Abstract
활성 단백질 - 단백질, 단백질 - 핵산 복합체의 정제 효소 활성 및 신규 서브 유닛 및 번역 후 변형의 드 노보 식별의 특성에 매우 중요하다. 박테리아 시스템들은 단일 폴리펩티드 및 단백질 복합체의 다양한 발현 및 정제를 허용한다. 그러나,이 시스템은 번역 후 변형 (예를 들어, 아세틸 화 및 포스 포 릴화)을 포함 소단위 단백질의 정제 및 진핵 시스템에서의 발현 만 존재하는 신규 규제 소단위 /의 식별을 가능하게하지 않는다. 여기서 우리는 진핵 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 표현 에피토프 - 태그 단백질과 단백질 복합체의 정제를 용이하게하는 소설, 강력한, 그리고 STREP-를 사용하여 효율적인 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방식과 FLAG-태그 단백질에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 PROT의 특성을 적용 할 수있다EIN 복잡한 기능 복잡한 서브 유닛의 번역 후 변형을 발견, 및 질량 분광법에 의해 신규 규제 복잡한 구성 요소를 식별하기. 특히,이 방법은 TAP 따라서 하류 실험 기회 광범위한 항복 진핵 또는 병원성 (바이러스 성 및 세균성) 구성 요소에 의해 형성되는 단백질 복합체를 연구에 적용될 수있다. 우리는 단백질 복합체와 협력 연구자들이 다양한 방법으로이 방법을 활용할 수 있다고 제안한다.
Introduction
단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 그 기능이에 대해 알릴 수 생물학적 과정 (1),이 프로톤 펌프 억제제에 대한 추가 연구의 정확한 조절을 위해 중요하다. 몇몇 접근법은 프로톤 펌프 억제제의 연구 및 특성뿐만 아니라 신규 조절 단백질 성분의 드 노보 식별을 위해 고안되었다. 1989 년 스탠리 필드와 동료들은 효모 두 하이브리드 (Y2H) 분석 (3) 보도했다. 이 방법은 사카로 마이 세스 세레 비지에 인터랙 관심 (미끼)의 정의 단백질 (할까요)의 공평하고 포괄적 인 식별 할 수 있습니다. 프로톤 펌프 억제제를 발견하기위한 현저한 유틸리티 또한 Y2H 분석은, 효모 세포에서 단백질을 특성화 쌍 최소 상호 작용 도메인을 정의하고, 이러한 상호 작용을 폐지 변이를 식별하는데 사용될 수있다. Y2H 분석을 수정하여, 프로톤 펌프 억제제는 포유 동물 세포에서 공부하실 수 있습니다클래스 = "외부 참조"> 4. Y2H 분석 (예, 효모 세 하이브리드 시스템)의 변형, 단백질 및 RNA 세포 단백질 작은 유기 리간드 상호 작용을 연구에 적용 할 수있다.
상동 시스템에서 프로톤 펌프 억제제를 연구하는 또 다른 일반적으로 사용되는 도구는 공동 면역 (공동 IP) 분석 5입니다. 관심의 단백질을 면역 침전에 대한 항체를 사용하여, 공동 IP 분석 연구자들은 다양한 환경 조건 및 실험 상황에서 셀의 프로톤 펌프 억제제를 모니터링 할 수있다. 에피토프 - 태그 단백질 (예를 들면, FLAG는, Myc와, STREP 및 HA는, 다른 사람의 사이에서) 친 화성 정화 (AP) 방법이 서양 얼룩 등 여러 다운 스트림 분석 복잡한 단백질 혼합물에서 단백질의 분리를 촉진했다,은 얼룩의 사용 및 효소 분석. 그러나 이러한 이전 방법 중 어느 것도 체외을 포함하여 더 특성화 단백질 복합체의 대량의 분리를 사용하지ssays, 질량 분석 및 번역 후 변형의 식별에 의한 규제 서브 유닛의 발견. AP 통신 방식의 향상된 버전은 두 개의 연속적인 AP들 (6, 7)를 통해 정제하여 두 에피토프와 융합 단백질을 생성하여 프로톤 펌프 억제제의 연구를위한 정제 기술이다 텐덤 AP (TAP)를 호출한다. 이 문서에서 우리는 두 개의 서브 유닛이 다른 에피토프 태그 다음 두 순차 액세스 포인트 (AP STREP FLAG IP 다음)를 통해 정제하는 정제 단백질 복합체의 TAP 방법의 변화를 제시한다. 연구자들이 관심을 자신의 단백질 복합체에 적용 할 수 있도록 우리가 먼저, TAP의 최소한의 개요 (그림 1)과 모든 실험 단계에 대한 자세한 설명 (그림 2)을 제공한다.
