Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

Published: January 26, 2017 doi: 10.3791/55236
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Microbiology, The University of Texas Southwestern Medical Center
* These authors contributed equally

Abstract

تنقية نشط البروتين البروتين والمجمعات حمض البروتين النووي هو أمر حاسم لتوصيف الأنشطة الإنزيمية ودي نوفو تحديد الوحدات الفرعية الجديدة والتعديلات بعد متعدية. أنظمة بكتيرية تسمح للتعبير وتنقيتها من مجموعة واسعة من البروتينية واحدة والمجمعات البروتين. ومع ذلك، فإن هذا النظام لا يمكن تنقية مفارز البروتين التي تحتوي على التعديلات بعد متعدية (على سبيل المثال، الفسفرة وأستلة)، وتحديد مفارز التنظيمية الجديدة التي تكون موجودة فقط / أعرب في النظام حقيقية النواة. هنا، ونحن نقدم وصفا مفصلا للرواية، وقوية، وطريقة فعالة لتنقية جنبا إلى جنب تقارب (وات) باستخدام STREP- والبروتينات الموسومة FLAG الذي يسهل عملية تنقية البروتين المجمعات مع عابر أو مستقر أعرب البروتينات الموسومة حاتمة من الخلايا حقيقية النواة. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على تميز بروتعين الوظائف المعقدة، لاكتشاف التعديلات بعد متعدية على مفارز معقدة، وتحديد مكونات معقدة تنظيمية جديدة من خلال قياس الطيف الكتلي. والجدير بالذكر، يمكن تطبيق هذه الطريقة التونسية لدراسة المجمعات البروتين يتكون من مكونات حقيقية النواة أو المسببة للأمراض (الفيروسية والبكتيرية)، وبالتالي مما أسفر عن مجموعة واسعة من الفرص التجريبية المصب. نقترح أن الباحثين العاملين مع المجمعات البروتين يمكن الاستفادة من هذا النهج في العديد من الطرق المختلفة.

Introduction

تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) هي الحاسمة لتنظيم دقيق من العمليات البيولوجية 1، وإجراء المزيد من الدراسات حول هذه مثبطات مضخة البروتون يمكن أن تبلغ عن وظيفتها 2. وقد وضعت عدة نهج لدراسة وتوصيف مثبطات مضخة البروتون وكذلك لدي نوفو تحديد مكونات البروتين التنظيمية الجديدة. في عام 1989، ذكرت ستانلي فيلدز وزملاؤه الخميرة اثنين الهجين (Y2H) فحص 3. يسمح هذا النهج لتحديد متحيز وشامل للinteractors (يفترس) لبروتين محددة من الفائدة (الطعم) في خميرة الخباز. وبالإضافة إلى فائدة ملحوظة من أجل اكتشاف مثبطات مضخة البروتون، وفحص Y2H يمكن استخدامها لوصف أزواج البروتين في خلايا الخميرة، وتحديد مجالات التفاعل الحد الأدنى، وتحديد الطفرات التي إلغاء مثل هذه التفاعلات. عن طريق تعديل فحص Y2H، مثبطات مضخة البروتون يمكن أيضا أن تدرس في خلايا الثديياتالطبقة = "XREF"> 4. ويمكن أيضا أن الاختلافات في فحص Y2H (على سبيل المثال، نظام الخميرة ثلاثة الهجين) يتم تطبيقها على دراسة البروتين RNA والتفاعلات يجند العضوية-بروتين صغير في الخلايا.

أداة أخرى تستخدم عادة لدراسة مثبطات مضخة البروتون في نظام مثلي هي شارك في مناعي (شارك في IP) فحص 5. باستخدام أجسام مضادة لبروتين immunoprecipitate من الفائدة، وفحص المشارك IP يسمح للباحثين لمراقبة مثبطات مضخة البروتون في الخلايا للظروف البيئية المختلفة والحالات التجريبية. استخدام البروتينات الموسومة حاتمة (على سبيل المثال، FLAG، Myc على، بكتيريا، وHA، من بين أمور أخرى) في تنقية تقارب (ا ف ب) طرق سهلت عزل البروتينات من خليط من البروتين المعقدة لعدة فحوصات المصب، بما في ذلك وصمة عار الغربية، وصمة عار الفضة ، وتحليل الأنزيمي. ومع ذلك، فإن أيا من هذه الطرق السابقة يمكن عزل كميات كبيرة من البروتين المجمعات لمزيد من التوصيف بما في ذلك في المختبر لssays، اكتشاف مفارز التنظيمية التي الطيف الكتلي، وتحديد التعديلات بعد متعدية. ويطلق نسخة محسنة من طريقة AP جنبا إلى جنب AP (وات)، وهي تقنية تنقية لدراسة مثبطات مضخة البروتون عن طريق إنشاء بروتين الانصهار مع اثنين من الحواتم التي يتم تنقيته من خلال اثنين من نقاط وصول لاحقة 6 و 7. في هذه المقالة، نقدم الاختلاف في طريقة التونسية للمجمعات البروتين تنقية الذي يتم وضع علامة على وحدتين فرعيتين مع الحواتم مختلفة ثم تنقيته من خلال اثنين من نقاط وصول متسلسلة (بكتيريا AP تليها FLAG IP). علينا أولا تقديم لمحة أضيق الحدود من TAP (الشكل 1)، ثم وصفا مفصلا لجميع الخطوات التجريبية (الشكل 2)، بحيث يمكن للباحثين تطبيقها على بروتين معقد اهتمامهم.

للتدليل على تطبيق هذه الطريقة التونسية، اخترنا جيدا اتسم السيكلين-معلمين المعقدة (ويشار إلى PTكيناز EFB)، التي تتألف من السيكلين T1 فرعية التنظيمية (CycT1) وكيناز (CDK9)، ويشارك في تنظيم النسخ التي كتبها RNA بوليميريز الثاني (بول الثاني) 8 و 9 و 10. ف TEFb phosphorylates المجال سي محطة للبول الثاني وما يرتبط بها من عوامل لها استطالة السلبية، والذي يخفف التوقف النسخي في المروج، وبالتالي يسهل النسخ استطالة 11 و 12 و 13. مع هذا التفاعل المعروف في الاعتبار، بكتيريا الموسومة CycT1 وكانت CDK9 الموسومة FLAG خلال أعرب في الخلايا HEK293T. تم إجراء التجربة التونسية متبادلة مع CDK9 الموسومة بكتيريا والموسومة FLAG CycT1 لمزيد من التحقق من أن التفاعل البروتين مستقلة عن الحواتم المستخدمة. وقد تم جمع الخلايا و lysed 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. تمت تنقية المحللة للذوبان التي كتبها TAP (بكتيريا AP تليها FLAGIP). وقد تم تحليل المدخلات وتنقية البروتينات لطخة الغربية وصمة عار الفضة (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلايا التصفيحات

  1. قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، لوحة 3.5 × 10 6 خلايا HEK293T في 10 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ (ت / ت) البنسلين / الستربتوميسين (/ الأسهم مل 10،000 U) في صحن 100 ملم. لوحة 3-5 100 ملم أطباق في التجربة / حالة لضمان الانتعاش ما يكفي من البروتين.
    ملاحظة: عدد من لوحات لابد من تحديدها لكل تجربة / حالة، والتي سوف تعتمد على مستويات التعبير والذوبان في مجمع البروتين من الفائدة. بدلا من ذلك، إذا كانت هناك حاجة لتنقية نطاق أوسع، خطوط الخلايا يمكن تكييفها لتنمو في تعليق في قوارير الدوار 2، ولكن هذه الطريقة لا تعمل لتعداء عابر.

2. Transfecting خلايا أو التسبب خطوط الخلية مستقرة

  1. في اليوم التالي، والتحقق من الخلايا تحت المجهر. يجب أن تكون خلايا 70-80٪ متموجة قبل صناعة تجeding.
  2. Transfect الخلايا مع خليط مجموع 7 ميكروغرام من البلازميد و 21 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن في صحن 100 ملم. خلايا Transfect مع ناقلات معربا عن GFP (الجدول 1) وجهاز تحكم عن كفاءة ترنسفكأيشن.
    ملاحظة: إذا باستخدام HEK293-T-REX أو خط الخلية مستقرة مشابه الحث على التعبير من اثنين أو أكثر تعقيدا مفارز ردا على الدوكسيسيكلين 14، 15، ومحفز يجب أن تضاف إلى الخلايا والمحتضنة لمدة 48 ساعة. وبالمثل، خط خلية مستقر الحث على التعبير عن GFP على إضافة محفز ستكون هناك حاجة أيضا لأغراض التحقق من الصحة. انتقل إلى الخطوة 2.7.
  3. إعداد خليط ترنسفكأيشن في صحن 100 ملم. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، مزيج 500 ميكرولتر من DMEM unsupplemented مع 7 ميكروغرام من إجمالي DNA البلازميد (المقابلة لاثنين أو أكثر من البلازميدات). في أنبوب microcentrifuge منفصل، مزيج 500 ميكرولتر من unsupplemented واي DMEMال 21 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن. كرر لكل رد فعل ترنسفكأيشن.
  4. ماصة الحل ترنسفكأيشن الكاشف في حل DNA البلازميد (لا تخلط بين الحلول بالترتيب العكسي). مزيج من قبل pipetting 4 مرات على الأقل.
  5. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة ل10-15 دقيقة، ولكن لم يعد من 15 دقيقة.
  6. إمالة لوحة لإنشاء خزان سائل الإعلام وبعناية ماصة الخليط ترنسفكأيشن قطرة من الحكمة على الجانب الداخلي من لوحة من دون إزعاج الخلايا. إعادة الإناء لموقفها ثابت الأصلي ودوامة بلطف لتوزيع الخليط.
  7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة خلية ترطيب مع 5٪ CO 2 (ويشار إلى هذه الحالة فيما يلي باسم "نسيج الثقافة الحاضنة"). استبدال وسائل الإعلام 5 ساعة بعد ترنسفكأيشن (اختياري).

3. ترنسفكأيشن فحص أو الحث الكفاءة

  1. في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، تصور الخلايا تحت انفلونزاالمجهر orescent للتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن (أو تحريض السيطرة HEK293T-REX خط الخلية مستقرة التعبير عن GFP). احتضان لمدة 24 ساعة أخرى.

4. بكتيريا الانجذاب تنقية (بكتيريا ا ف ب)

  1. جمع الخلايا
    1. في 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائل الإعلام وإضافة 8 مل من المياه المالحة الفوسفات-1X الباردة (PBS). ماصة صعودا وهبوطا لفصل الخلايا من لوحة.
    2. جمع ونقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وتدور الخلايا في أسفل 800 x ج لمدة 4 دقائق على 4 درجات مئوية.
    3. إزالة طاف برنامج تلفزيوني. كرر تدور أسفل (800 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية) للقضاء على أي برنامج تلفزيوني المتبقية. تخزين بيليه خلية في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل أو اتبع الإجراء أدناه لمواصلة تنقية البروتين.
  2. الناشر الخلايا
    1. Resuspend والكريات الخلايا باستخدام 5 × حجم الخلية بيليه (~ 250 ميكرولتر لكل لوحة) من السلبي الاحتياطي تحلل(PLB: 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي MgCl 2، 1 ملم DTT، مثبط البروتياز كوكتيل لوحي، 5٪ ت / الجلسرين الخامس، و 1.0٪ NP-40) ونقل تعليق خلية ل 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
    2. لفترة وجيزة دوامة تعليق وnutate لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. تدور باستمرار تعليق خلية في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    4. نقل لست] القابلة للذوبان في أنبوب جديد microcentrifuge ل1.5 مل وتجاهل الكريات الخلية. وفر 10٪ من الحجم النهائي للالمحللة للذوبان باسم "بكتيريا ا ف ب الإدخال". تخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. توازنه حبات بكتيريا
    ملاحظة: الخرز استخدام بكتيريا للخطوة AP الأولى! سحبت مجمعات أسفل مع حبات بكتيريا استرداد أكبر بكثير من البروتين من تلك التي سحبت إلى أسفل مع حبات FLAG.
    1. إخراج (ن × 40 ميكرولتر) + ن ميكرولتر من 50٪ بكتيريا حبة الطين (ن = عدد العينات) وتدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدم على نطاق منصائح outhed إلى الخرز ماصة.
    2. إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر من PLB إلى الخرز. Nutate الخليط حبات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      1. تكرار لما مجموعه 3 يغسل. resuspend والخرز في PLB إلى الحجم النهائي من ن × 40 ميكرولتر.
    3. إضافة 40 ميكرولتر من 50٪ بكتيريا حبة الطين لكل عينة الخلايا المحللة وnutate لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
  4. بكتيريا AP
    1. تدور باستمرار الحل في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 ج.
    2. إزالة طاف ومخزن باسم "بكتيريا AP التدفق من خلال (FT)" في 4 درجات مئوية.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من بكتيريا AP الاحتياطي اغسل الأول (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 250 مم كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي MgCl 2، 1 ملم DTT، 5٪ الجلسرين و 0.2٪ NP-40) إلى الخرز. Nutate الخليط حبات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
      1. تكرار لما مجموعه 4 يغسل.
    4. إضافة 500 ميكرولتر غسل العازلة الثاني (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 1 ملي EDTA) وتتوازن حبات من قلب الأنابيب. تدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
    5. أزل البروتين في المصالح مع 50 ميكرولتر من بكتيريا شطف العازلة (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 2.5 ملي Desthiobiotin). دوامة في 800 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    6. تدور باستمرار حبات في 1500 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع طاف. هذا جزء يتوافق مع عينة "بكتيريا AP شطف".
    7. حفظ جزء حبات عند 4 درجة مئوية لمدة شطف الثاني، والتي يمكن أن تسفر عن ما يصل الى نصف كمية البروتين التي تم الحصول عليها مع شطف الأول. قسامة 10٪ من بكتيريا AP شطف لتلطيخ الفضة و / أو النشاف الغربي16.
  5. توازنه حبات FLAG
    1. إخراج (NX 16 ميكرولتر) + ن ميكرولتر من FLAG الخرز حل (ن = عدد العينات) وتدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدام نصائح واسعة الفم إلى الخرز ماصة.
    2. إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة FLAG (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 0.1٪ NP-40) إلى الخرز. تدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. تكرار لما مجموعه 3 يغسل.
    3. resuspend والخرز في غسل العازلة FLAG إلى الحجم النهائي من NX 16 ميكرولتر.
    4. إضافة 16 ميكرولتر من الطين FLAG حبة لشطف بكتيريا AP المتبقية وبين عشية وضحاها nutate في 4 درجات مئوية.

5. FLAG IP

  1. تدور باستمرار تعليق الخرز FLAG في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. حفظ طاف ومخزن باسم "FLAG IP تدفق من خلال" (FT) في 4 درجات مئوية.
  2. إضافة 50081؛ ل من غسل العازلة FLAG إلى الحل. Nutate لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. تكرار لما مجموعه 4 يغسل وإزالة طاف بعد كل غسل.
    ملاحظة: قبل غسل الرابع، ونقل حل الخرز البروتين لأنبوب جديد microcentrifuge ل1.5 مل للحد من الخلفية. هذه الخطوة ضرورية.
  3. إزالة طاف من زيادة ونقصان النهائي وإضافة 30 ميكرولتر من غسل العازلة FLAG تحتوي على 200 نانوغرام / ميكرولتر من الببتيد FLAG في الخرز. دوامة في 800 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
  4. تدور باستمرار تعليق في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. حصاد طاف وتخزينها في 4 درجات مئوية باسم "FLAG IP شطف."
    ملاحظة: يمكن التأكد من العينات شطف بواسطة وصمة عار الفضة و / أو لطخة غربية باستخدام البروتوكولات القياسية 16، ونحن على استعداد لمزيد من المقايسات البروتين. عند إعداد وصمة عار الغربية، تشغيل جميع العينات التالية: (1) بكتيريا ا ف ب الإدخال، (2) بكتيريا ا ف ب FT، (3) بكتيريا AP Elutiعلى، (4) FLAG IP FT، و (5) FLAG IP شطف. فإن حجم تحميل يجب أن يحدد لكل تجربة. جميع العينات التي تم جمعها والخرز يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير وفي -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. ويمكن تحليل عينات التونسية التي كتبها الطيف الكتلي للتحقق من هوية من مكوناتها، وتحديد رواية التعديلات بعد متعدية (PTMs)، و / أو لاكتشاف أي تفاعل البروتين الرواية مع مجمع النقي 2 و 17. لهذا الغرض، بعد تشغيل هلام coomassie أو الفضة وصمة عار، والعصابات يمكن رفعه من الجل باستخدام مشرط نظيفة. العديد من الاستعراضات الممتازة التي مناقشة أساليب مطياف الكتلة نشرت سابقا 18 و 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه المقالة، ونحن لشرح تطبيق هذه الطريقة التونسية للتميز جيدا CycT1-CDK9 معقدة (المعروف أيضا باسم P-TEFb كيناز).

البلازميدات ترميز السيكلين T1-بكتيريا (CycT1: S) وCDK9-FLAG (CDK9: F)، أو CDK9-بكتيريا (CDK9: S) والسيكلين T1-FLAG (CycT1: F) (الجدول 1)، و transfected في الخلايا HEK293T . وتضمنت الضوابط السلبية تعداء مع ناقلات فارغة وCDK9: F أو CycT1: البلازميدات F (أرقام 3A وباء، على التوالي). وأعرب عن البروتينات لمدة 48 ساعة قبل جمع الخلايا. تم استخدام لوحات متعددة من الخلايا في التجربة (استخدمت خمس لوحات لكل عينة للبيانات الواردة في الشكل 3) لزيادة إنتاج بروتين والانتعاش. بعد هي lysed الخلايا في أنابيب microcentrifuge الفردية، تم الجمع بين الخلية لست] من نفس العينة إلى microcentrif واحدأنبوب أويغه قبل إضافة حبات بكتيريا. الجمع بين عينات البروتين مع جزء واحد من الخرز يزيد من تركيز البروتين النهائي، التي يمكن أن تحسن الانتعاش بروتين من البروتينات التي يصعب التعبير. بعد شطف الأولي، وشطف الثاني يمكن القيام به من أجل زيادة مجموع المدخلات البروتين لIP FLAG. من المهم أن توفر المدخلات لكل خطوة تنقية قبل إضافة حبات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في المستقبل (الجدول 2)، إذا لزم الأمر.

تظهر البيانات في الشكل 3A نتائج الطريقة التونسية لCycT1: S وCDK9: F وتحليلها بواسطة لطخة غربية. CDK9: F المشارك مزال مع CycT1: S من الخرز بكتيريا، ولكن ليس في وكالة اسوشييتد برس تحكم سلبي تفتقر CycT1: S، مشيرا إلى أن CDK9: F وCycT1: S تشكيل مجمع البروتين البروتين. متوقعا، تم الكشف عن كل من البروتينات في شطف FLAG، التي أكدت أيضا على تشكيل تعقيدا. ويبين الشكل 3B للدورة الفتشوبLTS من طريقة المتبادل TAP، حيث تبادلت العلامات حاتمة من اثنين من البروتينات (CDK9: S وCycT1: F)، وتحليلها بواسطة لطخة غربية.

أرقام 3C و 3D تظهر نتائج برنامج المشورة التقنية والمساعدة التقنية المتبادلة تحليلها من قبل تلطيخ الفضة، على التوالي. أظهر الرقم 3C 2 لين أن CDK9: F-مزال التعاون مع CycT1: S الخروج من الخرز بكتيريا، ولكن ليس من سيطرة ا ف ب (حارة 1)، مما يدل على أن CDK9: F وCycT1: S تشكيل مجمع البروتين البروتين. في شطف FLAG لاحق، كما هو مبين في حارة 4، CycT1: S المشارك مزال مع CDK9: F الخروج من الخرز FLAG. وبالمثل، أظهر الشكل 3D التي CycT1:-مزال شارك F مع CDK9: S الخروج من الخرز بكتيريا، ولكن ليس من AP السيطرة، وأن مجمع البروتين البروتين عثر بفعالية بعد خطوة IP FLAG الثانية. كلا أكدت البقع الغربية والبقع الفضية أن البروتوكول وات تعمل بكفاءة عالية لpurificatio ن، والعزلة، وتوصيف مجمع البروتين من الفائدة.

شكل 1
الشكل 1: نظرة عامة على استراتيجية TAP تنقية. مخطط بسيط واصفا خطوات التونسية. البلازميدات ترميز البروتين في المصالح مع إما بكتيريا أو FLAG العلامة حاتمة هي شارك في transfected في خلايا الثدييات. بعد 48 ساعة الاستقراء، ويتم جمع الخلايا و lysed. يتم تحميل المحللة الخلية القابلة للذوبان التي تحتوي على البروتين من الفائدة جنبا إلى جنب مع غيرها من البروتينات على حبات بكتيريا للبكتيريا AP. ثم يتم مزال البروتينات التي تحتوي على أي علامة بكتيريا أو منضمة إلى بروتين بكتيريا الموسومة تعلق على الخرز. وبعد ذلك تضاف حبات FLAG في شطف بكتيريا. ثم يتم مزال البروتينات التي تحتوي على أي علامة FLAG أو لا بد أن البروتين-FLAG الموسومة تعلق على الخرز. يمكن تحليلها Elutions بالطرق المشار إليها.طالبان الباكستانية: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: التمثيل التخطيطي للاستراتيجية التونسية. بروتوكول مفصل لبرنامج المساعدة التقنية. انظر النص لمزيد من التفاصيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)

الرقم 3: مثال من الخطوة بخطوة تحليل تنقية التونسية. (أ) تحليل لطخة غربية من TAP (CycT1: S وCDK9: F). (ب) تحليل لطخة غربية من TAP متبادلة (CDK9: S وCycT1: F). جيئة وذهابا تم تحميل م 1 مل من الخلايا المحللة كله، 5 ميكرولتر (0.2٪) باسم "بكتيريا ا ف ب الإدخال". تم إضافة 975 ميكرولتر من الخلية المحللة كله المتبقية إلى حبات بكتيريا للبكتيريا AP و 100 ميكرولتر من "بكتيريا AP شطف" تم جمعها. من هذا، كان 5 ميكرولتر (2٪) تحميل. تم إضافة 80 ميكرولتر من "بكتيريا AP شطف" لحبات FLAG للملكية الفكرية FLAG و 30 ميكرولتر من "FLAG IP شطف" تم جمعها. من 30 ميكرولتر من "FLAG IP شطف"، تم تحميل 7 ميكرولتر (23.3٪). (ج) تحليل وصمة عار فضي للTAP (CycT1: S وCDK9: F). تحليل (D) الفضة صمة TAP متبادلة (CDK9: S وCycT1: F). تم تحميل 5 ميكرولتر (2٪) من "بكتيريا AP شطف" و 7 ميكرولتر (23.3٪) من "FLAG IP شطف". وتشير العلامات النجمية الشوائب شارك في مزال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

EP-together.within الصفحات = "1" FO: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">
بروتين المخلفات قوه موجهة بطاقة مواقع الاستنساخ مرجع
CycT1 1-708 pcDNA / 4TO بكتيريا HindIII - EcoRI ماكنمارا وآخرون. 2013 10
CycT1 1-708 pcDNA / 4TO FLAG HindIII - EcoRI هذا المقال
CDK9 1-372 pcDNA / 4TO بكتيريا HindIII - XhoI هذا المقال
CDK9 1-372 pcDNA / 4TO FLاي جي HindIII - XhoI ماكنمارا وآخرون، 2013 10
GFP 1-238 pcDNA / 4TO بكتيريا-FLAG BamHI - XhoI هذا المقال

الجدول 1: البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة. تم ligated CycT1 وCDK9 في pcDNA / 4TO-بكتيريا وناقلات البلازميد pcDNA / 4TO-FLAG. تحولت هذه التركيبات في الخلايا المختصة DH5α ومطلي على لوحات LB-الأمبيسلين. وقد تم اختيار المستعمرات، نمت، وفحص. بنجاح وتم التحقق من الحيوانات المستنسخة ligated التي كتبها سانجر تسلسل والجمع بين الهضم تقييد والاغاروز الكهربائي للهلام. لCycT1 استخدمنا نسخة مختصرة (1-708) بدلا من كامل طول (1-726) لأن 18 بقايا مشاركة تحتوي على تسلسل الآفات (سلسلة ببتيد غنيةالبرولين، وحمض الجلوتاميك، سيرين، وثريونين)، الذي يعمل بمثابة إشارة الببتيد لتدهور البروتين 20. كان CDK9 كامل طول. تسلسل العلامة جنبا إلى جنب بكتيريا كما يلي: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. تسلسل العلامة جنبا إلى جنب العلم هو كما يلي: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.

الجدول 2: استكشاف الأخطاء وإصلاحها الجدول. قبل البدء في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، تحقق مزدوج للتأكد من أن كل خطوة أساسية تم اتباعها. تتطلب بعض الخطوات في هذا البروتوكول مزيد من التحسين من الآخرين لتحقيق النتيجة المتوقعة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول صفها هنا للتعبير عن وعزل بروتين المجمعات من الخلايا حقيقية النواة لا يقتصر على توصيف البيوكيميائية مثل هذه التجمعات الجزيئية، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد interactors الجديدة والتعديلات بعد متعدية التي يمكن أن تنظم وظيفتها. لا يقتصر استخدام علامات التقارب إلى ما ورد في هذا البروتوكول. ولكن تجربتنا تشير إلى أن استخدام بكتيريا كخطوة AP الأولى تعزز بشكل كبير من العائد من مجمع البروتين البروتين النهائي. كلا الخطوات الملزمة وشطف من وإلى حبات بكتيريا هي فعالة للغاية مقارنة مع غيرها من العلامات حاتمة (على سبيل المثال، FLAG). وبالإضافة إلى ذلك، من الناحية النظرية، يمكن أن تطبق التونسية للبروتينات أو المجالات الأخرى مع بعض التحسينات الطفيفة، مثل ظروف عازلة، وعدد من لوحات في التجربة (لأنظمة التعبير عابرة ومستقرة على حد سواء)، الخ. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تكون طريقة TAP ر التطبيقيةس خطوط الخلايا الأخرى إذا تتطلب مجمعات البروتين محددة نظام خاص لوظيفتها أو تفاعلها مع عوامل فريدة من نوعها. لتسهيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها، فمن المستحسن جدا أن المدخلات وFT عينات كل من يتم حفظ (الجدول 2). عندما العصابات البروتين المتوقع لا يمكن تصور في شطف، وعينات FT يمكن استخدامها لاستكشاف التجربة وتحديد ما إذا كان أو لم يكن عينة قد ملزمة لو / أو مزال الخروج من الخرز.

وكالة الأنباء التونسية الناجحة هي التي تعتمد بشكل صارم على مستويات عالية من بروتين تعبير والانتعاش. وبالتالي فإن الباحثين لتحسين كمية بدءا المواد على أساس كل حالة على حدة. إذا تم استخدام ترنسفكأيشن عابرة للتعبير عن مكونات البروتين، وينبغي أن تكون كفاءة ترنسفكأيشن لا يقل عن 70٪ قبل الشروع في الخطوة الثانية من برنامج المشورة التقنية. الطريقة التونسية المتبادل (التي يتم تبديل الحواتم بين الطعم اثنين) وعادة ما يساعد في تحديد استراتيجية تجريبيةوينبغي أن تستخدم لتحقيق أفضل نقاء والعائد. مرة أخرى، وهذا سيكون لديك ليتم التحقيق على أساس كل حالة على حدة. الأهم من ذلك، أداء TAP متبادلة يؤكد أيضا أن مؤشر أسعار المنتجين مستقلة للعلامة تقارب المستخدمة.

بعض جوانب الطريقة التونسية قدمت لها قيود في هذه الوثيقة. على سبيل المثال، overexpressing وFLAG- والبروتينات الموسومة بكتيريا يمكن أن تولد الأعمال الفنية للبروتين أعرب ectopically نفسها أو interactors بهم. قد تؤثر على علامات حاتمة مختلف المستويات تعبير البروتين، التشكل البروتين، و / أو توطين التحت خلوية. وبالاضافة الى خط الخلية والكفاءة ترنسفكأيشن الحد، وحجم المجمعات ليكون منقى قد يكون مشكلة. هذه الطريقة التونسية يعمل بشكل جيد للبروتين المجمعات متعددة فرعية. من تجربتنا، وأربعة عناصر يمكن الكشف عنها بواسطة وصمة عار الفضة (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، عند استخدام مكونات الموسومة اثنين، قد لا يكون interactors أخرى شارك في تنقية عند مستويات متكافئة متطابقة. وبالتالي،لهذا الهدف المحدد، وينصح استخدام خطوط الخلايا الذي يسبب انخفاض مستويات التعبير عن مكونات معقدة. أن الحد الآخر هو قوة مؤشر أسعار المنتجين. إذا كانت التفاعلات ليست مستقرة بما فيه الكفاية، يمكن أن تفقد بعض المكونات أثناء خطوات تنقية (لا سيما في خطوة IP FLAG النهائية).

وقد وصفت طريقة التونسية سابقا وتم اختبار عدة علامات حاتمة مختلفة، التحقق من صحة، ومقارنة 6. ومع ذلك، فإن الطريقة التونسية في هذه المقالة هو الرواية، ويقدم استراتيجية سهلة وفعالة وقوية، وبديلة لدراسة مثبطات مضخة البروتون، والتجمع معقدة، والاستدلال على تكوين شبكة البروتين وظيفة. بالمقارنة مع الطرق التونسية السابقة، تسمح هذه الاستراتيجية التونسية بكتيريا-FLAG لتنقية السريع المجمعات لمزيد من التوصيف دون علم مسبق معقدة التركيب، والنشاط، أو وظيفة. ودون الحاجة إلى انشقاق الأنزيم البروتيني (على سبيل المثال، TEV) لشطف البروتين (WHالتراث الثقافي غير المادي يمكن أن تقلل بشكل كبير العائد البروتين). ونظرا لزيادة الانتعاش بروتين معقد، وطريقة TAP بكتيريا-FLAG يسمح أيضا لتحديد القوي من البروتينات التي ترتبط في مجمع البروتين من الفائدة في الخلايا من خلال تحليل جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي 10، 15. وفي وقت لاحق، وأساليب أخرى، مثل الفحص المجهري متحد البؤر، اللوني حجم الإقصاء، والمقايسات شارك في الملكية الفكرية، ويمكن أيضا أن تستخدم للتحقق من صحة مثبطات مضخة البروتون. وأخيرا، فإننا نقترح أن صيغة بديلة للبروتوكول TAP يمكن تكييفها لتنقية ودراسة تجميع البروتين المجمعات الحمض النووي الريبي منفصلة، ​​الأمر الذي سيساعد بشكل كبير الباحثين في مجال علم الأحياء الحمض النووي الريبي.

وباختصار، فإننا نقدم وسيلة لتنقية وتوصيف مثبطات مضخة البروتون في خطوط خلايا الثدييات. نقترح أن هذا الأسلوب يضع الأساس لتوصيف المستقبل والتحليل الوظيفي للعديد من المجمعات البروتين الرواية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) GE Healthcare Life Sciences/Hyclone SH3002.2FS
Fetal bovine serum GE Healthcare Life Sciences/Hyclone SH30071
Penicillin/Streptomycin MP Biomedicals MP091670049
PolyJet SignaGen Laboratories SL100688
Protease inhibitor cocktail  Roche  11836153001
STREP-Tactin Superflow IBA Lifesciences 2-1208-010
STREP-tag elution buffer IBA Lifesciences 2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich F2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve Corning  430167
Protein Lo-Bind Eppendorf Eppendorf 022431081
Digital Vortex Mixer Fisher Scientific  02-215-370
48 hole micro tube foam rack Fisher Scientific 02-215-386
Labquake shaker rotisserie  Thermo  415110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
  2. Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
  3. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  4. Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
  5. Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
  6. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  7. Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
  8. Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
  9. Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
  10. McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
  11. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
  12. D'Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
  13. McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
  14. Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
  15. McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  17. Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
  18. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
  19. Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
  20. Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 119، تنقية التقارب، وتفاعلات البروتين البروتين، بروتين المجمعات، ف TEFb، النسخ
جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, Z., Fung, V., D'Orso, I. Tandem… More

Ma, Z., Fung, V., D'Orso, I. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (119), e55236, doi:10.3791/55236 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter