Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

Published: January 26, 2017 doi: 10.3791/55236
* These authors contributed equally

Abstract

Oprensningen af aktivt protein-protein og protein-nukleinsyre-komplekser er afgørende for karakterisering af enzymatiske aktiviteter og de novo identifikation af hidtil ukendte underenheder og post-translationelle modifikationer. Bakterielle systemer giver mulighed for ekspression og oprensning af en bred række af enkelte polypeptider og protein-komplekser. Men denne ordning ikke muligt oprensningen af proteinunderenheder, der indeholder post-translationelle modifikationer (fx phosphorylering og acetylering), og identifikationen af hidtil ukendte regulatoriske underenheder, der kun er til stede / udtrykt i den eukaryote system. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af et hidtil ukendt, robust og effektiv tandem affinitetsoprensning (TAP) fremgangsmåde under anvendelse STREP- og FLAG-mærkede proteiner, som letter oprensningen af ​​proteinkomplekser med midlertidigt eller stabilt udtrykte epitop-mærkede proteiner fra eukaryote celler. Denne protokol kan anvendes til at karakterisere protein komplekse funktionalitet, for at opdage post-translationelle modifikationer på komplekse underenheder, og at identificere nye regulatoriske komplekse komponenter ved massespektrometri. Især kan anvendes denne TAP metode til at studere protein-komplekser dannet af eukaryote eller patogene (viral og bakteriel) komponenter, hvilket således giver en bred vifte af downstream eksperimentelle muligheder. Vi foreslår, at forskere, der arbejder med protein-komplekser kunne udnytte denne tilgang på mange forskellige måder.

Introduction

Protein-protein interaktioner (PPI) er afgørende for den præcise regulering af biologiske processer 1, og yderligere undersøgelser af disse PPI'er kan informere om deres funktion 2. Adskillige fremgangsmåder er blevet udtænkt til undersøgelse og karakterisering af PPI samt for de novo identifikation af hidtil ukendte regulatoriske proteinkomponenter. I 1989 Stanley Fields og kolleger rapporterede gær to-hybrid (Y2H) assay 3. Denne fremgangsmåde giver mulighed for saglig og omfattende identifikation af interaktionskandidater (byttedyr) for en defineret protein af interesse (lokkemad) i Saccharomyces cerevisiae. Ud over sin bemærkelsesværdige værktøj til at opdage PPI kan Y2H assay anvendes til karakterisering proteinpar i gærceller, der definerer minimale interagerende domæner, og identifikation af mutationer, der ophæver sådanne interaktioner. Ved at modificere Y2H assay kan PPI også studeres i pattedyrcellerclass = "xref"> 4. Variationer af Y2H assayet (f.eks gær tre-hybrid-system) kan også anvendes til at studere protein-RNA og protein-small organiske ligand-interaktioner i celler.

En anden almindeligt anvendt værktøj til at studere PPI i et homologt system er det co-immunpræcipitering (co-IP) assay 5. Ved anvendelse af et antistof til at immunpræcipitere et protein af interesse, co-IP analysen muliggør forskere til at overvåge PPI i celler for forskellige miljømæssige forhold og eksperimentelle situationer. Anvendelsen af epitop-mærkede proteiner (fx FLAG, Myc, STREP, og HA, blandt andre) i affinitetsoprensning (AP) metoder har lettet isolering af proteiner fra komplekse proteinblandinger i flere nedstrøms assays, herunder Western blot, sølvfarvning og enzymatisk analyse. Ingen af disse tidligere fremgangsmåder muliggøre isoleringen af store mængder proteinkomplekser til yderligere karakterisering, herunder in vitro enssays, opdagelsen af ​​regulatoriske underenheder ved massespektrometri, og identifikation af post-translationelle modifikationer. En forbedret udgave af AP metoden kaldes Tandem AP (TAP), der er en oprensningsteknik til undersøgelse PPI ved at skabe et fusionsprotein med to epitoper, der er oprenset gennem to efterfølgende APs 6, 7. I denne artikel præsenterer vi en variation af TAP metode til rensning af protein komplekser, hvor to underenheder er mærket med forskellige epitoper og derefter renset gennem to sekventielle APs (STREP AP efterfulgt af FLAG IP). Vi først give et minimalistisk overblik over TAP (figur 1) og derefter en detaljeret beskrivelse af alle de eksperimentelle trin (figur 2), så forskerne kan anvende dem til deres protein kompleks af interesse.