탭 방식의 적용 성을 입증하기 위해, 우리는 (복소 잘 특징 사이클린 CDK는 PT라고 선택한규제 소단위 사이클린 T1 (CycT1) 및 키나제 (경우, Cdk9)로 구성되며, RNA 중합 효소 II (POL II) 8, 9, 10에 의해 전사 조절에 관여 EFB 키나아제). P-TEFb는 폴 II 상기 프로모터에서 전사를 일시 완화 연관된 부정적인 신장 요소의 C 말단 도메인을 인산화시켜 전사 신도 11, 12, 13을 용이하게한다. 이를 염두에 알려진 상호 작용, CycT1을 STREP - 태그 및 FLAG-태그 경우, Cdk9는 HEK293T 세포에서 발현 이상이었다. 상호 TAP 실험은 더 단백질 상호 작용이 사용 된 에피토프에 독립적 인 것을 확인하는 STREP-태그 경우, Cdk9과 FLAG-태그 CycT1로 하였다. 세포를 수거하고, 48 시간 후 형질 감염을 용해시켰다. 가용성 해물이 TAP 그래피 (STREP AP는 FLAG 다음IP). 입력 및 정제 된 단백질은 서양 얼룩과 실버 얼룩 (그림 3)에 의해 분석 하였다.
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Protocol
1. 도금 세포
- 전날 형질에 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 10 mL에 3.5 × 106 HEK293T 세포 플레이트 100mm 접시 당 (10,000 U / ㎖의 주). 플레이트 (3) - 실험 / 상태 당 5 100mm 요리는 충분한 단백질 복구를 보장합니다.
주 : 판의 개수는 관심있는 단백질 복합체의 발현 수준과 용해도에 의존하는 각 실험 / 조건에 대해 결정되어야한다. 대규모의 정제가 필요한 경우에는 세포주 스피너 플라스크이 현탁액에서 성장하도록 적응 될 수 있지만,이 방법은 일시적 형질 감염을 위해 작동하지 않을 것이다.
2. 안정 세포주를 세포 형질 감염 또는 유도
- 다음 날, 현미경으로 세포를 확인합니다. proce을하기 전에 80 % 합류 - 세포는 70해야합니다대한 수정 사항.
- 100mm의 접시 당 형질 감염 시약 7 플라스미드 DNA의 μg의 21 μl의 총 혼합물로 세포를 형질 감염. 형질 감염 효율에 대한 제어는 벡터 표현 GFP (표 1)과 함께 형질 감염 세포.
주 : 독시사이클린 14, 15에 대응하여 두 개 이상의 복잡한 소단위의 발현을 유도 HEK293-T-REX 또는 유사한 안정한 세포주를 사용하는 경우, 유도제는 세포에 첨가하고 48 시간 동안 배양되어야 할 것이다. 마찬가지로, 유도제의 첨가에 따라 GFP의 발현을 유도하는 안정한 세포 라인은 또한 검증을 위해 요구된다. 2.7 단계로 진행합니다. - 100mm 접시 당 형질 전환 혼합물을 준비합니다. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (둘 이상의 플라스미드에 상당)의 총 플라스미드 DNA 7 μg의로 비추 DMEM 500 μL를 혼합한다. 별도의 microcentrifuge 관에서 비추 DMEM 위스콘신의 500 μl를 혼합트랜 시약의 제 21 μL. 각 형질 전환 반응에 대해 반복합니다.
- 플라스미드 DNA 용액으로 형질 감염 시약 용액을 피펫 (역순으로 용액을 혼합하지 않음). 적어도 4 회 피펫 팅하여 혼합한다.
- 10 시간 동안 실온에서 혼합물을 부화하지 - 15 분, 그러나 더 이상 15 분 이상.
- 미디어 저장소를 생성하고 조심스럽게 세포를 방해하지 않고 판의 내부면에 드롭 현명 형질 전환 혼합물을 피펫 할 수있는 판을 기울입니다. 원래 평평한 위치에 접시를 반환하고, 혼합물을 배포하는 부드럽게 소용돌이 친다.
