Abstract
La purificación de activo proteína-proteína y complejos de proteína-ácido nucleico es crucial para la caracterización de las actividades enzimáticas y de novo identificación de nuevas subunidades y modificaciones post-traduccionales. sistemas bacterianos permiten la expresión y purificación de una amplia variedad de polipéptidos individuales y complejos de proteínas. Sin embargo, este sistema no permite la purificación de subunidades de proteínas que contienen modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, la fosforilación y la acetilación), y la identificación de nuevas subunidades reguladoras que sólo están presentes / expresadas en el sistema eucariota. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de una novela, robusto y eficiente método de purificación por afinidad en tándem (TAP) usando estreptomicina y proteínas bandera de etiquetado que facilita la purificación de complejos de proteínas con proteínas de forma transitoria o estable expresado etiquetadas con epítopo de las células eucariotas. Este protocolo se puede aplicar a caracterizar protein funcionalidad compleja, para descubrir las modificaciones posteriores a la traducción en subunidades complejos, e identificar nuevos componentes complejos de regulación mediante espectrometría de masas. En particular, este método TAP se puede aplicar para estudiar complejos de proteínas formadas por componentes eucariotas o patógenos (virales y bacterianas), produciendo de este modo una amplia gama de oportunidades experimentales aguas abajo. Proponemos que los investigadores que trabajan con complejos de proteínas podrían utilizar este enfoque de muchas maneras diferentes.
Introduction
Interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la regulación precisa de los procesos biológicos 1, y más estudios sobre estos IBP puede informar acerca de su función 2. Varios enfoques se han ideado para el estudio y caracterización de los IBP, así como para la identificación de novo de nuevos componentes de la proteína de regulación. En 1989, Stanley Fields y sus colegas informaron de la levadura de dos híbridos (Y2H) de ensayo 3. Este enfoque permite la identificación imparcial y exhaustiva de interactores (presas) para una proteína de interés definida (cebo) en Saccharomyces cerevisiae. Además de su notable utilidad para el descubrimiento de los IBP, el ensayo Y2H se puede utilizar para la caracterización de pares de proteínas en células de levadura, la definición de dominios que interactúan mínimas, y la identificación de mutaciones que suprimen tales interacciones. Modificando el ensayo Y2H, IBP también puede estudiarse en células de mamíferoclass = "xref"> 4. Las variaciones del ensayo de Y2H (por ejemplo, sistema de levadura de tres híbridos) también se pueden aplicar para estudiar la proteína-ARN y las interacciones ligando orgánico de proteínas pequeñas en las células.
Otra herramienta usada comúnmente para estudiar los IBP en un sistema homólogo es la co-inmunoprecipitación (co-IP) de ensayo 5. Mediante el uso de un anticuerpo para inmunoprecipitar una proteína de interés, el ensayo de co-IP permite a los investigadores monitorizar los IBP en las células para diferentes condiciones ambientales y situaciones experimentales. El uso de proteínas etiquetadas con epítopo (por ejemplo, FLAG, Myc, STREP, y HA, entre otros) en la purificación por afinidad (AP) métodos ha facilitado el aislamiento de proteínas a partir de mezclas complejas de proteínas de varios ensayos de aguas abajo, incluyendo transferencia de Western, tinción de plata , y análisis enzimático. Sin embargo, ninguno de estos enfoques anteriores permiten el aislamiento de grandes cantidades de complejos de proteínas para una caracterización adicional incluyendo in vitro unassays, descubrimiento de subunidades reguladoras por espectrometría de masas, y la identificación de las modificaciones post-traduccionales. Una versión mejorada del método de AP se llama Tandem AP (TAP), que es una técnica de purificación para el estudio de los IBP mediante la creación de una proteína de fusión con dos epítopos que se purifica a través de dos puntos de acceso posteriores 6, 7. En este artículo, se presenta una variación del método de TAP complejos de proteínas de purificación en el que dos subunidades etiquetados con diferentes epítopos y después se purificó a través de dos puntos de acceso secuencial (STREP AP seguido de FLAG IP). En primer lugar, proporcionar una visión minimalista de TAP (Figura 1) y, a continuación una descripción detallada de todos los pasos experimentales (Figura 2), por lo que los investigadores puedan aplicarlas a su complejo de proteína de interés.
Para demostrar la aplicabilidad del método TAP, elegimos un bien caracterizado ciclina-CDK complejo (denominado PTEFB quinasa), que se compone de la ciclina T1 subunidad reguladora (CycT1) y una quinasa (CDK9), y está implicado en la regulación de la transcripción por la ARN polimerasa II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila el dominio C-terminal de Pol II y sus asociados factores de elongación negativos, lo que alivia la pausa de la transcripción en el promotor y de ese modo facilita la elongación de la transcripción 11, 12, 13. Con esta interacción conocida en mente, Strep-etiquetados CycT1 y CDK9 marcado con FLAG fueron sobreexpresado en células HEK293T. Un experimento recíproco TAP se realizó con CDK9 Strep-etiquetados y la bandera de etiquetado CycT1 para validar además que la interacción de proteínas es independiente de los epítopos utilizados. Las células se recogieron y se lisaron 48 h después de la transfección. El lisado soluble se purificó por TAP (STREP AP seguido por FLAGIP). Entrada y proteínas purificadas se analizaron por Western blot y tinción de plata (Figura 3).
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Protocol
1. Las células Plating
- Un día antes de la transfección, la placa de 3,5 x 10 6 células HEK293T en 10 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml de solución madre) por placa de 100 mm. Plate 3 - 5 100 mm platos por experimento / condición para asegurar una recuperación suficiente proteína.
NOTA: El número de placas tiene que ser determinada para cada experimento / condición, que se basará en los niveles de expresión y la solubilidad del complejo de proteína de interés. Alternativamente, si se necesita la purificación a gran escala, las líneas celulares pueden ser adaptadas para crecer en suspensión en matraces de agitación 2, pero este método no funcionará para transfecciones transitorias.
2. Inducir la transfección de células o líneas celulares estables
- Al día siguiente, comprobar las células bajo el microscopio. Las células deben ser de 70 - 80% de confluencia antes de proceeding.
- Transfectar las células con una mezcla total de 7 g de ADN plásmido y 21 l de reactivo de transfección por plato 100 mm. Células transfectar con un vector que expresa GFP (Tabla 1) como control para la eficiencia de transfección.
NOTA: Si se utiliza una línea celular estable similares HEK293-T-REx o que induce la expresión de dos o más complejos de subunidades en respuesta a la doxiciclina 14, 15, el inductor tendrá que ser añadido a las células y se incubaron durante 48 hr. Del mismo modo, una línea celular estable que induce la expresión de GFP después de la adición del inductor también se requiere para fines de validación. Continúe en el paso 2.7. - Preparar la mezcla de transfección por placa de 100 mm. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezclar 500 l de DMEM sin suplementos con 7 g de ADN de plásmido total (correspondiente a dos o más plásmidos). En un tubo de microcentrífuga separado, mezclar 500 l de DMEM sin suplementos with 21 l de reactivo de transfección. Repita este procedimiento para cada reacción de transfección.
- Pipetear la solución del reactivo de transfección en la solución de ADN del plásmido (no se mezclan soluciones en el orden inverso). Mezclar pipeteando al menos 4 veces.
- Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 a 15 min, pero no más de 15 min.
- Inclinar la placa para crear un depósito de medio y cuidadosamente pipetear la mezcla de transfección gota a gota sobre el lado interior de la placa sin perturbar las células. Devolver el plato a su posición plana original y girar suavemente para distribuir la mezcla.
- Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de cultivo de células humidificado con 5% de CO 2 (esta condición se denomina en adelante como "incubadora de cultivo de tejidos"). Reemplazar los medios de comunicación 5 horas después de la transfección (opcional).
3. La transfección de cheques o la eficiencia de inducción
- A las 24 h después de la transfección, visualizar las células bajo una gripeorescent microscopio para comprobar la eficiencia de transfección (o la inducción del control HEK293T-Rex línea celular estable que expresa GFP). Se incuba durante otras 24 horas.
4. STREP Purificación por Afinidad (STREP AP)
- Recoger las células
- A las 48 horas después de la transfección, saque la tarjeta y añadir 8 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x frío (PBS). Pipetear arriba y abajo para separar las células de la placa.
- Recoger y transferir la suspensión de células en un tubo de 15 ml y centrifugar las células hacia abajo a 800 xg durante 4 minutos a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante de PBS. Repetir el giro hacia abajo (800 xg durante 1 min a 4 ° C) para eliminar cualquier PBS residual. Almacenar el sedimento celular a -80 ° C para su uso futuro o seguir el procedimiento siguiente para continuar la purificación de proteínas.