For at demonstrere anvendeligheden af ​​den TAP-metoden, valgte vi en velkarakteriseret cyclin-CDK-kompleks (benævnt PTEfB-kinase), som er sammensat af de lovgivningsmæssige underenhed cyclin T1 (CycT1) og en kinase (CDK9), og er involveret i reguleringen af transskription af RNA-polymerase II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb phosphorylerer den C-terminale domæne af Pol II og dens tilknyttede negative forlængelsesfaktorer, som mindsker transkriptionel pause på promotoren og derved letter transkription forlængelse 11, 12, 13. Med denne kendte interaktion i tankerne, STREP-mærket CycT1 og FLAG-mærkede CDK9 var over udtrykkes i HEK293T celler. En gensidig TAP eksperiment blev udført med STREP-mærkede CDK9 og FLAG-mærket CycT1 til yderligere at validere, at protein-interaktion er uafhængig af epitoperne udnyttet. Celler blev opsamlet og lyseret 48 timer efter transfektion. Den opløselige lysat blev renset ved TAP (STREP AP efterfulgt af FLAGIP). Input og oprensede proteiner blev analyseret ved western blot og sølvfarvning (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plating Celler

  1. En dag før transfektion, plade 3,5 x 10 6 HEK293T celler i 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum (FBS) og 1% (v / v) penicillin / streptomycin (10.000 U / ml stamopløsning) per 100 mm skål. Plate 3 - 5 100 mm skåle pr eksperiment / tilstand for at sikre tilstrækkelig protein opsving.
    BEMÆRK: Antallet af plader skal bestemmes for hvert forsøg / tilstand, som vil stole på ekspressionsniveauerne og opløselighed af proteinet kompleks af interesse. Alternativt, hvis der er behov større skala oprensning, cellelinier kan tilpasses til at vokse i suspensioner i centrifugekolber 2, men denne metode vil ikke arbejde for transiente transfektioner.

2. transfektion af celler eller overtale stabile cellelinier

  1. Den følgende dag, kontrollere cellerne under mikroskop. Cellerne skal være 70 - med 80% sammenflydende før proceRedigering.
  2. Transficere cellerne med en samlet blanding af 7 ug af plasmid-DNA og 21 pi transfektionsreagens pr 100 mm skål. Transficere celler med en vektor, som udtrykker GFP (tabel 1) som en kontrol for transfektionseffektivitet.
    BEMÆRK: Hvis bruger en HEK293-T-Rex eller lignende stabil cellelinie, der inducerer ekspressionen af to eller flere komplekse underenheder som reaktion på doxycyklin 14, 15, vil induceren skal føjes til cellerne og inkuberet i 48 timer. Tilsvarende ville en stabil cellelinie, der inducerer ekspressionen af ​​GFP ved tilsætning af induceren også være påkrævet til validering. Fortsæt til trin 2.7.
  3. Forbered transfektionsblandingen pr 100 mm skål. I et 1,5 ml mikrocentrifugerør, blandes 500 pi ikke-suppleret DMEM med 7 ug totalt plasmid-DNA (svarende til to eller flere plasmider). I et separat mikrocentrifugerør, blandes 500 pi usuppleret DMEM with 21 pi af transfektionsreagens. Gentag for hver transfektion reaktion.
  4. Pipettere transfektionen reagensopløsning i plasmidet DNA-opløsning (ikke blandes opløsninger i omvendt rækkefølge). Bland ved pipettering mindst 4 gange.
  5. Inkuber denne blanding ved stuetemperatur i 10 - 15 minutter, men ikke længere end 15 min.
  6. Vip pladen til at skabe et medie reservoiret og forsigtigt pipetteres transfektionsblandingen dråbevis på den indvendige side af pladen uden at forstyrre cellerne. Retur fadet til sin oprindelige flade stilling og bland forsigtigt for at fordele blandingen.
  7. Inkuber cellerne ved 37 ° C i en fugtig cellekultur inkubator med 5% CO2 (denne tilstand er i det følgende benævnt "vævskulturinkubator"). Udskift mediet 5 timer efter transfektion (ekstraudstyr).