- (이 조건은 이하 "조직 배양 인큐베이터"라 함), 5 % CO 2 습윤 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 미디어 5 시간 후 형질 전환 (옵션) 장착합니다.
3. 검사의 형질 또는 유도 효율
- 24 시간 후 형질에서, 독감에서 세포를 시각화orescent 현미경은 형질 전환 효율 (또는 GFP를 발현 제어 HEK293T 렉스 안정적인 세포주의 유도)를 확인합니다. 또 다른 24 시간 동안 품어.
4. STREP 선호도 정화 (STREP AP)
- 세포를 수집
- 48 시간 포스트 형질에서 미디어를 제거하고 차가운 1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 8 ml를 추가합니다. 접시에서 세포를 분리 아래로 피펫합니다.
- 수집하고, 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 4 ℃에서 4 분 동안 800 XG에서 세포를 스핀 다운.
- PBS를 상층 액을 제거합니다. 잔여 PBS를 제거하기 (4 ℃에서 1 분 동안 800 XG)를 스핀을 반복합니다. 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 세포 펠렛을 저장 또는 단백질 정제를 계속하려면 다음 절차를 따르십시오.
- 세포를 용균
- 패시브 용해 완충액을 세포 펠렛 부피 × 5를 사용하여 세포 펠릿 (~ 플레이트 당 250 μL)에 재현 탁(PLB : 20 mM의 pH 7.5 인 Tris-HCl, 150 mM의 염화나트륨, 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 DTT, 프로테아제 억제제 칵테일 정제, 5 % V / V 글리세롤, 1.0 % NP-40) 및에 세포 현탁액을 전송 1.5 ml의 microcentrifuge 관.
- 간단히 4 ° C에서 30 분 동안 정지 및 nutate을 소용돌이.
- 4 ° C에서 10 분 동안 10,000 XG에서 세포 현탁액을 스핀.
- 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 용해 용 해물을 전송하고 세포 펠렛을 폐기합니다. 같은 수용성 해물의 최종 부피의 10 % 할인 "연쇄상 구균 AP 입력." 4 ℃에서 보관하십시오.
- 연쇄상 구균 구슬을 평형화
참고 : 첫 번째 AP 단계에 대한 사용 STREP 구슬! 연쇄상 구균 구슬 FLAG 구슬 아래로 끌어 것보다 훨씬 더 많은 단백질을 복구와 단지 아래로 당겼다.- 꺼내 (n은 40 μl를 ×) + n은 50 % 연쇄상 구균 비드 슬러리의 μL (N = 샘플 수), 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
참고 : 넓은 m를 사용하여피펫 구슬에 outhed 팁. - 상층 액을 제거하고 구슬에 PLB의 500 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 구슬 혼합물을 Nutate. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
- 3 세척 총 반복합니다. 40 μL × N의 최종 부피로 PLB의 비드를 재현 탁.
- 4 ° C에서 2 시간 동안 각각의 세포 용 해물 샘플 및 nutate 50 % 연쇄상 구균 비드 슬러리의 40 μl를 추가합니다.
- 꺼내 (n은 40 μl를 ×) + n은 50 % 연쇄상 구균 비드 슬러리의 μL (N = 샘플 수), 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
- STREP AP
- 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 솔루션을 스핀 다운.
- 4 ° C에서 "STREP AP 플로우를 통해 (FT)"로 뜨는 및 저장소를 제거합니다.
- I (20 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 250 mM의 염화나트륨, 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 DTT, 5 % 글리세롤 및 0.2 % NP-40) STREP AP 세척 버퍼 구슬에 500 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 5 4 ° C에서 분 원심 분리기의 구슬 혼합물을 Nutate. 상층 액을 버린다.
- 네 세척의 총 반복합니다.
- 네 세척의 총 반복합니다.
- 500 μL 세척 버퍼 II (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA)를 추가하고 튜브를 반전 구슬을 평형. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 버린다.
- STREP 용출 버퍼 (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 2.5 mM의 Desthiobiotin)의 50 μL과 관심의 단백질을 용출. 4 ℃에서 15 분 동안 800 rpm에서 소용돌이.
- 4 ° C에서 1 분 동안 1,500 XG에서 구슬을 스핀 다운. 상층 액을 수집합니다. 이 부분은 "STREP AP 용출"샘플에 해당합니다.
- 제 1 용출 얻어진 단백질의 양의 절반까지 얻을 수있는 초 용출, 4 ° C에서의 비드 부분을 저장한다. 실버 염색 및 / 또는 웨스턴 블로 팅에 대한 STREP AP 용출의 나누어지는 10 %16.
- 국기 구슬을 평형화
- (NX 16 μL) + n은 FLAG 비즈 솔루션의 μL (샘플 N = 번호)를 꺼내 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
참고 : 피펫 구슬에 입이 큰 팁을 사용합니다. - 상층 액을 제거하고 FLAG 세척 버퍼 500 μL를 추가 (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.1 % NP-40) 구슬에. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운. 3 세척 총 반복합니다.
- NX 16 μL의 최종 부피 FLAG 세척 완충액으로 비드를 재현 탁.
- 4 ° C에서 나머지 STREP AP 용출 및 nutate 하룻밤에 FLAG 비드 슬러리의 16 μl를 추가합니다.
- (NX 16 μL) + n은 FLAG 비즈 솔루션의 μL (샘플 N = 번호)를 꺼내 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
5. FLAG IP
- 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 플래그 구슬 서스펜션을 스핀. 4 ° C에서 "FLAG IP 플로우를 통해"(FT)으로 뜨는 및 저장소를 저장합니다.
- 500 추가(81); 솔루션에 FLAG 세척 버퍼의 리터. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 5 4 ° C에서 분 원심 분리기에 대한 Nutate. 네 세척의 총 반복하고 각 세척 한 후 상층 액을 제거합니다.
주 : 네번째 세척 전에 배경을 감소시키는 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 단백질로 비드 용액 옮긴다. 이 단계는 필수적이다. - 마지막 스핀에서 뜨는을 제거하고 구슬로 FLAG 펩타이드의 200 NG / μl를 포함 FLAG 세척 버퍼의 30 μL를 추가합니다. 4 ℃에서 2 시간 동안 800 rpm에서 소용돌이.
- 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 정지를 스핀 다운. 으로 4 ° C에서 뜨는 및 저장소를 수확 "FLAG IP 용출."
참고 : 용출 샘플 표준 프로토콜 16을 사용하여 실버 얼룩 및 / 또는 웨스턴 블롯으로 확인하고, 또한 단백질 분석을위한 준비가 될 수있다. (1) STREP AP 입력, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Eluti : 웨스턴 블롯을 설정할 때, 다음의 모든 샘플을 실행(4) FLAG IP FT, (5) FLAG IP 용출에. 로드 볼륨은 각 실험에 대해 결정되어야 할 것이다. 수집 된 모든 샘플과 비드 단기 기억과 장기 보존 -80 ° C에서 39 ° C에서 저장 될 수있다. TAP 샘플들은, 그 구성 요소의 신원을 확인하는 신규 번역 후 변형 (PTMS)를 식별 및 / 또는 정제 착체 2 (17)와 임의의 신규 단백질 상호 작용을 발견 질량 분석법에 의해 분석 될 수있다. 이러한 목적하는 쿠마 겔 또는은 염색을 실행 한 후, 밴드 깨끗한 메스를 사용하여 겔로부터 절제 될 수있다. 질량 분석 방법을 논의 몇 가지 우수한 리뷰 이전에, 19 (18)을 발표했다.
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Representative Results
이 글에서, 우리는 (또한 P-TEFb 키나제라고도 함) 복잡한 잘 특징 CycT1-경우, Cdk9에 TAP 방법의 적용 가능성을 보여줍니다.