- Lisar las células
- Volver a suspender los sedimentos celulares utilizando 5 x el volumen de sedimento celular (~ 250 l por placa) de tampón de lisis pasiva(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, 1,5 mM MgCl 2 mM, DTT 1, proteasa tableta de cóctel inhibidor, 5% v / v de glicerol, y 1,0% NP-40) y transferir la suspensión celular a una 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
- Brevemente vórtex con la suspensión y inclinar la cabeza durante 30 minutos a 4 ° C.
- Centrifugar la suspensión de células a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- La transferencia de los lisados solubles en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y desechar los sedimentos celulares. Ahorra un 10% del volumen final del lisado soluble como "Input STREP AP." Almacenar a 4 ° C.
- Equilibrar las cuentas STREP
NOTA: Los granos Uso STREP para la primera etapa AP! Complejos tira hacia abajo con los granos STREP recuperan significativamente más proteína que los derribado con perlas de bandera.- Sacar (n × 40 l) n + l de la suspensión de cuentas STREP 50% (n = número de muestras) y centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
NOTA: Use-m de anchoconsejos outhed a perlas de pipeta. - Eliminar el sobrenadante y añadir 500 l de PLB a las perlas. Inclinar la cabeza la mezcla de los granos durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
- Repita para un total de 3 lavados. Resuspender las perlas en PLB a un volumen final de n × 40 l.
- Añadir 40 l de 50% de suspensión STREP de cuentas para cada muestra de lisado celular y inclinar la cabeza durante 2 horas a 4 ° C.
- Sacar (n × 40 l) n + l de la suspensión de cuentas STREP 50% (n = número de muestras) y centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
- STREP AP
- Centrifugar la solución a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante y almacenar como "STREP AP de flujo continuo (FT)" a 4 ° C.
- Añadir 500 l de STREP AP tampón de lavado I (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, 1,5 mM MgCl 2 mM, DTT 1, 5% de glicerol y 0,2% NP-40) a las perlas. Inclinar la cabeza la mezcla de perlas durante 5 min a 4 ° C y se centrifuga a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante.
- Repita para un total de 4 lavados.
- Repita para un total de 4 lavados.
- Añadir 500 l de tampón de lavado II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, y EDTA 1 mM) y equilibrar las cuentas por inversión de los tubos. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
- Eluir la proteína de interés con 50 l de STREP Tampón de Elución (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, y destiobiotina 2,5 mM). Vortex a 800 rpm durante 15 min a 4 ° C.
- Centrifugar las perlas a 1.500 xg durante 1 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante. Esta fracción corresponde a la muestra "STREP AP elución".
- Guardar la fracción perlas a 4 ° C para una segunda elución, lo que podría producir hasta la mitad de la cantidad de proteína obtenida con la primera elución. Alícuota de 10% de la STREP AP elución para la tinción de plata y / o el Western Blot16.
- Equilibrar las cuentas BANDERA
- Sacar (nx 16 l) n + l de solución de perlas de FLAG (n = número de muestras) y centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
NOTA: Utilice consejos de boca ancha a perlas de pipeta. - Eliminar el sobrenadante y añadir 500 l de tampón de lavado FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, y 0,1% NP-40) a las perlas. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repita para un total de 3 lavados.
- Resuspender las perlas en tampón de lavado FLAG a un volumen final de 16 l nx.
- Añadir 16 l de la suspensión de la BANDERA de talón al resto de elución STREP AP y alojamiento inclinar la cabeza a 4 ° C.
- Sacar (nx 16 l) n + l de solución de perlas de FLAG (n = número de muestras) y centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
5. BANDERA IP
- Centrifugar la suspensión perlas FLAG a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. Guardar el sobrenadante y tienda como la "bandera IP de flujo continuo" (FT) a 4 ° C.
- Añadir 50081; l de tampón de lavado FLAG a la solución. Inclinar la cabeza durante 5 min a 4 ° C y se centrifuga a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repita para un total de 4 lavados y eliminar el sobrenadante después de cada lavado.
NOTA: Antes de que el cuarto lavado, transferir la solución de proteína-cuentas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para reducir el fondo. Este paso es esencial. - Eliminar el sobrenadante del centrifugado final y añadir 30 l de tampón de lavado que contiene FLAG 200 ng / l de péptido FLAG en las perlas. Vórtice a 800 rpm durante 2 horas a 4 ° C.
- Centrifugar la suspensión a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. Se recoge el sobrenadante y se almacena a 4 ° C como la "bandera IP elución."
NOTA: Las muestras de elución se pueden confirmar por tinción de plata y / o de transferencia de Western usando protocolos estándar 16, y están listos para más ensayos de proteínas. Al configurar una transferencia de western, ejecutar todas las siguientes muestras: (1) PEIF AP de entrada, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutien, (4) BANDERA IP FT, y (5) BANDERA IP elución. Los volúmenes cargados tendrán que ser determinado para cada experimento. Todas las muestras recogidas y los granos se pueden almacenar a 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo y a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Muestras TAP podrían ser analizados mediante espectrometría de masas para verificar la identidad de sus componentes, para identificar nuevos modificaciones post-traduccionales (PTMs), y / o para descubrir cualquier interacción nueva proteína con el complejo purificado 2, 17. Para este propósito, después de ejecutar una mancha de gel de Coomassie o plata, las bandas pueden ser extirpados del gel utilizando un escalpelo limpio. Varios excelentes críticas que discuten métodos de espectrometría de masas se han publicado 18, 19.
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Representative Results
En este artículo, se demuestra la aplicabilidad del método TAP para el bien caracterizado CycT1-CDK9 compleja (también conocido como P-TEFb quinasa).
Los plásmidos que codifican la ciclina T1-STREP (CycT1: S) y CDK9-FLAG (CDK9: F), o CDK9-STREP (CDK9: S) y Ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabla 1), se transfectaron en células HEK293T . Los controles negativos incluyeron transfecciones con un vector vacío y la CDK9: F o CycT1: F plásmidos (figuras 3A y B, respectivamente). Las proteínas se expresaron durante 48 horas antes de recoger las células. Múltiples placas de células se utilizaron por experimento (cinco placas por muestra se utilizaron para los datos presentados en la Figura 3) para aumentar la producción de proteínas y la recuperación. Después se lisaron las células en tubos de microcentrífuga individuales, los lisados de células de la misma muestra se combinaron en un microcentrifUGE tubo antes de añadir las perlas de Strep. La combinación de las muestras de proteína con una porción de los granos aumenta la concentración de proteína final, que puede mejorar la recuperación de proteínas a partir de proteínas que son difíciles de expresar. Tras la elución inicial, una segunda elución se puede hacer con el fin de aumentar la entrada total de proteína para el IP FLAG. Es importante guardar la entrada de cada etapa de purificación antes de añadir las perlas para la futura resolución de problemas (Tabla 2), si es necesario.
Los datos en la Figura 3A muestra los resultados del método de TAP para CycT1: S y CDK9: F, analizado por transferencia de western. CDK9: F co-eluyó con CycT1: S de las perlas por estreptococos, pero no en el control negativo AP carece CycT1: S, lo que indica que CDK9: F y CycT1: S forman un complejo proteína-proteína. Como era de esperar, no se detectaron ambas proteínas en la elución FLAG, que confirmó además la formación del complejo. Figura 3B muestra la results del método recíproco TAP, donde se intercambian las etiquetas de epítopo de las dos proteínas (CDK9: S y CycT1: F), y se analizaron por Western blot.
Figuras 3C y 3D muestran los resultados de la TAP y TAP recíproco analizado por tinción con plata, respectivamente. Figura 3C carril 2 mostró que CDK9: F co-eluyó con CycT1: S fuera de las perlas de estreptococos, pero no de la AP de control (carril 1), lo que indica que CDK9: F y CycT1: S forma un complejo proteína-proteína. En la posterior elución FLAG, como se muestra en el carril 4, CycT1: S co-eluyó con CDK9: F fuera de las perlas de bandera. Del mismo modo, la figura 3D mostró que CycT1: F co-eluyó con CDK9: S fuera de las perlas de estreptococos, pero no desde el AP control, y que el complejo proteína-proteína se recuperó de manera eficiente después de la segunda etapa FLAG IP. Tanto las transferencias Western y tinciones de plata confirmaron que el protocolo TAP funcionó de manera eficiente para el Purificatio n, el aislamiento y caracterización del complejo de proteína de interés.
Figura 1: Perspectiva de la estrategia de TAP purificación. Un esquema simple que describe los pasos de TAP. Los plásmidos que codifican la proteína de interés, ya sea con la etiqueta de epítopo FLAG estreptocócica o son co-transfectaron en células de mamíferos. Después de 48 h de inducción, se recogen y se lisan las células. lisado celular soluble que contiene la proteína de interés, junto con otras proteínas se cargan sobre perlas STREP para STREP AP. Las proteínas que contienen la etiqueta ya sea estreptocócica o se une a la proteína Strep-etiquetados unido a las perlas se eluyeron a continuación. Las perlas BANDERA A continuación se añadieron a la elución por estreptococos. Las proteínas que contienen ya sea la etiqueta FLAG o se une a la proteína marcada con FLAG unido a las perlas se eluyeron a continuación. Las eluciones se podría analizar por los métodos indicados.ttp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación esquemática de la estrategia de TAP. Un protocolo detallado de TAP. Véase el texto para más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplo de análisis paso a paso de purificación TAP. (A) Western blot de TAP (CycT1: S y CDK9: F). (B) Análisis de transferencia Western de TAP recíproca (CDK9: S y CycT1: F). froSe cargaron m 1 ml de lisado de células enteras, 5 l (0,2%) como "STREP AP de entrada". Se añadieron 975 l de lisado de células enteras restante a perlas STREP para STREP AP y 100 l de "STREP AP elución" se han recogido. De esto, 5 l (2%) fue cargado. Se añadieron 80 l de la "STREP AP elución" a perlas bandera para IP FLAG y 30 l de "BANDERA IP elución" se han recogido. A partir de los 30 l de "FLAG IP elución", se cargó 7 l (23,3%). (C) Análisis de manchas de plata de TAP (CycT1: S y CDK9: F). Análisis (D) La tinción con plata de TAP recíproca (CDK9: S y CycT1: F). Se cargaron 5 l (2%) de "STREP AP elución" y 7 l (23,3%) de "FLAG IP elución". Los asteriscos indican las impurezas eluidas-co. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Proteína | residuos | Vector | Etiqueta | sitios de clonación | Referencia |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | STREP | HindIII - EcoRI | McNamara et al. 2013 10 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | BANDERA | HindIII - EcoRI | Este artículo |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | STREP | HindIII - XhoI | Este artículo |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | FloridaAG | HindIII - XhoI | McNamara et al., 2013 10 |
| GFP | 1-238 | pcDNA / 4TO | Strep-FLAG | BamHI - XhoI | Este artículo |
Tabla 1: Los plásmidos utilizados en este estudio. CycT1 y CDK9 se ligaron en el pcDNA / 4to-estreptocócica y vectores plásmidos pcDNA / 4to-FLAG. Estas construcciones se transformaron en células competentes DH5a y se sembraron en placas de LB-ampicilina. Se seleccionaron las colonias, cultivan, y se tamiza. Con éxito clones ligados se verificaron mediante secuenciación de Sanger y la combinación de la digestión de restricción y electroforesis en gel de agarosa. Para CycT1 se utilizó una versión más corta Resultados (1 - 708) en lugar de los de larga duración Resultados (1 - 726) debido a que los últimos 18 residuos contienen una secuencia PEST (una secuencia de péptidos ricos enprolina, ácido glutámico, serina, y treonina), que actúa como un péptido señal para la degradación de proteínas 20. CDK9 fue de larga duración. La secuencia de la etiqueta tándem STREP es el siguiente: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. La secuencia de la etiqueta FLAG tándem es el siguiente: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.
Tabla 2: Tabla de solución. Antes de comenzar con la solución de problemas, verifique dos veces para asegurarse de que cada paso esencial ha sido seguido. Algunos pasos de este protocolo requieren más que otros optimización para lograr el resultado esperado. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo descrito aquí para la expresión y el aislamiento de los complejos de proteínas a partir de células eucariotas no se limita a la caracterización bioquímica de tales conjuntos moleculares, pero también puede ser utilizado para la identificación de nuevos interactores y modificaciones posteriores a la traducción que podría regular su función. La utilización de etiquetas de afinidad no se limita a lo que se menciona en este protocolo; pero nuestra experiencia sugiere que el uso de STREP como el primer paso AP mejora significativamente el rendimiento del complejo final proteína-proteína. Tanto las etapas de unión y elución desde y hacia las cuentas STREP son extremadamente eficiente en comparación con otros marcadores de epítopo (por ejemplo, FLAG). Además, en teoría, TAP se podría aplicar a otras proteínas o dominios con algunas optimizaciones menores, tales como condiciones de tampón, el número de placas por experimento (tanto para los sistemas que expresan transitoria y estable), etc. Además, el método también puede ser TAP t aplicadao si otras líneas celulares complejos de proteínas específicas requieren un sistema especial para su función o sus interacciones con factores únicos. Para facilitar la solución de problemas, es muy recomendable que las muestras de entrada y FT ambos pueden guardar (Tabla 2). Cuando las bandas de proteína esperadas no pueden ser visualizados en la elución, las muestras FT se pueden utilizar para solucionar el experimento y determinar si o no la muestra había unido a y / o se eluyó fuera de las perlas.
A TAP exitosa es estrictamente dependiente de altos niveles de expresión de la proteína y la recuperación. Por lo tanto, los investigadores tendrían que optimizar la cantidad de material de partida en una base de caso por caso. Si se utiliza la transfección transitoria de expresar componentes de la proteína, la eficacia de transfección debería ser al menos 70% antes de proceder con la segunda etapa de la TAP. El método TAP recíproca (en el que los epítopos se intercambian entre los dos cebos) generalmente ayuda en la determinación de que la estrategia experimentalse debe utilizar para lograr el mejor pureza y rendimiento. Una vez más, este tendrá que ser investigado en una base de caso por caso. Es importante destacar que la realización de TAP recíproca también confirma que el PPI es independiente de la etiqueta de afinidad utilizada.
Algunos aspectos del método TAP presentados en este documento tienen sus limitaciones. Por ejemplo, la sobreexpresión de la FLAG y las proteínas Strep-etiquetados podría generar artefactos de la proteína expresada de forma ectópica en sí o sus interactores. Diversas etiquetas de epítopos pueden afectar los niveles de expresión de proteínas, la conformación de proteínas y / o la localización subcelular. Además de la limitación de la línea celular y la eficiencia de la transfección, el tamaño de los complejos a purificar puede ser un problema. Este método funciona bien para TAP complejos de proteínas de múltiples subunidades. Desde nuestra experiencia, cuatro componentes pueden ser detectados por tinción de plata (datos no mostrados). Sin embargo, cuando el uso de componentes de dos etiquetados, los otros interactores pueden no ser co-purificado a niveles estequiométricos idénticas. Por lo tanto,para este objetivo en particular, se recomienda el uso de líneas celulares que induce niveles más bajos de expresión de los componentes complejos. Otra limitación sería la fuerza de la PPI. Si las interacciones no son lo suficientemente estables, algunos componentes podrían perderse durante las etapas de purificación (sobre todo en la etapa de IP BANDERA final).
El método TAP se ha descrito anteriormente y se pusieron a prueba varios epítopo etiquetas diferentes, validado, y se comparó 6. Sin embargo, el método de TAP presentado en este artículo es nuevo y ofrece una estrategia fácil, eficiente, robusto y alternativa para estudiar los IBP, el montaje complejo, e inferir composición de la red y función de proteínas. En comparación con los métodos anteriores TAP, esta estrategia TAP STREP-FLAG permite la rápida purificación de complejos para caracterización adicional sin previo conocimiento de la compleja composición, la actividad, o la función; y sin la necesidad de escisión de la proteasa (por ejemplo, TEV) para la elución de proteínas (which puede disminuir significativamente el rendimiento de proteína). Debido a la mayor recuperación de complejo de proteína, el método de TAP STREP-FLAG también permite la robusta identificación de proteínas que se asocian con el complejo proteína de interés en las células a través de análisis de espectrometría de masas tándem 10, 15. Posteriormente, otros métodos, como la microscopía confocal, cromatografía de exclusión por tamaño, y los ensayos de co-IP, pueden también ser utilizadas para validar los IBP. Por último, proponemos que una versión alternativa del protocolo TAP podría ser adaptado para purificar y estudiar el ensamblaje de complejos proteína-ARN discretos, que tremendamente ayudar a los investigadores en el campo de la biología del ARN.
En resumen, presentamos un método para purificar y caracterizar los IBP en líneas celulares de mamíferos. Proponemos que este método establece las bases para el futuro caracterización y análisis funcional de muchos nuevos complejos de proteínas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
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