Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

Published: January 26, 2017 doi: 10.3791/55236
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Microbiology, The University of Texas Southwestern Medical Center
* These authors contributed equally

Abstract

सक्रिय प्रोटीन, प्रोटीन और प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड परिसरों की शुद्धि enzymatic गतिविधियों और नए सिरे से उपन्यास सब यूनिटों और बाद translational संशोधनों की पहचान के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है। बैक्टीरियल सिस्टम अभिव्यक्ति और एकल polypeptides और प्रोटीन परिसरों की एक विस्तृत विविधता की शुद्धि के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, इस प्रणाली प्रोटीन है कि बाद translational संशोधनों (जैसे, फोस्फोराइलेशन और एसिटिलीकरण) होते हैं की शुद्धि, और उपन्यास नियामक सब यूनिटों कि केवल मौजूद हैं / यूकेरियोटिक प्रणाली में व्यक्त की पहचान के लिए सक्षम नहीं है। यहाँ, हम एक उपन्यास, मजबूत, और कुशल संगठनों ने मिलकर आत्मीयता शुद्धि (नल) विधि का उपयोग कर STREP- और झंडा टैग प्रोटीन है कि कोशिकाओं से क्षणिक या स्थिरतापूर्वक व्यक्त मिलान टैग प्रोटीन के साथ प्रोटीन परिसरों की शुद्धि की सुविधा का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल prot को चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकताein जटिल कार्यक्षमता, जटिल सब यूनिटों पर बाद translational संशोधनों को खोजने के लिए, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उपन्यास नियामक जटिल घटकों की पहचान करने के लिए। विशेष रूप से, इस नल विधि यूकेरियोटिक या रोगजनक (वायरल और बैक्टीरियल) घटकों द्वारा गठित प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के लिए, इस प्रकार नीचे की ओर प्रयोगात्मक अवसरों की एक विस्तृत सरणी से बेदखल लागू किया जा सकता है। हम प्रस्ताव है कि प्रोटीन परिसरों के साथ काम कर रहे शोधकर्ताओं के कई अलग अलग तरीकों से इस दृष्टिकोण का उपयोग कर सकता है।

Introduction

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (PPIs) जैविक प्रक्रियाओं 1, और इन PPIs पर आगे की पढ़ाई की सटीक विनियमन के लिए महत्वपूर्ण उनके कार्य 2 के बारे में सूचित कर सकते हैं। कई दृष्टिकोण से अध्ययन और PPIs के लक्षण वर्णन के लिए और साथ ही उपन्यास नियामक प्रोटीन घटकों के नए सिरे से पहचान के लिए तैयार किया गया है। 1989 में, स्टेनली फील्ड्स और उनके सहयोगियों खमीर दो संकर (Y2H) परख 3 की सूचना दी। यह दृष्टिकोण interactors (preys) ब्याज (चारा) का एक निर्धारित प्रोटीन के लिए Saccharomyces cerevisiae में की निष्पक्ष और व्यापक पहचान के लिए अनुमति देता है। PPIs की खोज के लिए अपनी उल्लेखनीय उपयोगिता के अलावा, Y2H परख, खमीर कोशिकाओं में प्रोटीन जोड़े निस्र्पक न्यूनतम बातचीत डोमेन को परिभाषित करने, और परिवर्तन है कि इस तरह की बातचीत समाप्त की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Y2H परख संशोधित करके, PPIs भी स्तनधारी कोशिकाओं में अध्ययन किया जा सकतावर्ग = "xref"> 4। Y2H परख (जैसे, खमीर तीन संकर प्रणाली) का बदलाव भी अध्ययन करने के लिए प्रोटीन-शाही सेना और कोशिकाओं में प्रोटीन-छोटे कार्बनिक ligand बातचीत के लिए लागू किया जा सकता है।