그리고 경우, Cdk9-FLAG (경우, Cdk9 : F), 또는 경우, Cdk9-STREP (경우, Cdk9 : S) 및 시클 T1-FLAG (CycT1 : F) : 시클 T1-STREP (S CycT1) 인코딩하는 플라스미드 (표 1), HEK293T 세포로 형질 감염시켰다 . F 또는 CycT1 : (각각도 3a 및 B) F 플라스미드 음성 대조군은 빈 벡터와 경우, Cdk9와 형질을 포함했다. 세포를 수거하기 전에 단백질은 48 시간 동안 발현되었다. 세포의 여러 접시는 단백질 생산 및 복구를 증가 (샘플에 5 판 그림 3에 제시된 데이터를 사용했다) 실험을 당 하였다. 세포가 개별 마이크로 원심 튜브에 용해시킨 후, 동일한 시료의 세포 용 해물 하나 microcentrif로 합하고연쇄상 구균 구슬을 추가하기 전에 UGE 튜브. 비드의 일부와 단백질 샘플을 결합하여 표현하기 어려운 단백질의 단백질 복구를 개선 할 수있는 최종 단백질 농도를 증가시킨다. 초기 용출에 이어, 제 용출 플래그 IP에 대한 총 단백질 입력을 증가시키기 위해 수행 될 수있다. 또한 필요한 경우, 나중에 문제 (표 2)에 비즈를 첨가하기 전에 각각의 정제 단계의 입력을 저장하는 것이 중요하다.
S와 경우, Cdk9 : F, 웨스턴 블롯 분석도 3a의 데이터는 CycT1의 TAP 방법의 결과를 보여줍니다. 경우, Cdk9 : F의 CycT1와 공동는-용출 : S를 연쇄상 구균 구슬에서,하지만 CycT1 부족한 음성 대조군 AP에서 : S를, 그 경우, Cdk9를 나타내는 : F와 CycT1는 : S는 단백질 - 단백질 복합체를 형성한다. 예상대로, 두 단백질은 상기 복합체 형성 확인 플래그 용출에서 검출되었다. 도 3b는 resu를 도시(: S 및 CycT1 : 경우, Cdk9 F) 상호 TAP의 두 단백질의 에피토프 태그가 교체 된 방법의 LTS 및 웨스턴 블롯 분석.
도 3C 및 3D는 각각 실버 염색으로 분석 TAP과 상호 TAP의 결과를 보여줍니다. F CycT1와 공동 용리 : S를 STREP 구슬 떨어져 있지만 제어 AP (레인 1)에서, 이와 같이 경우, Cdk9 나타내는 : F 및 CycT1은 : S는 단백질 - 단백질 복합체를 형성도 3c 레인 2는 경우, Cdk9는 것을 보여 주었다. 후속 FLAG 용출에서는로서 레인 4에 도시 CycT1은 다음 FLAG 비드 오프 F : S의 경우, Cdk9와 공동 용출시켰다. STREP 비드 오프 S를하지만, 단백질 - 단백질 복합체를 효율적으로 제 2 플래그의 IP 단계 이후에 회수되지 제어 AP에서, 그것은 : F의 경우, Cdk9와 공동 용리 : 유사하게,도 3D는 CycT1 것으로 나타났다. 모두 서쪽 오 점 및 실버 얼룩은 TAP 프로토콜은 purificatio 효율적으로 일 확인 N, 격리 및 관심있는 단백질 복합체의 특성.
그림 1 : TAP 정화 전략의 개요. TAP의 단계를 설명하는 간단한 방식. 어느 STREP 또는 FLAG 에피토프 태그 관심의 단백질을 코딩하는 플라스미드 공동 형질 전환 된 포유 동물 세포에 있습니다. 48 시간 유도 후에, 세포를 수거하고, 용해된다. 다른 단백질과 함께 관심의 단백질을 함유하고있는 수용성 세포 용 해물은 STREP AP에 대한 연쇄상 구균 구슬에로드됩니다. 하나는 연쇄상 구균 태그를 포함하거나 구슬에 부착 된 STREP 태그가 단백질에 결합하는 단백질은 용출된다. 국기 구슬 다음 연쇄상 구균 용출에 추가되었습니다. 하나는 FLAG 태그를 포함하거나 구슬에 부착 된 FLAG-태그 단백질에 결합하는 단백질은 용출된다. 용리는 지시 된 방법에 의해 분석 될 수있다.TTP : //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : TAP 전략의 도식 표현. TAP의 상세한 프로토콜. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : TAP 정화의 단계별 분석의 예. (A) TAP의 웨스턴 블롯 분석 (CycT1 : S 및 경우, Cdk9 : F). (B) 상호 TAP의 웨스턴 블롯 분석 (경우, Cdk9 : S 및 CycT1 : F). 이리저리전체 세포 용 해물, 5 μL (0.2 %)의 m 1 ml를 같이로드 "STREP AP 입력." 나머지 전체 세포 용 해물의 975 μL은 연쇄상 구균 STREP AP에 대한 구슬과 "STREP AP 용출"100 ㎕ 수집에 추가되었습니다. 이로부터 5 μL (2 %)로드이었다. 은 "STREP AP 용출"80 μL는 FLAG 플래그는 IP에 대한 구슬과 "FLAG IP 용출"30 μL 수집에 추가되었습니다. "FLAG IP 용출"의 30 μL에서 7 μL (23.3 %)을로드했습니다. (C) TAP의 실버 얼룩 분석 (CycT1 : S 및 경우, Cdk9 : F)를. (: S 및 CycT1 : 경우, Cdk9 F) 상호 TAP의 (D) 실버 얼룩 분석. "STREP AP 용출"및 "FLAG IP 용출"7 μL (23.3 %)의 5 μL (2 %)을 장착 하였다. 별표는 공동 용출 불순물을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단백질 | 잔류 | 벡터 | 꼬리표 | 복제 사이트 | 참고 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA 벡터 / 4TO | STREP | HindIII로 -를 EcoRI | 맥나마라는 등. 2013 년 10 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA 벡터 / 4TO | 깃발 | HindIII로 -를 EcoRI | 이 문서 |
| 경우, Cdk9 | 1-372 | pcDNA 벡터 / 4TO | STREP | HindIII로 - XhoI에 | 이 문서 |
| 경우, Cdk9 | 1-372 | pcDNA 벡터 / 4TO | FLAG | HindIII로 - XhoI에 | 맥나마라 외. 2013 년 (10) |
| GFP | 1-238 | pcDNA 벡터 / 4TO | STREP-FLAG | 을 BamHI - XhoI에 | 이 문서 |
표 1 :이 연구에서 사용 된 플라스미드. CycT1 및 경우, Cdk9은 pcDNA 벡터 / 4TO-STREP 및 pcDNA 벡터 / 4TO-FLAG 플라스미드 벡터로 결찰 하였다. 이러한 구조는 DH5α 유능한 세포로 형질 전환 및 LB-암피실린 판에 도금했다. 식민지는, 선택 성장 및 스크린 하였다. 성공적 결찰 클론 생거 시퀀싱 및 제한 분해 및 아가 로스 겔 전기 이동의 조합에 의해 확인 하였다. 대신 전체 길이 (1-726) 풍부한 지난 18 잔류 물은 해충 시퀀스를 포함하기 때문에 (펩타이드 서열 - CycT1 위해 우리는 짧은 버전 (708 일)을 사용단백질 분해 (20)의 신호 펩티드로서 작용 프롤린, 글루탐산, 세린, 및 트레오닌). 경우, Cdk9는 전체 길이였다. 다음과 같이 직렬 연쇄상 구균 태그의 순서는 다음과 같습니다 GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. 다음과 같이 직렬 FLAG 태그의 순서는 다음과 같습니다 GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.
표 2 : 문제 해결 표. 문제 해결을 시작하기 전에 두 번 검사는 각 필수 단계는 다음되었음을 확인합니다. 이 프로토콜의 특정 단계는 예상 된 결과를 달성하기 위해 다른 사람보다 더 최적화가 필요합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
발현 및 진핵 세포에서 단백질 복합체의 분리를 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 분자 어셈블리의 생화학 적 특성에 한정되지 않고, 그 기능을 조절할 수있는 신규 인터랙 번역 후 변형의 식별에 이용 될 수있다. 친 화성 태그의 활용은이 프로토콜에서 언급 한 내용에 제한되지 않는다; 그러나 우리의 경험은 제 AP 단계로 STREP을 사용하여 상당히 최종 단백질 - 단백질 복합체의 수율을 향상하는 것이 제안한다. 모두와 연쇄상 구균 구슬에서 바인딩 및 용출 단계 (예를 들면, FLAG) 다른 에피토프 태그에 비해 매우 효율적입니다. 또한, 이론적으로, TAP는 버퍼 조건 (모두 과도 안정적인 발현 시스템) 실험 당 접시 수 등뿐만 아니라 약간의 최적화와 다른 단백질 또는 도메인에 적용될 수는 TAP 방법도있을 수있다 응용 t다른 세포주 O를 특정 단백질 복합체는 그 기능 또는 고유 요인과의 상호 작용을위한 특별한 시스템이 필요합니다. 문제 해결을 용이하게하기 위해, 매우 입력 및 FT 샘플 모두 (표 2)에 저장하는 것이 좋습니다. 예상 된 단백질 밴드를 용출 시각화 할 수없는 경우, FT 샘플을 실험을 해결하고 샘플을 결합 및 / 또는 비드 오프 용출했는지 여부를 판정하는데 사용될 수있다.
성공적인 TAP는 단백질 발현 및 복구의 높은 수준에 엄격하게 의존한다. 따라서, 연구자들은 경우에 따라 출발 물질의 양을 최적화 할 것이다. 일시적 형질 감염은 단백질 성분을 표현하기 위해 사용되는 경우, 형질 전환 효율은 TAP의 두 번째 단계를 진행하기 전에 적어도 70 %이어야한다. (에피토프 두 베이트간에 교환 된) 왕복 TAP 방식은 통상적으로 한 실험 전략을 결정하는데 도움최고의 순도와 수율을 달성하는 데 사용되어야한다. 또,이 경우에 따라 조사해야 할 것이다. 중요한 것은, 상호 TAP을 수행하는 것은 또한 PPI 사용 친 화성 태그의 독립적 인 확인합니다.
제시된 TAP 방법의 일부 측면은 여기에 제한이 있습니다. 예를 들어, 플래그 - 및 STREP - 태그 단백질을 과발현은 ectopically 발현 된 단백질 자체 또는 인터랙에 대한 아티팩트를 생성 할 수있다. 상이한 에피토프 태그 단백질 발현, 단백질의 입체 구조, 및 / 또는 세포 내 위치 파악에 영향을 미칠 수있다. 세포주 및 트랜 스펙 션 효율을 제한 외에, 착체의 크기가 문제가 될 수있는 정제한다. 이것은 TAP 방식은 다중 - 서브 유니트 단백질 복합체에 대해 잘 작동한다. 우리의 경험에서, 네 개의 구성 요소를 실버 염색으로 검출 할 수있다 (데이터는 보이지 않음). 이 태그가 구성 요소를 사용하는 경우에는, 다른 인터랙 공동 정제 동일한 화학 양 론적 수준에서되지 않을 수 있습니다. 따라서,특정 목표를 위해, 복잡한 구성 요소의 발현 수준이 낮은 유도 세포주의 사용이 권장된다. 또 다른 한계는 PPI의 힘이 될 것이다. 상호 작용이 충분히 안정하지 않는 경우, 어떤 성분이 (특히, 마지막에 IP FLAG 단계에서) 정제 단계 동안 손실 될 수있다.
탭 방법은 전술 한 몇 가지 에피토프 태그, 테스트 검증 및 6을 비교 하였다. 그러나이 문서에 나와있는 TAP 방법은 소설과 프로톤 펌프 억제제, 복잡한 어셈블리를 공부하고, 단백질 네트워크 구성과 기능을 추론 할 수있는, 쉽고 효율적으로, 강력한 대체 전략을 제공합니다. 이전 TAP 방법과 비교하여,이 STREP-FLAG의 TAP 전략은 복잡한 구성, 활동, 또는 함수의 사전 지식없이 더 특성화 단지의 급속한 정제 할 수 있습니다; 단백질 용출 프로테아제 절단 (예, TEV)의 필요없이 (WH무형 문화 유산은 크게) 단백질 수율을 감소시킬 수있다. 때문에 증가 된 단백질 복합체 복구 중, STREP-FLAG의 TAP 방법은 탠덤 질량 분석 분석 (10), (15)을 통해 세포에 대한 관심의 단백질 복합체과 연관 단백질의 강력한 식별 할 수 있습니다. 이어서, 다른 방법은, 공 초점 현미경, 크기 배제 크로마토 그래피, 및 CO-IP 분석처럼 또한 프로톤 펌프 억제제를 확인하기 위해 이용 될 수있다. 마지막으로, 우리는 TAP 프로토콜의 다른 버전은 정화 대단히 RNA 생물학 분야 연구를 도울 것이다 이산 단백질 RNA 복합체의 조립체를 연구하기에 적합 할 수 있다고 제안한다.
요약하면, 우리는 정화 포유류 세포주에서 프로톤 펌프 억제제를 특성화하는 방법을 제시한다. 우리는이 방법은 미래의 특성화 및 많은 새로운 단백질 복합체의 기능 분석을위한 토대를 마련 것을 제안한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
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