3. Kontrol Transfektion eller induktion Effektivitet

  1. Ved 24 timer efter transfektion, visualisere cellerne under en influenzaorescent mikroskop for at kontrollere for transfektionseffektivitet (eller induktion af kontrol HEK293T-Rex stabil cellelinie, der udtrykker GFP). Inkuberes i yderligere 24 timer.

4. STREP Affinity Purification (STREP AP)

  1. Indsamling af cellerne
    1. Ved 48 timer efter transfektion, fjerne materialet, og der tilsættes 8 ml koldt 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Pipettere op og ned for at frigøre celler fra pladen.
    2. Indsamle og overføre cellesuspensionen i et 15 ml rør og spin cellerne ned ved 800 x g i 4 minutter ved 4 ° C.
    3. Fjern PBS supernatanten. Gentag spin ned (800 x g i 1 min ved 4 ° C) for at fjerne enhver resterende PBS. Opbevar cellepelleten ved -80 ° C til senere brug eller følge nedenstående fremgangsmåde for at fortsætte proteinoprensning.
  2. Lyse af cellerne
    1. Resuspender cellepellets anvendelse af 5 × cellepelleten volumen (~ 250 pi per plade) af Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, protease inhibitor cocktail tablet, 5% v / v glycerol og 1,0% NP-40) og overføre cellesuspensionen til en 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
    2. Kort fortalt vortexes suspension og nutate i 30 minutter ved 4 ° C.
    3. Spin ned cellesuspensionen ved 10.000 xg i 10 min ved 4 ° C.
    4. Overfør de opløselige lysater til en ny 1,5 ml mikrocentrifugerør og kassér cellepellets. Spar 10% af det endelige volumen af ​​den opløselige lysat som "STREP AP Input". Opbevares ved 4 ° C.
  3. Ækvilibrering af STREP perler
    BEMÆRK: Brug STREP perler for første AP skridt! Komplekser trak ned med STREP perler genvinde betydeligt mere protein end dem trukket ned med FLAG perler.
    1. Tag (n × 40 pi) + n ul af 50% STREP perle gylle (n = antal prøver) og spin ned på 1500 xg i 2 min ved 4 ° C.
      BEMÆRK: Brug bred mouthed tips til pipette perler.
    2. Fjern supernatanten og tilsæt 500 pi PLB til perlerne. Nutate perlerne blandingen i 5 minutter ved 4 ° C. Spin ned ved 1.500 xg i 2 min ved 4 ° C.
      1. Gentag for i alt 3 vaske. Resuspendere perlerne i PLB til et endeligt volumen på n × 40 pi.
    3. Tilsæt 40 ​​pi 50% STREP bead opslæmning til hver cellelysat prøve og nutate i 2 timer ved 4 ° C.
  4. STREP AP
    1. Spin ned opløsning ved 1.500 xg i 2 min ved 4 ° C.
    2. Fjern supernatanten og opbevares som "STREP AP Flow-through (FT)" ved 4 ° C.
    3. Der tilsættes 500 pi STREP AP vaskebuffer I (20 mM Tris-HCI pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol og 0,2% NP-40) til perlerne. Nutate perlerne blandingen i 5 minutter ved 4 ° C og centrifugeres ved 1.500 xg i 2 min ved 4 ° C. Supernatanten kasseres.
      1. Gentag for i alt 4 gange.
    4. Tilføj 500 pi vaskebuffer II (100 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl og 1 mM EDTA) og tempereres perlerne ved at vende rørene. Spin ned ved 1.500 xg i 2 min ved 4 ° C og supernatanten.
    5. Eluering af proteinet af interesse med 50 pi STREP Elution Buffer (100 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA og 2,5 mM desthiobiotin). Vortex ved 800 rpm i 15 minutter ved 4 ° C.
    6. Spin ned perlerne ved 1.500 xg i 1 min ved 4 ° C. Opsaml supernatanten. Denne fraktion svarer til den "STREP AP Eluering" prøve.
    7. Gemme perler fraktion ved 4 ° C i en anden eluering, hvilket kan give op til halvdelen af ​​den mængde protein opnået med den første eluering. Alikvot 10% af STREP AP Eluering for sølvfarvning og / eller western blotting16.
  5. Ækvilibrering FLAG perler
    1. Tag (nx 16 pi) + n ul FLAG perler løsning (n = antal prøver) og spin ned på 1500 xg i 2 min ved 4 ° C.
      BEMÆRK: Brug bred mouthed tips til pipette perler.
    2. Fjern supernatanten og tilsæt 500 pi FLAG vaskebuffer (100 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, og 0,1% NP-40) til perlerne. Spin ned ved 1.500 xg i 2 min ved 4 ° C. Gentag for i alt 3 vaske.
    3. Resuspendere perlerne i FLAG vaskebuffer til et endeligt volumen på nx 16 pi.
    4. Tilføj 16 pi af FLAG bead opslæmning til det resterende STREP AP eluering og nutate natten over ved 4 ° C.

5. FLAG IP

  1. Spin ned FLAG perler suspension ved 1.500 xg i 2 minutter ved 4 ° C. Gemme supernatanten og opbevares som "FLAG IP Flow-through" (FT) ved 4 ° C.
  2. Tilføj 50081; l FLAG vaskebuffer til løsningen. Nutate i 5 minutter ved 4 ° C og centrifugeres ved 1.500 xg i 2 min ved 4 ° C. Gentag for i alt 4 gange vask og fjern supernatanten efter hver vask.
    BEMÆRK: Før den fjerde vask, overføre protein-perler løsning på et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør at reducere baggrunden. Dette trin er vigtigt.
  3. Fjern supernatanten fra den endelige spin og tilsættes 30 pi FLAG vaskebuffer indeholdende 200 ng / ul FLAG peptid i perlerne. Vortex ved 800 rpm i 2 timer ved 4 ° C.
  4. Spin ned suspensionen ved 1.500 xg i 2 min ved 4 ° C. Høst supernatanten og opbevares ved 4 ° C som "FLAG IP Elution."
    BEMÆRK: Elueringsbetingelserne prøver kan bekræftes ved sølvfarvning og / eller western blot med standardprotokoller 16, og er klar til yderligere proteinanalyser. Ved opsætning af en western blot, køre alle de følgende prøver: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutipå, (4) FLAG IP FT, og (5) FLAG IP eluering. Mængder indlæst skal bestemmes for hvert forsøg. Alle indsamlede prøver og Perlerne kan opbevares ved 4 ° C til kortvarig opbevaring og ved -80 ° C til langsigtet opbevaring. TAP prøver kunne analyseres ved massespektrometri til at kontrollere identiteten af deres komponenter, at identificere nye post-translationelle modifikationer (PTMS), og / eller at opdage nogen nye protein interaktion med det rensede kompleks 2, 17. Til dette formål efter at have kørt en coomassie gel eller sølvfarve, bånd kan udskæres fra gelen under anvendelse af en ren skalpel. Flere gode anmeldelser, der diskuterer massespektrometri metoder blev tidligere publiceret 18, 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne artikel, vi demonstrere anvendeligheden af ​​TAP-metoden til den velkarakteriserede CycT1-CDK9 kompleks (også kendt som P-TEFb kinase).