एक मुताबिक़ प्रणाली में PPIs अध्ययन करने के लिए एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया उपकरण सह immunoprecipitation (सह आईपी) परख 5 है। ब्याज की एक प्रोटीन immunoprecipitate के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग करके, सह-आईपी परख शोधकर्ताओं ने विभिन्न पर्यावरण की स्थिति और प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए कोशिकाओं में PPIs नजर रखने के लिए अनुमति देता है। मिलान टैग प्रोटीन (जैसे, झंडा, Myc, स्ट्रेप, और हा, दूसरों के बीच) में आत्मीयता शुद्धि (एपी) तरीकों कई नीचे की ओर assays के लिए जटिल प्रोटीन मिश्रण, पश्चिमी धब्बा सहित से प्रोटीन के अलगाव की है, चांदी दाग का उपयोग , और enzymatic विश्लेषण। हालांकि, इन पिछले दृष्टिकोण से कोई भी शामिल है, में इन विट्रो एक और लक्षण वर्णन के लिए प्रोटीन परिसरों की बड़ी मात्रा के अलगाव के लिए सक्षमssays, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और बाद translational संशोधनों की पहचान के द्वारा नियामक सब यूनिटों की खोज। एपी विधि के एक उन्नत संस्करण अग्रानुक्रम एपी (नल) है, जो दो epitopes कि दो बाद ए पी एस 6, 7 के माध्यम से शुद्ध होता है के साथ एक संलयन प्रोटीन बनाने के द्वारा PPIs के अध्ययन के लिए एक शोधन तकनीक है कहा जाता है। इस अनुच्छेद में, हम शुद्ध प्रोटीन परिसरों, जिसमें दो यूनिटों अलग epitopes के साथ टैग कर रहे हैं और फिर दो अनुक्रमिक प्राधिकृत व्यक्तियों (स्ट्रेप एपी झंडा आईपी के बाद) के माध्यम से शुद्ध के लिए नल विधि के विभिन्नता प्रस्तुत करते हैं। हम पहले, चित्रा (1) एक न्यूनतर नल का अवलोकन और फिर सभी प्रयोगात्मक कदम की एक विस्तृत वर्णन (चित्रा 2) प्रदान इतनी है कि शोधकर्ताओं ने उन्हें अपने हित के प्रोटीन जटिल करने के लिए आवेदन कर सकते हैं।

नल पद्धति के प्रयोग को प्रदर्शित करने के लिए, हम एक अच्छी तरह से विशेषता cyclin-CDK जटिल (पीटी के रूप में भेजा चुनाEFB काइनेज) है, जो नियामक सबयूनिट cyclin T1 (CycT1) और एक काइनेज (CDK9) से बना है, और शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय (पोल द्वितीय) 8, 9, 10 से प्रतिलेखन के नियमन में शामिल है। पी-TEFb पोल द्वितीय और उसके संबंधित नकारात्मक बढ़ाव कारक है, जो प्रमोटर पर ट्रांसक्रिप्शनल रोक से राहत मिलती है के सी टर्मिनल डोमेन phosphorylates और इस तरह प्रतिलेखन बढ़ाव 11, 12, 13 की सुविधा। इसे ध्यान में जाना जाता है बातचीत के साथ, स्ट्रेप टैग CycT1 और झंडा टैग CDK9 HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त खत्म हो गया। एक पारस्परिक नल प्रयोग स्ट्रेप टैग CDK9 और झंडा टैग CycT1 के साथ प्रदर्शन किया गया था और आगे मान्य करने के लिए है कि प्रोटीन बातचीत epitopes उपयोग किया से स्वतंत्र है। कोशिकाओं को एकत्र और lysed 48 घंटे के बाद अभिकर्मक थे। घुलनशील lysate नल से शुद्ध किया गया था (स्ट्रेप एपी झंडा द्वारा पीछा कियाआईपी)। इनपुट और शुद्ध प्रोटीन पश्चिमी धब्बा और चांदी के दाग (चित्रा 3) द्वारा विश्लेषण किया गया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. चढ़ाना प्रकोष्ठों

  1. एक दिन अभिकर्मक के लिए पहले, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 10 एमएल 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में 3.5 x 10 6 HEK293T कोशिकाओं थाली (10,000 यू / एमएल शेयर) 100 मिमी पकवान प्रति। प्लेट 3 - 5 100 प्रति प्रयोग / हालत मिमी बर्तन पर्याप्त प्रोटीन वसूली सुनिश्चित करने के लिए।
    नोट: प्लेटों की संख्या एक प्रयोग / हालत है, जो अभिव्यक्ति के स्तर और ब्याज की प्रोटीन जटिल की घुलनशीलता पर निर्भर करेगा के लिए निर्धारित किया है। वैकल्पिक रूप से, अगर बड़े पैमाने शुद्धि की जरूरत है, सेल लाइनों स्पिनर बोतल 2 में निलंबन में विकसित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन इस विधि क्षणिक transfections के लिए काम नहीं करेगा।

2. कोशिकाओं transfecting या स्थिर सेल लाइनों उत्प्रेरण

  1. अगले दिन, खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें। संस से पहले 80% मिला हुआ - प्रकोष्ठों 70 होना चाहिएका संपादन।
  2. 100 मिमी पकवान प्रति अभिकर्मक अभिकर्मक के प्लास्मिड डीएनए के 7 माइक्रोग्राम और 21 μl की कुल मिश्रण के साथ कोशिकाओं transfect। अभिकर्मक दक्षता के लिए एक नियंत्रण के रूप में एक वेक्टर व्यक्त GFP (तालिका 1) के साथ Transfect कोशिकाओं।
    नोट: एक HEK293 टी-रेक्स या इसी तरह स्थिर सेल लाइन है कि डॉक्सीसाइक्लिन 14, 15 के जवाब में दो या दो से अधिक जटिल सब यूनिटों की अभिव्यक्ति लाती का उपयोग करते हैं, inducer कोशिकाओं को जोड़ा गया है और 48 घंटे के लिए incubated करना होगा। इसी तरह, एक स्थिर सेल लाइन है कि inducer के अलावा पर GFP की अभिव्यक्ति लाती भी सत्यापन उद्देश्यों के लिए आवश्यक होगा। कदम के लिए 2.7 से आगे बढ़ें।
  3. 100 मिमी पकवान प्रति अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें। एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कुल प्लास्मिड डीएनए (दो या अधिक plasmids के लिए इसी) के 7 माइक्रोग्राम साथ unsupplemented DMEM के 500 μl मिश्रण। एक अलग microcentrifuge ट्यूब में, unsupplemented DMEM वाई के 500 μl मिश्रणअभिकर्मक अभिकर्मक वें 21 μl। प्रत्येक अभिकर्मक प्रतिक्रिया के लिए दोहराएँ।
  4. प्लास्मिड डीएनए समाधान में अभिकर्मक अभिकर्मक समाधान पिपेट (रिवर्स क्रम में समाधान मिश्रण नहीं है)। pipetting कम से कम 4 बार से मिलाएं।
  5. 10 के लिए कमरे के तापमान पर इस मिश्रण को सेते - 15 मिनट है, लेकिन 15 मिनट से अधिक समय नहीं।
  6. एक मीडिया जलाशय बनाने के लिए और ध्यान से कोशिकाओं को परेशान करने के बिना थाली के आंतरिक पक्ष पर अभिकर्मक मिश्रण पिपेट बूंद-वार के लिए थाली झुकाएँ। अपने मूल फ्लैट की स्थिति के लिए पकवान लौटें और धीरे ज़ुल्फ़ मिश्रण वितरित करने के लिए।
  7. (इस हालत इसके बाद "के रूप में टिशू कल्चर इनक्यूबेटर" कहा जाता है) 5% सीओ 2 के साथ एक humidified सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं। मीडिया 5 घंटा बाद अभिकर्मक (वैकल्पिक) बदलें।

3. जाँच हो रही है अभिकर्मक या प्रेरण क्षमता

  1. 24 घंटा बाद अभिकर्मक में एक फ्लू के तहत कोशिकाओं कल्पनाorescent माइक्रोस्कोप अभिकर्मक दक्षता (या नियंत्रण HEK293T-रेक्स स्थिर सेल व्यक्त GFP लाइन की प्रेरण) के लिए जाँच करें। एक और 24 घंटे के लिए सेते हैं।

4. स्ट्रेप आत्मीयता शुद्धि (स्ट्रेप एपी)

  1. कोशिकाओं को इकट्ठा
    1. 48 घंटा बाद अभिकर्मक में मीडिया को हटाने और ठंड 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 8 मिलीलीटर जोड़ें। थाली से कोशिकाओं को अलग करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और।
    2. लीजिए और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण और कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 800 XG पर नीचे स्पिन।
    3. पीबीएस सतह पर तैरनेवाला निकालें। किसी भी अवशिष्ट पीबीएस समाप्त करने के लिए (4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 800 XG) स्पिन नीचे दोहराएँ। भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली स्टोर या प्रोटीन शुद्धि जारी रखने के लिए नीचे प्रक्रिया का पालन करें।
  2. कोशिकाओं lysing
    1. निष्क्रिय lysis बफर के सेल छर्रों × सेल गोली मात्रा 5 का उपयोग कर (~ प्रति प्लेट 250 μl) Resuspend(पीएलबी: 20 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 1.5 मिमी MgCl 2, 1 मिमी डीटीटी, protease अवरोध कॉकटेल गोली, 5% वी / वी ग्लिसरॉल, और 1.0% एनपी 40) और एक सेल निलंबन हस्तांतरण 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब।
    2. संक्षेप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए निलंबन और डोलना भंवर।
    3. नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर सेल निलंबन स्पिन।
    4. एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में घुलनशील lysates स्थानांतरण और सेल छर्रों त्यागें। के रूप में घुलनशील lysate के अंतिम मात्रा का 10% सहेजें "स्ट्रेप एपी इनपुट।" 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. स्ट्रेप मोती equilibrating
    नोट: उपयोग स्ट्रेप पहले एपी कदम के लिए मोती! स्ट्रेप मोती झंडा मोतियों के साथ नीचे खींच लिया उन लोगों की तुलना में काफी अधिक प्रोटीन की वसूली के साथ परिसरों नीचे खींच लिया।
    1. बाहर ले जाओ (एन 40 μl ×) + N 50% स्ट्रेप मनका घोल का μl (एन = नमूनों की संख्या) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर नीचे स्पिन।
      नोट: वाइड-M उपयोगपिपेट मोती outhed टिप्स।
    2. तैरनेवाला निकालें और मोती के लिए पीएलबी के 500 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मोती मिश्रण डोलना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर स्पिन।
      1. 3 washes के एक कुल के लिए दोहराएँ। 40 μl × n के अंतिम मात्रा को पीएलबी में मोती resuspend।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्रत्येक सेल lysate नमूना और डोलना करने के लिए 50% स्ट्रेप मनका घोल के 40 μl जोड़ें।
  4. स्ट्रेप एपी
    1. नीचे 4 सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर समाधान स्पिन।
    2. "स्ट्रेप एपी प्रवाह के माध्यम से (एफटी)" के रूप में सतह पर तैरनेवाला और दुकान हटाये 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. स्ट्रेप एपी धो बफर मैं (20 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, 250 मिमी NaCl, 1.5 मिमी MgCl 2, 1 मिमी डीटीटी, 5% ग्लिसरॉल और 0.2% एनपी 40) मोती के 500 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए मोती मिश्रण डोलना। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      1. 4 washes के एक कुल के लिए दोहराएँ।
    4. 500 μl धो बफर द्वितीय (100 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, और 1 मिमी EDTA) जोड़ें और ट्यूबों inverting द्वारा मोती संतुलित करना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. स्ट्रेप क्षालन बफर (100 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, और 2.5 मिमी Desthiobiotin) के 50 μl के साथ ब्याज की प्रोटीन Elute। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 800 rpm पर भंवर।
    6. नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 1,500 XG पर मोती स्पिन। सतह पर तैरनेवाला लीजिए। यह अंश "स्ट्रेप एपी क्षालन" नमूना से मेल खाती है।
    7. एक दूसरे क्षालन, जो प्रोटीन की मात्रा पहले क्षालन के साथ प्राप्त के आधे तक उपज सकता है के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मोती अंश को बचाओ। अशेष 10 चांदी धुंधला और / या पश्चिमी सोख्ता के लिए स्ट्रेप एपी क्षालन का%16।
  5. झंडा मोती equilibrating
    1. (NX 16 μl) + N झंडा मोती समाधान के μl (एन = नमूनों की संख्या) बाहर ले जाओ और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर नीचे स्पिन।
      नोट: पिपेट मोती के लिए चौड़े मुँह युक्तियों का उपयोग करें।
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और झंडा धोने बफर के 500 μL जोड़ने (100 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, और 0.1% एनपी 40) मोती। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर स्पिन। 3 washes के एक कुल के लिए दोहराएँ।
    3. NX 16 μl के अंतिम मात्रा झंडा धो बफर में मोती resuspend।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष स्ट्रेप एपी क्षालन और डोलना रात भर झंडा मनका घोल के 16 μl जोड़ें।

5. झंडा आईपी

  1. नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर झंडा मोती निलंबन स्पिन। 4 डिग्री सेल्सियस पर तैरनेवाला और "ध्वज आईपी प्रवाह के माध्यम से" (एफटी) के रूप में की दुकान बचाओ।
  2. 500 जोड़े81; समाधान झंडा धो बफर के एल। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए डोलना। 4 washes के एक कुल के लिए दोहराएँ और प्रत्येक धोने के बाद सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    नोट: चौथे धोने से पहले, एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब प्रोटीन-मोती हल हस्तांतरण पृष्ठभूमि को कम करने के लिए। यह कदम जरूरी है।
  3. अंतिम स्पिन से सतह पर तैरनेवाला निकालें और झंडा धोने माला में झंडा पेप्टाइड के 200 एनजी / μl युक्त बफर के 30 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 800 rpm पर भंवर।
  4. नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर निलंबन स्पिन। के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर तैरनेवाला और दुकान हार्वेस्ट "ध्वज आईपी क्षालन।"
    नोट: क्षालन नमूने चांदी दाग और / या पश्चिमी धब्बा मानक प्रोटोकॉल 16 का उपयोग करके इस बात की पुष्टि की जा सकती है, और आगे प्रोटीन assays के लिए तैयार हैं। (1) स्ट्रेप एपी इनपुट, (2) स्ट्रेप एपी एफटी, (3) स्ट्रेप एपी Eluti: जब एक पश्चिमी धब्बा की स्थापना, निम्नलिखित नमूने के सभी चलानेपर, (4) ध्वज आईपी एफटी, और (5) ध्वज आईपी क्षालन। लोड खंड एक प्रयोग के लिए निर्धारित किया जा करना होगा। सभी एकत्र नमूनों और मोती अल्पकालिक भंडारण के लिए और लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। नल के नमूने मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, उनके घटकों की पहचान सत्यापित करने के उपन्यास बाद translational संशोधनों (PTMs) की पहचान करने, और / या शुद्ध जटिल 2, 17 के साथ किसी भी उपन्यास प्रोटीन बातचीत खोजने के लिए। इस उद्देश्य के लिए, एक coomassie जेल या चांदी दाग ​​चलाने के बाद, बैंड जेल एक साफ छुरी का उपयोग करने से excised जा सकता है। कई उत्कृष्ट समीक्षाएँ है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों पर चर्चा पहले से 18 प्रकाशित किए गए थे, 19।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस अनुच्छेद में, हम अच्छी तरह से विशेषता CycT1-CDK9 परिसर (पी-TEFb काइनेज के रूप में जाना जाता है) करने के लिए नल पद्धति के प्रयोग को प्रदर्शित करता है।

और CDK9 झंडा (CDK9: एफ), या CDK9-स्ट्रेप (CDK9: एस) और Cyclin T1-झंडा (CycT1: एफ): एन्कोडिंग Cyclin T1-स्ट्रेप (एस CycT1) प्लास्मिड (तालिका 1), HEK293T कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट थे । एफ या CycT1: एफ plasmids (आंकड़े 3 ए और बी, क्रमशः) नकारात्मक नियंत्रण एक खाली वेक्टर और CDK9 साथ transfections शामिल थे। कोशिकाओं एकत्र किए गए थे इससे पहले कि प्रोटीन 48 घंटे के लिए व्यक्त किया गया। कोशिकाओं के कई प्लेटों प्रोटीन के उत्पादन और वसूली बढ़ाने के लिए प्रयोग के प्रति इस्तेमाल किया गया (नमूना प्रति पांच प्लेटों चित्रा 3 में प्रस्तुत आंकड़ों के लिए इस्तेमाल किया गया)। बाद कोशिकाओं व्यक्तिगत microcentrifuge ट्यूब में lysed रहे थे, एक ही नमूने के सेल lysates एक microcentrif में संयुक्त थेuge ट्यूब स्ट्रेप मोती जोड़ने से पहले। मोतियों की एक हिस्से के साथ प्रोटीन के नमूने का मेल अंतिम प्रोटीन एकाग्रता, जो प्रोटीन है कि व्यक्त करने के लिए मुश्किल हो जाता है से प्रोटीन वसूली में सुधार कर सकते हैं बढ़ जाती है। प्रारंभिक क्षालन के बाद, एक दूसरे क्षालन आदेश झंडा आईपी के लिए कुल प्रोटीन निवेश बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। यह भविष्य के निवारण (तालिका 2) के लिए मोती जोड़ने अगर जरूरत से पहले प्रत्येक शुद्धि कदम के लिए इनपुट को बचाने के लिए महत्वपूर्ण है।

एस और CDK9: एफ, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण चित्रा 3 ए में डेटा CycT1 के लिए नल विधि के परिणामों से पता चलता है। स्ट्रेप मोतियों से है, लेकिन नकारात्मक नियंत्रण एपी कमी CycT1 में नहीं: CDK9: CycT1 के साथ एफ सह eluted एस, कि CDK9 का संकेत: एफ और CycT1: एस एक प्रोटीन, प्रोटीन जटिल के रूप में। उम्मीद के मुताबिक, दोनों प्रोटीन झंडा क्षालन है, जो आगे जटिल गठन की पुष्टि की है में पाया गया। चित्रा 3 बी resu चलता(: एस और CycT1: CDK9 एफ) पारस्परिक नल विधि है, जहां दो प्रोटीन का मिलान टैग बदली थी की एलटीएस, और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण।

आंकड़े -3 सी और 3 डी नल और पारस्परिक नल चांदी धुंधला द्वारा विश्लेषण का परिणाम है, क्रमशः दिखा। चित्रा -3 सी 2 लेन से पता चला कि CDK9: स्ट्रेप मोतियों की बंद है, लेकिन नियंत्रण एपी (1 लेन) से नहीं है, इस प्रकार यह दर्शाता है कि CDK9: एफ CycT1 के साथ सह-eluted एफ और CycT1: एस एक प्रोटीन, प्रोटीन जटिल गठन किया था। बाद में झंडा क्षालन में, जैसा कि 4 लेन में दिखाया गया है, CycT1: एस CDK9 के साथ सह-eluted: एफ झंडा मोतियों की बंद। इसी तरह, चित्रा 3 डी से पता चला कि CycT1: स्ट्रेप मोतियों की बंद है, लेकिन नहीं नियंत्रण एपी से, और उस प्रोटीन, प्रोटीन जटिल कुशलता से दूसरे झंडा आईपी कदम के बाद बरामद किया गया था: एफ CDK9 के साथ सह-eluted। दोनों पश्चिमी blots और चांदी दाग ​​की पुष्टि की है कि नल प्रोटोकॉल purificatio के लिए कुशलता से काम किया n, अलगाव, और ब्याज की प्रोटीन जटिल की विशेषता।

आकृति 1
चित्रा 1: नल शोधन रणनीति का अवलोकन। एक सरल योजना नल के कदम का वर्णन है। या तो स्ट्रेप या ध्वज मिलान टैग के साथ ब्याज की प्रोटीन एन्कोडिंग plasmids सह ट्रांसफ़ेक्ट स्तनधारी कोशिकाओं में हैं। बाद 48 घंटे प्रेरण, कोशिकाओं एकत्र की है और lysed रहे हैं। घुलनशील सेल अन्य प्रोटीन के साथ-साथ ब्याज की प्रोटीन युक्त lysate स्ट्रेप एपी के लिए स्ट्रेप मोती पर लोड कर रहे हैं। प्रोटीन है कि या तो स्ट्रेप टैग होते हैं या स्ट्रेप टैग प्रोटीन मोतियों से जुड़ी करने के लिए बाध्य कर रहे हैं तो eluted हैं। झंडा मोती तो स्ट्रेप क्षालन में जोड़ा गया था। प्रोटीन है कि या तो झंडा टैग होते हैं या झंडा टैग प्रोटीन मोतियों से जुड़ी करने के लिए बाध्य कर रहे हैं तो eluted हैं। Elutions संकेत दिया तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है।टीटीपी: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: नल रणनीति की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। नल की एक विस्तृत प्रोटोकॉल। जानकारी के लिए पाठ देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन

चित्रा 3: चरण-दर-कदम नल शुद्धि के विश्लेषण का उदाहरण है। (ए) नल के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (CycT1: एस और CDK9: एफ)। (बी) के पारस्परिक नल के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (CDK9: एस और CycT1: एफ)। froएम 1 पूरे सेल lysate, 5 μl (0.2%) की मिलीलीटर के रूप में लोड किया गया था "स्ट्रेप एपी इनपुट।" शेष पूरे सेल lysate के 975 μl स्ट्रेप एपी के लिए स्ट्रेप मोती और "स्ट्रेप एपी क्षालन" के 100 μl एकत्र किया गया था करने के लिए जोड़ा गया है। इस से, 5 μl (2%) भरी हुई थी। "स्ट्रेप एपी क्षालन" के 80 μl झंडा आईपी के लिए झंडा माला और "ध्वज आईपी क्षालन" के 30 μl एकत्र किया गया था करने के लिए जोड़ा गया है। "ध्वज आईपी क्षालन" के 30 μl से, 7 μl (23.3%) भरी हुई थी। (सी) के रजत नल दाग विश्लेषण (CycT1: एस और CDK9: एफ)। (: एस और CycT1: CDK9 एफ) पारस्परिक नल (डी) चांदी दाग विश्लेषण। "स्ट्रेप एपी क्षालन" और "ध्वज आईपी क्षालन" के 7 μl (23.3%) के 5 μl (2%) भरी हुई थी। तारों के सह-eluted दोष संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रोटीन अवशेष वेक्टर टैग क्लोनिंग साइटों संदर्भ
CycT1 1-708 pcDNA / 4to स्ट्रेप HindIII - EcoRI McNamara एट अल। 2013 10
CycT1 1-708 pcDNA / 4to झंडा HindIII - EcoRI यह लेख
CDK9 1-372 pcDNA / 4to स्ट्रेप HindIII - XhoI यह लेख
CDK9 1-372 pcDNA / 4to फ्लोरिडाएजी HindIII - XhoI McNamara एट अल।, 2013 10
GFP 1-238 pcDNA / 4to स्ट्रेप झंडा BamHI - XhoI यह लेख

तालिका 1: इस अध्ययन में इस्तेमाल प्लास्मिड। CycT1 और CDK9 pcDNA / 4to-स्ट्रेप और pcDNA / 4to झंडा प्लाज्मिड वैक्टर में ligated थे। इन निर्माणों DH5α सक्षम कोशिकाओं में तब्दील हो और लेग एम्पीसिलीन प्लेटों पर चढ़ाया गया। कालोनियों में चयनित हो गए हैं, और जांच की गई। सफलतापूर्वक क्लोन ligated सेंगर अनुक्रमण और प्रतिबंध पाचन और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के संयोजन द्वारा सत्यापित किया गया। पूर्ण लंबाई के बजाय (1 - 726) क्योंकि पिछले 18 अवशेषों एक कीट अनुक्रम होते हैं (एक पेप्टाइड अनुक्रम में अमीर - CycT1 के लिए हम एक छोटा संस्करण (708 1) का इस्तेमाल कियाप्रोलाइन, glutamic एसिड, सेरीन, और threonine) है, जो प्रोटीन गिरावट 20 के लिए एक संकेत पेप्टाइड के रूप में कार्य करता है। CDK9 पूर्ण लंबाई था। मिलकर स्ट्रेप टैग के अनुक्रम इस प्रकार है: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK। मिलकर झंडा टैग के अनुक्रम इस प्रकार है: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK।

तालिका 2: समस्या निवारण टेबल। समस्या निवारण के साथ शुरू करने से पहले, दोहरी जांच सुनिश्चित करें कि प्रत्येक आवश्यक कदम का पालन किया गया है बनाने के लिए। इस प्रोटोकॉल में कुछ कदम की उम्मीद परिणाम प्राप्त करने के लिए दूसरों की तुलना में अधिक अनुकूलन की आवश्यकता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल यहाँ अभिव्यक्ति और कोशिकाओं से प्रोटीन परिसरों के अलगाव के लिए वर्णित ऐसे आणविक विधानसभाओं के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन करने के लिए ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी उपन्यास interactors और बाद translational संशोधनों कि उनके कार्य विनियमित सकता है की पहचान के लिए उपयोग किया जा सकता है। आत्मीयता के टैग के उपयोग क्या इस प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है करने के लिए ही सीमित नहीं है; लेकिन हमारे अनुभव बताता है कि स्ट्रेप पहले एपी कदम के रूप में उपयोग करते हुए काफी अंतिम प्रोटीन, प्रोटीन जटिल की पैदावार को बढ़ाता है। दोनों के लिए और स्ट्रेप मोतियों से बाध्यकारी और क्षालन कदम अन्य मिलान टैग (जैसे, झंडा) के साथ तुलना में बेहद कुशल हैं। इसके अलावा, सिद्धांत रूप में, नल ऐसे बफर की स्थिति, (दोनों क्षणिक और स्थिर व्यक्त की व्यवस्था के लिए) प्रयोग के प्रति प्लेटों की संख्या, आदि इसके अलावा के रूप में कुछ मामूली अनुकूलन के साथ अन्य प्रोटीन या डोमेन के लिए लागू किया जा सकता है, नल विधि को भी हो सकता है एप्लाइड टीअन्य सेल लाइनों ओ यदि विशिष्ट प्रोटीन परिसरों उनके कार्य या अद्वितीय कारकों के साथ उनकी बातचीत के लिए एक विशेष प्रणाली की आवश्यकता है। समस्या निवारण की सुविधा के लिए, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि इनपुट और एफटी नमूने दोनों को बचाया जा (तालिका 2)। उम्मीद प्रोटीन बैंड क्षालन में कल्पना नहीं की जा सकती है, एफटी नमूने प्रयोग का निवारण और निर्धारित किया जाए या नहीं नमूने के लिए बाध्य किया था और / या मोती के बंद eluted के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक सफल नल सख्ती से प्रोटीन अभिव्यक्ति और वसूली के उच्च स्तर पर निर्भर है। इस प्रकार, शोधकर्ताओं ने एक मामला-दर-मामला आधार पर सामग्री शुरू की राशि का अनुकूलन करने के लिए होगा। क्षणिक अभिकर्मक प्रोटीन घटक व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो अभिकर्मक दक्षता नल के दूसरे चरण के साथ आगे बढ़ने से पहले कम से कम 70% होना चाहिए। पारस्परिक नल विधि (जिसमें epitopes दो फँसाना के बीच बदली हैं) आम तौर पर जो प्रयोगात्मक रणनीति निर्धारित करने में मदद करता हैसबसे अच्छा पवित्रता और उपज प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। फिर, यह एक मामला-दर-मामला आधार पर जांच की जा होगा। महत्वपूर्ण बात है, पारस्परिक नल प्रदर्शन भी पुष्टि की है कि पल्स पोलियो टीकाकरण आत्मीयता के इस्तेमाल टैग से स्वतंत्र है।

नल विधि के कुछ पहलुओं को प्रस्तुत किया इस के साथ साथ सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, FLAG- और स्ट्रेप टैग प्रोटीन overexpressing ectopically व्यक्त प्रोटीन खुद या उनके interactors के लिए कलाकृतियों उत्पन्न कर सकता है। विभिन्न मिलान टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर, प्रोटीन रचना, और / या subcellular स्थानीयकरण प्रभावित कर सकता है। सेल लाइन और अभिकर्मक दक्षता सीमा के अलावा, परिसरों के आकार का एक मुद्दा हो सकता है शुद्ध किया जा सके। इस नल विधि बहु सबयूनिट प्रोटीन परिसरों के लिए अच्छी तरह से काम करता है। हमारे अनुभव से, चार घटकों चांदी दाग ​​से पता लगाया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया। हालांकि, जब दो टैग घटकों का उपयोग कर, अन्य interactors नहीं सह शुद्ध समान stoichiometric स्तरों पर हो सकता है। इसलिए,इस विशेष लक्ष्य के लिए, कि जटिल घटकों की अभिव्यक्ति के निचले स्तर पर लाती सेल लाइनों के उपयोग की सलाह दी है। एक और सीमा पल्स पोलियो टीकाकरण की ताकत होगी। बातचीत काफी स्थिर नहीं कर रहे हैं, कुछ घटकों शुद्धि कदम (विशेष रूप से अंतिम झंडा आईपी कदम में) के दौरान खो दिया जा सकता है।

नल विधि पहले से वर्णित किया गया था और कई अलग अलग मिलान टैग, परीक्षण किया गया मान्य है, और 6 की तुलना में। हालांकि, इस लेख में प्रस्तुत नल विधि उपन्यास है और PPIs, जटिल विधानसभा का अध्ययन, और प्रोटीन नेटवर्क की संरचना और समारोह अनुमान करने के लिए एक आसान, कुशल, मजबूत, और वैकल्पिक रणनीति प्रदान करता है। पिछले नल के तरीकों के साथ तुलना में, इस स्ट्रेप झंडा नल रणनीति जटिल संरचना, गतिविधि, या समारोह के पूर्व ज्ञान के बिना आगे लक्षण वर्णन के लिए परिसरों का तेजी से शुद्धि के लिए अनुमति देता है; और प्रोटीन क्षालन के लिए प्रोटीज दरार (जैसे, TEV) की आवश्यकता के बिना (कआईसीएच काफी प्रोटीन उपज में कमी कर सकते हैं)। वृद्धि की प्रोटीन जटिल वसूली की वजह से, स्ट्रेप झंडा नल विधि भी प्रोटीन है कि मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण 10, 15 के माध्यम से कोशिकाओं में ब्याज की प्रोटीन जटिल के साथ संबद्ध के मजबूत पहचान के लिए अनुमति देता है। बाद में, अन्य तरीकों, confocal माइक्रोस्कोपी, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, और सह आईपी assays तरह, यह भी PPIs मान्य करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। अंत में, हम प्रस्ताव है कि नल प्रोटोकॉल का एक वैकल्पिक संस्करण को शुद्ध और असतत प्रोटीन आरएनए परिसरों, जो काफी आरएनए जीव विज्ञान के क्षेत्र में शोधकर्ताओं में मदद मिलेगी की विधानसभा का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

सारांश में, हम शुद्ध और स्तनधारी सेल लाइनों में PPIs को चिह्नित करने के लिए एक तरीका मौजूद है। हम प्रस्ताव इस विधि भविष्य लक्षण और कई उपन्यास प्रोटीन परिसरों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए आधार तैयार करती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) GE Healthcare Life Sciences/Hyclone SH3002.2FS
Fetal bovine serum GE Healthcare Life Sciences/Hyclone SH30071
Penicillin/Streptomycin MP Biomedicals MP091670049
PolyJet SignaGen Laboratories SL100688
Protease inhibitor cocktail  Roche  11836153001
STREP-Tactin Superflow IBA Lifesciences 2-1208-010
STREP-tag elution buffer IBA Lifesciences 2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich F2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve Corning  430167
Protein Lo-Bind Eppendorf Eppendorf 022431081
Digital Vortex Mixer Fisher Scientific  02-215-370
48 hole micro tube foam rack Fisher Scientific 02-215-386
Labquake shaker rotisserie  Thermo  415110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
  2. Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
  3. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  4. Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
  5. Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
  6. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  7. Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
  8. Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
  9. Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
  10. McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
  11. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
  12. D'Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
  13. McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
  14. Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
  15. McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  17. Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
  18. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
  19. Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
  20. Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).

Tags

जैव रसायन अंक 119 आत्मीयता शुद्धि प्रोटीन प्रोटीन बातचीत प्रोटीन परिसरों पी TEFb प्रतिलेखन
कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, Z., Fung, V., D'Orso, I. Tandem… More

Ma, Z., Fung, V., D'Orso, I. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (119), e55236, doi:10.3791/55236 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter