigtsmæssigt at udvikle alternative metoder til scoring fisk sygelighed, herunder en scoring matrix, der kan kvantificere grader af sygelighed baseret på de ovennævnte patologiske træk observeret. - Rådfør dig med en statistiker til at anvende de relevante statistiske analyser.
6. neutrofilmigration
BEMÆRK: Protokollen nedenfor beskriver en metode til sporing neutrofil migration til svømmeblære efter en lokaliseret, epitelial IAV infektion. De beskrevne fremgangsmåder kan modificeres for at afprøve virkningerne af genetiske og kemiske manipulationer. Brug af denne teknik, vil det være muligt at karakterisere mekanismerne bag neutrofil adfærd under en IAV infektion.
- Montering zebrafisk for Imaging
- Bedøver larver, der skal afbildes i 200 ug / ml tricaine.
- Overfør en individuel Tg (MPX: mCherry) larve, der er blevet inficeret med NS1-GFP til en brønd i en 24 brønd, glas bundplade i en lille dråbe af æg vand (~ 50-100 pi). Gentag med andre IAV-inficerede og kontrol fisk.
- Tilsæt langsomt 1% medier agarose foster montering til hver brønd (afsnit 2.5), pas på ikke at indføre store bobler.
- Juster forsigtigt positionen af larve, så den er monteret på sin side.Goody og Henry 37 beskriver hvordan man laver sonder, der fungerer godt i dette program ved hjælp af insekt ben, der er monteret i borosilikatglas kapillærer med filamenter og superglued på plads.
- Når agarose hærder, forsigtigt fylde de enkelte brønde med æg vand indeholdende 200 pg / ml tricaine.
- Med en konfokal mikroskop, fange az stak serie af lysfelt og fluorescens billeder ved hjælp af en 20X objektiv fokuseret på svømmeblære.
- Indstil de øvre og nedre grænser, så de fange alle synligt observerbar grøn og rød fluorescens.
- Tag billeder på 2,0 mikrosekunder / pixel med trin, der er ≤ 4 um. Øget tid per pixel og reducere afstanden mellem trin (f.eks 0,5-1,0 um) øger billedopløsning og kvalitet.
- Generer et todimensionalt billede ved at flette lag.
- Sammenlign antallet af MPX-mCherry-positive neutrofiler Present jegn de svømmeblære af IAV-inficerede og kontrol-injicerede zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her bliver data, der viser, hvordan systemisk IAV infektion i zebrafisk kan anvendes til at teste lægemiddelvirkningsfuldhed (figur 1A) billede. Embryoner efter 48 timer efter befrugtning injiceres med APR8 (figurerne 1C, 1F), X-31 (figurerne 1D, 1G), eller NS1-GFP (fig 1H-1I) via kanalen af Cuvier at indlede en virusinfektion. En anden kohorte af embryoner på 48 timer efter befrugtningen blev injiceret for at tjene som kontrol for virusinfektion (figur 1B, 1E). Med 48 timer efter infektion, zebrafisk injiceret med IAV udviste tegn på perikardial ødem (fig 1C, 1D) og kredsløbsstop (figur 1F), med erythrocytter, som ligger rundt hjertesækken (figur 1G). Brug af NS1-GFP, den indledende ekspression af GFP ved fluorescensmikroskopi så tidligt som blev observeret 3 timer efter infektion. På det tidspunkt blev zebrafisk udsat for en 33,3 ng/ Ml dosis af neuraminidase-inhibitor Zanamivir. Denne dosis svarer nogenlunde til en dosis på 200 mg givet til menneskelige patienter. Kontrol inficerede fisk ikke er udsat for Zanamivir (figur 1H, 1H ') udviste træk af ødem og systemisk GFP udtryk. Reduceret brutto patologi og GFP-fluorescens (figur 1I, 1I ') i NS1-GFP-inficerede larver udsat for Zanamivir blev observeret. Reduktionen i GFP var mest mærkbar i ligene af larver, mens meget lille ændring blev observeret i blommesække. Fisk behandlet med Zanamivir udstillet mindre sygelighed, som det fremgår af en forbedret svømning motilitet og reducerede niveauer af ødem i hjertet, og forbedret overlevelse. Disse resultater supplerer en mere omfattende undersøgelse 19 og viser værdien af denne model til screening stof.
En lokaliseret zebrafisk svømme blære infektion model 31 er blevet tilpasset for IAV infektion. NS1-GFP virus blev injiceret i de svømmeblære af 5 d post-befrugtning Tg (MPX: mCherry) larver at indlede en lokaliseret, epitelial infektion (figur 2A). PBS blev injiceret i svømmeblære som en kontrol for at demonstrere specificiteten af neutrofil rekruttering mod IAV-inficerede celler. Rekrutteringen af mCherry-mærkede neutrofiler ind i svømmeblære blev sporet. Ved 20 timer efter infektion, betydelig migration af neutrofiler ind i svømmeblære af IAV-inficerede fisk i forhold til PBS-injicerede kontroller (figurerne 2B, 2B ', 2C, 2C') blev observeret. Disse data viser, at IAV kan rekruttere neutrofiler til svømmeblære, ligesom det rekrutterer neutrofiler til den humane lunge.
Figur 1: Antiviral narkotikabehandling afbøder sværhedsgraden af IAV infektion i zebrafisk. (A (B - I) makroskopisk patologi og GFP-fluorescens af zebrafisk embryoner injiceret ind i kanalen af Cuvier med IAV. (BG) Fisk inficeret med IAV og undersøgt ved 48 timer efter infektion for tegn på viral infektion og sygdom. (B - D) Enkelt fokale planer af kontrol eller IAV-inficerede fisk blev indsamlet (sidemonteret, forreste venstre, dorsale top, 4X forstørrelse, skala bar = 500 um). (B) Kontrol fisk blev injiceret med PBS og vise normal morfologi. (C - D) Embryoner inficeret med APR8 (C) eller X-31 (D), almindeligvis udviste perikardial ødem (fyldt pil). Embryoner havde også nekrotisk væv, tydelig i (C). (E) Kontrol fisk blev injiceret med PBS og ikke viser nogen tegn på patologi (skala bar = 250 um). (F) Embryoner inficeret med APR8 viser kredsløbssygdomme anholdelse (indskåret pilespids, skala bar = 250 um). (G) Embryo injiceret med X-31 influenza displays både perikardial ødem (pil) og samlede erythrocytter hele hjertesækken (takkede pilespids, skala bar = 100 um). (H, I) Repræsentative billeder, der viser effekter af et antiviralt lægemiddel på IAV-inficerede zebrafisk (skala bar = 200 um). (H) Lysfelt og (H) fluorescens billede, der viser et foster injiceret med NS1-GFP (ingen antiviralt lægemiddel behandling). Bemærk ødem og GFP udtryk især i den fælles kardinal vene region. (I, I ') Behandling med et antiviralt lægemiddel reducerede inficereion, målt som reduceret patologi, herunder formindsket ødem og formindsket GFP-ekspression i den hvide stiplede omrids af kroppen, især i karsystemet, hvilket er tegn på reduceret viral byrde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Neutrofile rekrutteres til steder med lokaliseret IAV infektion. (A) Skematisk viser injektionen tilgang er nødvendig for at indlede en lokaliseret IAV infektion i en oppustet zebrafisk svømmeblære ved 5 d efter befrugtningen. (B, C) Neutrofil rekruttering til svømmeblære efter NS1-GFP-infektion. Z-stack billeder (4 um trin) blev opsamlet ved konfokal mikroskopi (20X forstørrelse). Billeder var fladspændte i to dimensioner (sidemonteret, forreste venstre, dorsal øverst). Tg (MPX: mCherry) zebrafisk (5 d efter befrugtning) blev injiceret med (B, B ') allantoisvaeske fortyndet med PBS og 0,25% phenolrødt eller (C, C') NS1-GFP (7,2 × 10 2 PFU / embryo) fortyndet i allantoisvæske og PBS med 0,25% phenolrødt. På 16 timer efter infektion, neutrofiler var til stede i en IAV-inficeret svømmeblære (C, C ': grøn fluorescens viser lokaliseret infektion, C: røde blodlegemer er neutrofiler, hvid pil identificerer repræsentativt neutrofil). (B, B ') Intet bevis for GFP-ekspression indikerer IAV infektion og ingen rekruttering af neutrofiler til svømmeblære blev observeret i larver injiceret med allantoinvæsken i PBS. please klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at maksimere fordelene erfaringer fra at bruge et lille dyr til at modellere menneskelige vært-patogen interaktioner, er det vigtigt at indramme forskningsspørgsmål og afprøve hypoteser, der udnytter de iboende fordele ved modelsystemet. Som model for menneskelig IAV infektion, den zebrafisk har flere styrker, herunder høj frugtbarhed, optisk klarhed, modtagelighed for screening narkotika, og tilgængeligheden af transgene linier, som mærker immunceller som neutrofiler. Zebrafisk er blevet udviklet som en stadig stærkt alternativ til musen modelsystem til undersøgelse af inflammation og medfødte immunitet. Fordi de mangler en fungerende adaptive immunrespons i de første 4-6 uger af udvikling, zebrafisk mount medfødte immunrespons til at beskytte mod skader og infektion 37. Under denne tidlige periode i udvikling, er det muligt at isolere og studere mekanismer for antiviralt respons som følge af medfødte immunreaktion alene. This arbejde er blevet lettet ved udviklingen af transgene zebrafisk linjer som Tg (MPX: mCherry), hvilke etiketter neutrofiler med en rød fluorescerende protein.
Zebrafisk modeller for IAV infektion, der ligner den humane sygdom blev for nylig beskrevet 19. Det blev påvist, at zebrafisk besidder a-2,6-forbundne sialsyrerester på deres celler, der giver IAV virus tropisme at binde, vedhæfte, og trænge ind i cellerne. I dette manuskript og i Gabor et al. 19, er det blevet vist, at to forskellige stammer af IAV (A / PR / 8/34-[H1N1] og X-31 A / Aichi / 68 [H3N2]), såvel som den rekombinante NS1-GFP-stamme, der resulterer i GFP translation i inficerede celler, kunne inficere, replikere og mortalitet, når de injiceres i kredsløbssystemet af larvernes zebrafisk. Injektion af viruset er kritisk for denne infektion metode, som eksponering for IAV via nedsænkning ikke virker pålideligt. Inficerede fisk bør være overførselrød til en 33 ° C inkubator for at sikre viral replikation. Det er vigtigt at bemærke, at det menneskelige luftveje, hvor influenzainfektioner forekommer, er typisk 33 ° C. Inkubation ved 28 ° C, hvilket er mere typisk temperatur i zebrafisk inkubering ikke giver en pålidelig infektion. Endvidere er det vigtigt at teste hvert parti modtaget fra fabrikanten eller parti IAV produceret før anvendelse i et forsøg på grund af variabilitet, der påvirker infektivitet og sygdomsudvikling i zebrafisk. Når den infektive dosis titreres korrekt, bør langt de fleste af zebrafisk inficeret med disse stammer af IAV udviser brutto sygdomsfænotyper karakteriseret ved ødem, så tidligt som 24 timer efter infektion, der gradvis forværres, kraniofaciale abnormiteter med 48 timer efter infektion, lordose ved 72 timer efter infektion, og ca. 50% bør bukke under for infektion med 5 d efter infektion. Histopatologi ved 48 timer efter infektion bør indeholde beviser for gill, hoved nyre, oglevernekrose, samt tegn på væske i hjertesækken. Ved oprettelse af disse resultater som det forudsigelige resultat af en IAV infektion hos zebrafisk, er det muligt at screene kandidat anti-influenza narkotika sammensatte kandidater. Med dette i tankerne, et proof-of-principle protokol til screening af et antiviralt lægemiddel baseret på oprindelige resultater, der er beskrevet i Gabor et al. 19 demonstreres. Brug af neuraminidasehæmmer Zanamivir, i en dosis, der forudsiges at efterligne observerede niveauer i humant blod, forsinket indtræden af sygelighed og reduceret mortalitet gennem en tilsyneladende virkning på virusreplikation / spredning, som bestemt ved NS1-GFP-fluorescens, iagttoges. Zebrafisken IAV model er velegnet til med moderate til high-throughput lille molekyle skærme. Fordi infektioner kun kan ske kun gennem manuel injektion i omløb via kanalen af Cuvier eller bageste kardinal vene, er størrelsen af skærmene begrænset af antallet af teknikere Estaboprettelse af infektioner og deres færdigheder i at udføre teknikken. Alligevel er det muligt at injicere mindst 200 zebrafisk embryoner pr tekniker per time. Mens succes med at demonstrere antiviral aktivitet for Zanamivir i en zebrafisk infektion model, må det erkendes, at narkotika screening i alle dyremodeller, herunder zebrafisk, skal omhyggeligt kontrolleres 38. Den måde en lægemiddel absorberes og metaboliseres afviger fra animalsk-til-dyr, og er vanskelig at forudsige. Men som en fremgangsmåde til screening af nye anti-influenza lægemidler, denne zebrafisk IAV infektion model præsenterer en spændende mulighed for at overskue mange tusinde små molekyler i et dyr med organer ortologe til mennesker og med højt konserverede integrativ fysiologi.
Ud over at være en model for systemisk infektion, kan den zebrafisk også tjene som en model for lokaliseret infektion, når IAV sprøjtes ind i svømmeblære 19 21, 29, 30, 31. Ved korrekt titreres, bør zebrafisk, som er smittet med NS1-GFP stammen på 5 d efter befrugtning udviser tegn på punktformig fluorescens omkring epitel af svømmeblære med 1 d efter infektion. Under anvendelse af denne lokaliseret infektion strategi, kan neutrofil adfærd som reaktion på infektionen spores. Ligesom humane neutrofiler, zebrafisk neutrofiler er en hovedstol cellulær mediator i medfødte immunitet, fungerer under akutte reaktioner på vævsskade og infektion og spille kritiske roller under kronisk inflammation 24. Der er en voksende erkendelse af, at neutrofiler spiller en afgørende rolle i immunresponset på influenza-infektion. Det har nemlig vist sig, at neutrofiler funktion som "tveæggede sværd" i mediering af immunresponsen. While afgørende for det antivirale respons nødvendigt for at kontrollere influenzainfektioner, neutrofiler bidrager også til en alt inflammatorisk miljø i lungen, som kan beskadige værtsvæv og øge risikoen for dødelighed 39, 40, 41, 42, 43. Der er betydelig bevarelse af gen synteny mellem zebrafisk og menneskelige genomer, og med denne orthology, er der også en betydelig funktionel bevaring i neutrofil biologi. Zebrafisk neutrofiler bærer mange ligheder med humane neutrofiler, herunder en polymorf kerne, tilstedeværelsen af primære og sekundære granuler, og funktionel myeloperoxidase og NADPH oxidase 22. Desuden kan zebrafisk neutrofiler opsluge bakterier og slip neutrofile ekstracellulære fælder (net) 44. Adskillige transgene zebrafisk linjer er blevet developed at hjælpe med at identificere og dissekere funktioner neutrofile biologi 27, 45, 46, 47. Denne infektion protokol er fleksibel og kan modificeres til at teste flere neutrofile funktioner ved hjælp af disse alternative værktøjer. Denne lokaliserede zebrafisk IAV infektion model gør det muligt for spørgsmål relateret til immunresponset vært, der skal behandles, og især dem, medieret af neutrofiler.
Undersøgelser i mammale modelarter har givet værdifulde oplysninger 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, men få realtid forsøg med IAV infektion have blevet udført, hvilket begrænser forståelsen af det komplekse samspil mellem komponenterne af hvirveldyr medfødte immunreaktion i værten. I det seneste årti er brugen af zebrafisk dyremodelsystem gav et vendepunkt af oplysninger om vært-patogen interaktioner 21, 47, 56, 57, og har også tilbudt vigtig information som et værktøj til opdagelse af lægemidler. En kombination af molekylære teknikker og imaging mikroskopi har tilladt en bedre forståelse af medfødte immunrespons, og hvordan disse er manifesteret i vivo 17, 18, 27. Opdagelsen af, at zebrafisk kan være inficeret med IAV 19, og at zebrafisk aktier vigtige immunologiske ligheder med pattedyr, herunder menneske, har åbnet døren til studietaf en vigtig menneskelig viralt patogen. De beskrevne protokoller kan tilpasses andre applikationer og har potentiale til at give kritiske opdagelser vedrørende vært-virus interaktioner, der kan have dybtgående kliniske virkninger for menneskers sundhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | ||
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
| Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
| Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
| Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 |
References
- W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
- W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
- De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
- von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
- Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
- Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531 (2000).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
- Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
- Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
- Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
- de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
- Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
- Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
- Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
- Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
- Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
- Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
- Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
- Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715 (2011).
- Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
- Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436 (2013).
- Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
- Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
- Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378 (2016).
- Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
- Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
- Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
- Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
- Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
- Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
- Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
- Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).