Plasmider kodende Cyclin T1-STREP (CycT1: S) og CDK9-FLAG (CDK9: F), eller CDK9-STREP (CDK9: S) og cyclin T1-FLAG (CycT1: F) (tabel 1), blev transficeret ind HEK293T celler . Negative kontroller omfattede transfektioner med en tom vektor og den CDK9: F eller CycT1: F-plasmider (figur 3A og B, henholdsvis). Proteinerne blev udtrykt i 48 timer før cellerne blev opsamlet. Flere plader af celler blev anvendt pr eksperiment (fem plader per prøve blev anvendt til dataene i figur 3) for at øge proteinproduktion og genvinding. Efter at cellerne var lyseret i individuelle mikrocentrifugerør blev cellelysater af den samme prøve kombineres til én microcentrifuge rør før tilsætning Strep perler. Kombinere de proteinprøver med en portion af perlerne øger endelige proteinkoncentration, som kan forbedre proteingenvinding fra proteiner, som er vanskeligt at udtrykke. Efter den indledende eluering, kan en anden eluering gøres for at øge det samlede protein input for FLAG IP. Det er vigtigt at gemme input for hvert oprensningstrin før tilsætning perlerne til fremtidig fejlmelding (tabel 2), hvis det er nødvendigt.

Dataene i Figur 3A viser resultaterne af TAP fremgangsmåde til CycT1: S og CDK9: F, analyseret ved western blot. CDK9: F co-elueret med CycT1: S fra STREP perler, men ikke i den negative kontrol AP mangler CycT1: S, hvilket indikerer, at CDK9: F og CycT1: S danner et protein-protein-kompleks. Forventeligt, blev påvist begge proteiner i FLAG eluering, hvilket yderligere bekræftede kompleksdannelse. Figur 3B viser results gensidig TAP-metoden, hvor epitop tags af de to proteiner blev byttet (CDK9: S og CycT1: F), og analyseret ved western blot.

Figurerne 3C og 3D viser resultaterne af TAP og gensidig TAP analyseret ved sølvfarvning hhv. Figur 3C bane 2 viste, at CDK9: F co-elueret med CycT1: S off af STREP perler, men ikke fra kontrolprøven AP (bane 1), hvilket viser, CDK9: F og CycT1: S dannet et protein-protein-kompleks. I den efterfølgende FLAG eluering, som vist i bane 4, CycT1: S co-elueret med CDK9: F off af FLAG perler. Tilsvarende viste figur 3D, at CycT1: F co-elueret med CDK9: S off af STREP perler, men ikke fra kontrolprøven AP, og at protein-protein-kompleks blev effektivt udvundet efter den anden FLAG IP trin. Både de vestlige klatter og sølv pletter bekræftede, at TAP-protokollen arbejdet effektivt for purificatio n, isolation og karakterisering af proteinet komplekset af interesse.

figur 1
Figur 1: Oversigt over TAP Oprensning strategien. En simpel ordning beskriver trinnene TAP. Plasmider kodende for proteinet af interesse med enten STREP eller FLAG-epitopmærke cotransficeres i pattedyrceller. Efter 48 timers induktion, opsamles cellerne og lyseret. Opløseligt cellelysat indeholdende proteinet af interesse sammen med andre proteiner lastes STREP perler til STREP AP. Proteiner, der enten indeholder STREP tagget eller er bundet til STREP-mærkede protein bundet til perlerne elueres derefter. Flaget perler blev derefter tilsat i STREP eluering. Proteiner, der enten indeholder FLAG-mærke eller er bundet til FLAG-mærkede protein bundet til perlerne elueres derefter. Elueringer kunne analyseres ved de angivne metoder.TTP: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Skematisk repræsentation af TAP strategien. En detaljeret protokol for TAP. Se tekst for detaljer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3

Figur 3: Eksempel på trin-for-trin Analyse af TAP Rensning. (A) Western blot-analyse af TAP (CycT1: S og CDK9: F). (B) Western blot analyse af gensidig TAP (CDK9: S og CycT1: F). froM 1 ml helcellelysat, 5 pi (0,2%) blev fyldt som "STREP AP Input". 975 pi af den resterende helcellelysat sattes til STREP perler til STREP AP og 100 pi "STREP AP Eluering" er indsamlet. Fra denne, 5 pi (2%) blev indlæst. 80 pi af "STREP AP Eluering" blev tilføjet til FLAG perler for FLAG IP og 30 pi "FLAG IP Eluering" blev indsamlet. Fra de 30 pi "FLAG IP Eluering", blev 7 pi (23,3%) indlæst. (C) Sølv plet analyse af TAP (CycT1: S og CDK9: F). (D) Silver plet analyse af gensidig TAP (CDK9: S og CycT1: F). 5 pi (2%) af "STREP AP Eluering" og 7 pi (23,3%) af "FLAG IP Elution" blev indlæst. Stjernerne angiver co-eluerede urenheder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protein Rester Vector tag kloningssites Reference
CycT1 1-708 pcDNA / 4to STREP HindIII - EcoRI McNamara et al. 2013 10
CycT1 1-708 pcDNA / 4to FLAG HindIII - EcoRI denne artikel
CDK9 1-372 pcDNA / 4to STREP HindIII - XhoI denne artikel
CDK9 1-372 pcDNA / 4to FLAG HindIII - XhoI McNamara et al., 2013 10
GFP 1-238 pcDNA / 4to STREP-FLAG BamHI - XhoI denne artikel

Tabel 1: Plasmider anvendt i denne undersøgelse. CycT1 og CDK9 blev ligeret i pcDNA / 4to-STREP og pcDNA / 4to-FLAG plasmidvektorer. Disse konstruktioner blev transformeret til DH5a kompetente celler og udpladet på LB-ampicillinplader. Kolonier blev udvalgt, dyrket og screenes. Succesfuld ligerede kloner blev verificeret ved Sanger-sekventering og kombinationen af ​​restriktionsspaltning og agarosegelelektroforese. For CycT1 brugte vi en kortere version (1 - 708) i stedet for i fuld længde (1 - 726), fordi de sidste 18 rester indeholde en PEST-sekvens (en peptidsekvens rig påprolin, glutaminsyre, serin og threonin), der fungerer som et signalpeptid for proteinnedbrydning 20. CDK9 var fuld længde. Sekvensen af ​​tandem STREP tag er som følger: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. Sekvensen af ​​tandem FLAG tag er som følger: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.

Tabel 2: Fejlfinding Tabel. Inden du begynder med fejlfinding, at dobbelttjekke sørge for, at hvert væsentligt skridt er blevet fulgt. Visse skridt i denne protokol kræver mere optimering end andre for at opnå det forventede resultat. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den her beskrevne for ekspression og isolering af proteinkomplekser fra eukaryote celler protokol er ikke begrænset til den biokemiske karakterisering af sådanne molekylære samlinger, men kan også anvendes til identifikation af hidtil ukendte interaktionskandidater og post-translationelle modifikationer, som kunne regulere deres funktion. Udnyttelsen af ​​affinitetsmærker er ikke begrænset til, hvad der er nævnt i denne protokol; men vores erfaring viser, at anvendelse af STREP som første AP trin væsentligt forøger udbyttet af det endelige protein-protein-kompleks. Både de bindende og elueringstrin til og fra STREP perler er ekstremt effektive i forhold til andre epitopmærker (fx FLAG). Derudover i teorien, TAP kunne anvendes på andre proteiner eller domæner med nogle mindre optimeringer, såsom pufferbetingelser, antal plader pr eksperiment (både forbigående og stabile udtrykkende systemer), etc. Endvidere kan TAP metoden også være anvendt to andre cellelinjer, hvis specifikke protein komplekser kræver et særligt system for deres funktion eller deres samspil med unikke faktorer. For at lette fejlfinding, er det stærkt anbefales, at indgangs- og FT prøver både blive frelst (tabel 2). Når de forventede proteinbånd kan ikke visualiseres i elueringen kan FT prøver anvendes til fejlfinding eksperimentet og afgøre, hvorvidt prøven havde bundet til og / eller elueres ud af perlerne.

En vellykket TAP er strengt afhængig af høje niveauer af proteinekspression og nyttiggørelse. Således ville forskerne nødt til at optimere mængden af ​​udgangsmaterialet fra sag til sag. Hvis kortvarig transfektion bruges til at udtrykke proteinkomponenter bør transfektionseffektiviteten være mindst 70% før man går videre med det andet trin i TAP. Den gensidige TAP-metoden (hvor epitoper byttet mellem de to lokkemad) hjælper som regel til at bestemme hvilke eksperimentelle strategibør anvendes til at opnå den bedste renhed og udbytte. Igen vil det have skal undersøges fra sag til sag. Vigtigere, udfører gensidige TAP bekræfter også, at PPI er uafhængig af affinitetsmærket anvendes.

Nogle aspekter af TAP-metoden præsenteret heri har begrænsninger. For eksempel kunne overudtrykker flag- og STREP-mærkede proteiner generere artefakter for selve ektopisk udtrykte protein eller deres interaktionskandidater. Forskellige epitopmærker kan påvirke protein-ekspressionsniveauer, protein konformation og / eller subcellulær lokalisering. Udover cellelinie og transfektionseffektivitet begrænsning til størrelsen af ​​komplekserne oprenses kan være et problem. Denne TAP metode fungerer godt for multi-subunit-protein-komplekser. Fra vores erfaring, kan fire komponenter detekteres ved sølvfarvning (data ikke vist). Men når du bruger to-mærkede komponenter, de andre interaktionskandidater kan ikke være co-renset på samme støkiometriske niveauer. Derfor,til dette særlige mål, er anvendelsen af ​​cellelinjer, der inducerer lavere niveauer af ekspression af de komplekse komponenter tilrådes. En anden begrænsning er styrken af ​​PPI. Hvis interaktioner er ikke stabile nok, kan nogle komponenter blive tabt i oprensningstrin (især i det sidste FLAG IP trin).

TAP fremgangsmåde er tidligere blevet beskrevet og adskillige forskellige epitopmærker blev testet, valideret og sammenlignet 6. Men TAP metode præsenteres i denne artikel er ny og giver en nem, effektiv, robust og alternativ strategi for at studere PPI'er, kompleks samling, og udlede protein netværk sammensætning og funktion. Sammenlignet med tidligere TAP metoder, dette STREP-FLAG TAP strategi muliggør hurtig oprensning af komplekser til yderligere karakterisering uden forudgående kendskab til den komplekse sammensætning, aktivitet eller funktion; og uden behov for proteasespaltning (f.eks TEV) for proteineluering (which kan væsentligt reducere protein udbytte). På grund af den øgede proteinkompleks genopretning, STREP-FLAG TAP metode giver også mulighed for den robuste identifikation af proteiner, der associerer med proteinkomplekset af interesse i celler gennem tandem massespektrometri-analyse 10, 15. Efterfølgende andre metoder, som konfokal mikroskopi, gelpermeationskromatografi, og co-IP-assays, kan også anvendes til at validere PPI. Endelig foreslår vi, at en alternativ version af TAP-protokollen kan tilpasses til oprensning og studere samlingen af ​​diskrete protein-RNA-komplekser, som voldsomt vil hjælpe forskere inden for RNA biologi.

Sammenfattende præsenterer vi en metode til at oprense og karakterisere PPI i mammale cellelinjer. Vi foreslår, at denne metode danner grundlag for den fremtidige karakterisering og funktionel analyse af mange nye protein-komplekser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) GE Healthcare Life Sciences/Hyclone SH3002.2FS
Fetal bovine serum GE Healthcare Life Sciences/Hyclone SH30071
Penicillin/Streptomycin MP Biomedicals MP091670049
PolyJet SignaGen Laboratories SL100688
Protease inhibitor cocktail  Roche  11836153001
STREP-Tactin Superflow IBA Lifesciences 2-1208-010
STREP-tag elution buffer IBA Lifesciences 2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich F2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve Corning  430167
Protein Lo-Bind Eppendorf Eppendorf 022431081
Digital Vortex Mixer Fisher Scientific  02-215-370
48 hole micro tube foam rack Fisher Scientific 02-215-386
Labquake shaker rotisserie  Thermo  415110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
  2. Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
  3. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  4. Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
  5. Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
  6. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  7. Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
  8. Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
  9. Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
  10. McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
  11. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
  12. D'Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
  13. McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
  14. Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
  15. McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  17. Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
  18. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
  19. Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
  20. Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).

Tags

Biochemistry Affinitetsoprensning protein-protein interaktioner protein-komplekser P-TEFb transkription
Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, Z., Fung, V., D'Orso, I. TandemMore

Ma, Z., Fung, V., D'Orso, I. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (119), e55236, doi:10.3791/55236 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter