Summary
ここでは、イルカの精子コレクション、凍結、卵子を使用して異種の体外受精パフォーマンスに正常に使用されているプロトコルを提案する.
Abstract
精子凍結保存イルカの使用する水生公園間の遺伝物質の交換が容易になります、精子を海洋哺乳類生殖の理解を深める研究所にアクセス可能になります。異種体外受精、相同の体外受精のための取り替えは、精子の受精能力のポテンシャルをテストする手段を提供できます。研究配偶子生理・初期胚の開発;貴重なイルカ卵子を得ることが困難であるの使用を避けること。ここでは、イルカの精子を凍結して正常に使用されているプロトコルを提案する.精液の採取は、訓練を受けたイルカの手動刺激によって実行されます。凍結は、グリセロールとトリス卵黄ベースのエクステンダーを使用して行われます。さらに、イルカの精子と卵子を使用して異種の体外受精について説明し、PCR を使用して作成された胚のハイブリッドな性格を検証するプロトコルを提案する.異種受精受精に疑問し、配偶子の生理学と初期胚発生を研究するツールとして使用することができます。また、異種の体外受精の成功は、イルカ精子の受精能力は、さらに検討の価値があるをテストするこの技術の可能性を示します。
Introduction
海洋哺乳類を含む野生動物の生殖補助医療技術の発達は悪い。精子受精成功を評価する機密性の高い手法の欠如は、イルカなどの種の生殖技術の遅い開発に貢献します。それまでなかった最近ハンドウイルカ (バンドウイルカ) の基本的な精液パラメーターが報告された1,2。ただし、運動性および形態などの変数は、広く使用されているが与える生殖効率に関する限定的な情報です。精子の質の最良の指標は、受精能力の評価です。
最近、私たちのグループでは、イルカ精子ゾナそのまま卵子3を使用して異種の体外受精後ハイブリッド胚形成および/または雄性前核形成を評価することによって可能性を肥やすことを評価するためにメソッドが使用されます。イルカ ウシ異種体外受精の使用相同体外受精に重要な利点は、それはイルカの卵子を得ることの難しさを克服し、十分にテストされた体外ウシ卵母細胞の成熟システムの使用が容易になります。種特異性を避けるためには、異種受精は通常 ZP の不在で行われます。それは卵黄膜と融合する精子の先体反応の能力の評価できますが、受精に関連するその他の機能の評価を損ないます。手順ゾナそのまま卵を使用し、次のパラメーターの評価を許可: 精子ゾナ バインディングと添付ファイル、浸透、多精子侵入、前核形成およびハイブリッド胚胸の谷間。
ここで、紹介イルカの精子機能の評価と同様、精液採取、基本的な精子分析、精子凍結のいくつかのプロトコル異種体外受精後男性の前核および/またはハイブリッド胚の形成を評価することによってソナをそのまま使用して卵子。
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Protocol
倫理の声明: すべての実験プロシージャが審査し、承認機関動物ケアとセルバンテス ナシオナル ・ デ ・危惧 y テクノロジー Agraria y Alimentaria (INIA) の利用委員会。再生研究のためまたは動物福祉法海棲哺乳動物のケアのために社会によって採用されているケアと実験動物の使用のためのガイドにしたがってすべての実験を行った.
1。 イルカ精液採取し凍結保存
- 準備
- 作る FERT 媒体 (ヘパリンとヒポタウリン フリー)。25 mM 重炭酸、乳酸ナトリウム 22 mM、1 mM ピルビン酸ナトリウム、6 mg/mL 脂肪酸無料 BSA 10 mg/mL のヘパリン (pH 7.4) と FERT, 培を準備します
。 注: 使用の日にこの媒体を準備し、38.5 ° C、5% の CO 2 と空気中で使用する前に少なくとも 2 時間の最大湿度雰囲気下でそれを維持します 。
- の準備のトリス卵卵黄ベースのバッファー。30.28 グラム/L のトリス、16.75 グラム/L のクエン酸、12.5 g/L 果糖や純水 0.5 g/L ストレプトマイシン溶解 (pH 7.3、浸透圧 = 310 mOsm/kg)。20% の卵の黄身 (v/v) を追加します 。
- 作る FERT 媒体 (ヘパリンとヒポタウリン フリー)。25 mM 重炭酸、乳酸ナトリウム 22 mM、1 mM ピルビン酸ナトリウム、6 mg/mL 脂肪酸無料 BSA 10 mg/mL のヘパリン (pH 7.4) と FERT, 培を準備します
- 背 recumbence 自主精液採取のためプールの端の近くで横に実績のある繁殖男性バンドウイルカを列車します
。 注: 男性のドルフィン トレーニングを 6 ヶ月以上正の強化で 4 を前述のようします 。
- 性器の溝からペニスの自主的な押し出しを引き出すためにイルカの性器の溝の頭蓋領域に優しく押すことによってさまざまな触覚刺激を実行します 。
- 達成した後完全に勃起、射精を取得する滅菌容器にペニスの先端を直接します 。
- は、分析まで 37 ° C で精子サンプルを維持します。手順 1.3 と 1.4 連続射精コレクションのたびに新しいプロピレン ガラスを使用しています 。
- コレクションの後すぐに以前 37 ° c. の評価色、pH、浸透圧 (マイクロ osmometer を使用して) 射精の暖められたガラス シリンダーを用いたボリュームを決定します 。 射精、精子の濃度を評価する
- は、蒸留水の 90 μ L を含むエッペン チューブに精子懸濁液の 10 μ L を追加します。カウント部屋精子を使って精子の濃度を決定します
。 : 評価においては, 注意射精の残りの部分の 37 ° c. - 運動パラメーターを評価します。
- 精子サンプルの 10 μ L を取るし、予め温めておいた精子チャンバー 。
- 精子運動 2 を客観的に評価するために, バンドウイルカの検証済みコンピューターによる精子分析システムを使用して運動性を評価します
。 注: 必要に応じて、精子の運動性の適切な可視化 (ヘパリンとヒポタウリン フリー) FERT 中精子サンプルを希釈します。評価においては, 加熱顕微鏡ステージ上 37 ° C でサンプルを維持します 。
- 精子サンプルの 20 μ L を取り、前述 5 生存率、精子形態を評価します 。
- 精子サンプルを遠心管に転送します。5 分の 250 x g で精子のサンプルを遠心します。後カウント チャンバーを用いた精子濃度を決定する、400 x 10 6 精子/ml 精子濃度を調整します
。 注: 必要に応じて、遠心分離 (250 × g, 10 分) によって同じ射精の過剰体積から分離された精漿と集中射精からペレットを希釈します。- 5 分にわたって、ゆっくりと希薄精子サンプル 1:1 (v/v) 1.5% グリセロールを含んでトリス卵卵黄ベースのバッファー。1 時間 30 分の 5 ° C で精子懸濁液を含むチューブ
- 実行精子懸濁液、トリスの第 2 希釈卵 3% 最終的なグリセロール濃度および 200 x 10 6 精子/mL の最終的な集中を取得するグリセロールを含む卵黄ベースのバッファーです。10 分の 5 ° C で精子懸濁液を維持
- 精子懸濁液を 0.25 mL のストローに読み込みます。ストローをヒートシールします。ラックの上で 10 分間液体窒素 4.5 cm のストロー ストローを液体窒素に突入し、評価まで保存場所 。
2。異種 体外 受精を使用してゾナそのまま卵子
- 染色の準備の 準備 ソリューションとメディアをマウントします。
- 準備ヘキスト原液 1 mL の蒸留水のヘキストの 1 mg を溶解することにより。30 μ 因数を行い、使用するまで-20 ° C で暗闇の中でそれらを保ちます。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1 g/L PVA を添加した 5 mL にヘキスト原液の 25 μ L を追加することで染色液を準備します。よく混合し、4 ° C で暗闇の中で使用されるまで維持します 。
- 準備 6.25 mL グリセリンとヘキスト原液の 6.25 μ L 6.25 mL の PBS を混合することによってメディアをマウントします。よく混合し、4 ° C で暗闇の中で使用されるまで維持します 。
- 卵コレクションと 体外 受精のためのメディアの準備します。
- 0.9 %nacl 蒸留水にゲンタマイシンの 0.5 mL を追加して食塩を準備します 。
- は、TCM 199 10 mL に 10 ng/mL 上皮成長因子 (EGF) と 10% 牛胎児血清 (FCS) を追加することによって在庫成熟培地を準備します。38.5 ° c、5% の CO 2 と空気中で使用する前に少なくとも 2 時間の最大湿度雰囲気下でメディアの両方を維持します 。
- 染色の準備の 準備 ソリューションとメディアをマウントします。
- 33-35 ° C で食塩の屠殺場で卵巣を収集し、コレクションから 4 時間以内に検査室にそれらを転送します 。
- 一度卵巣 3 回を洗う所で残骸を削除し、以前 37 に温めた生理食塩水ソリューションを使用して血 ° C 卵巣で維持 37 ° C で食塩プロセス中にします 。
- 吸引 2 〜 8 ミリメートルの包 18 g 針、10 mL の注射器。50 mL チューブに吸気の卵胞液を収集します 。
- は、セル底まで 37 ° C で約 15 分のスタンドに卵子を含む卵胞液を許可します。パスツール ピペット管の上澄みを除去し、PBS でペレットを再停止します 。
- 顕微鏡下で 90 mm 料理卵丘卵子複合体 (Coc) を回復します 。
- PBS で、成熟中 COCs を 3 回洗浄します 。
- 形態通常 Coc に転送 4 よく料理もウェルあたり 50 COCs のグループで、成熟中の 500 mL を含む各
。 注: ここでは、3 つの井戸 – 異種体外受精、相同の体外受精は、1 つのコントロールのみを含んでいるよくよく成熟単為発生コントロールとして Coc – 使用された 。 - 5% CO 2 と最大湿度と空気雰囲気下での 38.5 ° C で 24 時間の Coc をインキュベートします 。
- 媒体と密度勾配の準備します。
- 受精メディア (フェール) の準備、25 mM 重炭酸、乳酸ナトリウム 22 mM、1 mM ピルビン酸ナトリウム、6 mg/mL 脂肪酸無料 BSA 10 mg/mL のヘパリンと FERT, 媒体を補完する
- 。38.5 ° c、5% の CO 2 と空気中で使用する前に少なくとも 2 時間の最大湿度雰囲気下で維持します 。
- は、密度勾配媒体 15 mL チューブに、15 mL チューブへの解決策を洗浄の 3 mL の 1 mL を追加することによって、密度勾配を準備します。少なくとも 1 h. のための 38.5 ° C でそれらを維持
- 洗濯 体外 成熟 FERT 中 2 回卵 。
- は、それぞれよくフェールの 250 mL の 50 COCs を含むに 4 よく料理に、卵母細胞に転送します。受精する精子を準備中に 5% CO 2 と最大湿度と空気雰囲気下での 38.5 ° C で 4 よく料理を維持します 。
- 解凍 50 37 ° C の水浴中でイルカの精子を含む冷凍稲藁米
注: 相同体外受精用精液は相同ウシ体外受精の標準的なプロトコルに従う並行処理必要があります 。
- の精子を取る 10 μ L サンプル カウント部屋に予め温めておいた精子に配置.精子の運動性を客観的に評価するために、種の検証済みコンピューターによる精子分析システムを使用して運動性を評価します。この時間の間に維持 38.5 で精子サンプル ° C
- は、精子サンプルを密度勾配管 (ステップ 2.10.2) に追加します。250 x g. で 10 分間遠心
- は、パスツール ピペットを使用して上清を慎重に取り外します。ペレットを含む管に洗浄溶液 3 mL を追加します。軽く混ぜてペレットを再中断します 。
- 250 x g に 5 分間遠心する精子量 300 μ L をパスツール ピペットで上澄みを削除します 。
- 95 μ L の蒸留水を含む遠心機に精子懸濁液の追加 5 μ L。38.5 精子懸濁液を維持 ° C. 塗りつぶしセルのカウントは、1:20 の 10 μ L で商工会議所精子希釈と測定濃度。2 x 10 6 精子/mL を取得する精子の 100 μ L に追加する必要があります FERT 媒体の量を計算します 。
- 15 mL チューブに計算される FERT と精子のボリュームを追加し、そっとパスツール ピペットを使用してミックスします 。
- 、最終濃度が 1 × 10 6 精子/mL の成熟卵子と FERT 媒体を含んでいる 4 よく料理の各ウェルに精子 FERT 懸濁液の追加 250 μ L.
- 共同 38.5 ° c、5% CO 2 と最大湿度と空気雰囲気下で 18 h の配偶子をインキュベートします 。
- は、5% の FCS を添加した合成卵管液に培養液を準備します。鉱物油の 3 mL で覆われている 35 mm 料理における合成卵管液の培養液滴の 25 μ L を準備します。38.5 ° c、5% の CO 2 と空気中で使用する前に少なくとも 2 時間の最大湿度雰囲気下で維持します 。
- 2.5 h 投稿共同培養皿から 20 卵母細胞を削除; 同じ条件下でインキュベーターで残りの卵子を維持します。
- 精力的にピペッティング ナローボア パスツール ピペットで卵子の半分を 10 回で緩く接続されている精子を削除します 。
- ヘキスト染色溶液中 15 分間の 50 μ L に卵 30 分洗浄 5 分 PBS で卵母細胞を転送のための 0.5% グルタルアルデヒドの 50 μ L に 20 卵を修正し 5 分のための PBS の卵母細胞の洗浄
- はスライドごと 10 卵子の割合でメディアをマウント 2 μ L 水滴に個別に卵子を転送します。優しく、coverslip でカバーし、マニキュアでシールします 。
- Epifluorescent 光学 40 倍の倍率で 361 nm 励起フィルターと位相差顕微鏡によるウシ体外に接続されている精子の数をカウントします 。
- 共同培養 12 時間後 4 も料理から 10 受精卵を削除; 同じ条件下でインキュベーターで残りの推定受精卵を維持します。
- 転送、10 推定受精 15 mL 遠心チューブ含む 2 mL PBS と渦 2 分静かに卵丘細胞を除去します。洗浄 2 回 PBS、修正プログラム、および汚れ、前述 (ステップ 2.23.2) 。
- 18、20、22、および共同のインキュベーションの 24 h は 10 を削除後 4 よく料理や渦から受精卵修正と前述 (一歩 2.23.2)、それらを染色します。同じ条件下でインキュベーターで受精卵の残りの部分を保持します。
- ヘキスト染色前核形成と同種および異種の両方の体外受精グループの位相コントラスト/epifluorescent 顕微鏡下で多精子侵入を評価します 。
- は、サンプルあたりの 10 のランダムに選ばれた推定ハイブリッド受精卵前核形成を評価します。共焦点レーザー顕微鏡を用いた 488 nm アルゴン レーザー励起で、515 に 530 nm 検出前核形成を確認します 。
- は光学的に受精卵を順番にセクション (2 mm) し、イメージング ソフトウェアを使用して画像を収集します。3 D 解析ソフトウェア パッケージを使って視覚化します 。
- 共同培養 24 時間後洗う 50 受精卵 4 回 PBS と 2 回培 。
- 培以前の準備し、平衡の微小油滴中に 25 のグループでそれらを転送します 。
- 5%/5% O 2 の雰囲気下で 38.5 ° C で維持する CO 2 と最大湿度の空気中です 。
- 後 26 と共培養の 28 h 料理と渦、修正から 10 受精卵を削除し、それらを染色、前述 (ステップ 2.23.2).
- 文化の 48 時間後、実体顕微鏡下で胸の谷間を観察 。
- 5 mg/mL のプロテアーゼ溶液に胚を転送することによって透明帯 (ZP) を削除します 。 個別に PBS でそれぞれの胚 3 回を洗う
- 。スナップ-凍結に 0.2 mL マイクロ遠心チューブ用の液体窒素で。解析まで-80 ° C で保存します 。
3。PCR
- 材料および試薬
注: 試薬、材料、および PCR のプロトコルを実行するための装置材料のテーブルの詳細については、PCR チューブ ラックとマイクロ ピペット (P2、P20、P200、P1000) のセットを取り込む 1.5 mL遠心チューブ、PCR チューブ キャップ、サーマルサイクラー、UV 照明、agarose のゲルとバッファー (Tris ホウ酸 EDTA (TBE))。- は軽く氷の上すべての試薬を解凍します。実験を通して氷でそれらを維持します。弱まりを使用 (dNTPs; dATP dCTP、dTTP と dGTP)、ドルフィン 18 S リボソーム蛋白質 (DQ404537.1); の参照遺伝子符号化のプライマーをターゲットR1: TTGGACACACCCACGGTGCGG と F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA)、DNA ポリメラーゼ、DNA ポリメラーゼ、DNA テンプレート、滅菌水、塩化マグネシウム (MgCl 2 5.0 mM の最終的な集中) の 5 X バッファーします 。
- Agarose のゲルとサンプルの準備。
- 準備イルカとウシ精子 DNA サンプル。
- 50 の雪解け 37 ° C で水のお風呂にそれぞれの種の冷凍わら s. は、ソリューションの洗浄の 3 mL を加えます。250 x g で 10 分間遠心上清を削除します。STES 換散バッファー (50 mM pH 8; 20 mM の NaCl; トリス-HCl と 1 mM 0.1 %sds) の 30 μ L を追加プロティナーゼ K の 2 μ L (20 mg/mL)、およびジチオトレイトール (DTT); の 5 μ L最終濃度: 150 mM。超純水の 55 ° c. を追加 200 μ L で一晩を維持します。250 x g で 5 分間遠心上清をしてください。分光光度計を用いた DNA 濃度を測定します 。
- 超純水 PCR 条件ことができることを確認するイルカ精子 (すなわち 40、4、および 0.4 ng/mL) から DNA のシリアル希薄を実行イルカ DNA の少量を検出します 。
- ウシ精子 DNA (すなわち 4,000、400、40、および 4 ng/mL) 超純水 PCR 条件が牛の DNA の少量を検出できることを確認するためのシリアル希薄を実行します 。
- は、イルカとウシ胚を準備します。氷の上の胚を解凍します。100 μ g/mL プロティナーゼ K の 8 μ L を追加し、55 ° C で一晩を維持96 ° c で 5 分間サンプルを配置、反応を停止する
- 2% の agarose のゲル TBE バッファーを準備し、標準的な手法を用いた核酸染色の 20 μ L を追加します 。
- 準備イルカとウシ精子 DNA サンプル。
- PCR の準備。
- ラベル PCR 尿管: イルカ シリアル希薄 (40、4、および 0.4 ng/mL)、牛のシリアル希薄 (4,000、400、40、および 4 ng/mL) 相同性ウシ 2 細胞胚、2 セル推定異種胚、ネガティブ コントロール 。
- 反応あたり 25 μ L の最終巻に滅菌 1.5 mL 遠心チューブにマスターの混合物を準備します。
- (10 mM) 1.5 の dNTPs の 0.5 μ L 5 X DNA ポリメラーゼ フレキシ バッファーの追加 5 μ μ L MgCl 2 (25 mM)、前方および逆プライマー (10 μ M)、1.5 μ L の DNA のテンプレート (精子) または 8 μ L の DNA のテンプレート (2 細胞期胚) の 0.5 μ L の、0.07 μ Taq ポリメラーゼと滅菌蒸留水 25 μ L 最終巻まで。よく混ぜる 。
- 増幅プロトコル
- 、サーマルサイクラーにチューブを置きます。次のプログラムを選択: 94 ° C、3 分。40 サイクル 94 ° C の 15 s、59 ° C、25 s、20 の 72 ° C s;5 分の 72 ° c のプログラムを起動します 。
- は、2% の agarose のゲルの井戸に混合物の 4 ° C および負荷 15 μ L で各 PCR の製品にローディングバッファーの 4 ° c. の追加 2.5 μ L でチューブを格納します。PCR のフラグメントの正確なサイズの推定に DNA ラダー マーカーを使用します 。
- DNA の移行を許可するように 15 分間実行を電気泳動。UV イルミネーターを使用してバンドを視覚化します 。
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Representative Results
すべての結果、テーブルとここで紹介する数字 (1 と 2) は、許可3で再現されました。
イルカ精子凍結融解後高運動性があります。
イルカの凍結・融解後の射精は、84.5 ± 5.3 合計運動と 69.1 ± 5.1 進歩的な運動精子の割合 (% ± SD) を示した。運動面ではこれらの数字は高品質凍結保存精子の代表です。
イルカの精子は地中ソーナそのままウシ卵母細胞の生産の雑種胚が可能です。
図 1 aと表 1表示するイルカ精子 2.5 h 共培養の後にウシの ZP に接続します。イルカの精子 (表 1と図 1 b ) 牛の精子よりも高い割合で接続されていた。確かに、蛍光顕微鏡は、イルカの精子が前核形成と (図 1Eおよび表 1) 胸の谷間につながるゾナそのままウシ精子 (図 1) を貫通することができることを示しています。これは、共焦点顕微鏡 (図 1および図 1 f) によって確認されました。多精子侵入が認められなかった異種の体外受精グループから卵母細胞の共培養 (表 1) の 12 時間後。異種の体外受精における前核形成は共同培養 (表 1) の 18 h で発生した相同のグループでより長い時間 24 h の最も高いパーセントを達した。培養後 48 h で胸の谷間率低かった、異種の相同の体外受精 (表 1)。自発的な単為率 8.0% 成熟未受精卵子 48 h (表 1) で観察されました。
PCR の結果がリボソームの 18 S のためエンコード イルカ参照の遺伝子の存在を評価することによってイルカ ハイブリッド胚 (図 3) の遺伝物質の存在を確認する最後に、タンパク質 (図 2)。
図 1: イルカ精子がウシの透明帯 (ZP) に接続します。接続されているイルカ (A) と 2.5 h ゾナそのままウシ卵母細胞の共培養の後にウシの (B) 精子。配偶子はヘキスト染色され、位相差顕微鏡 (40 倍) で可視化しました。ウシ卵母細胞 (CとD) と (E) ウシ卵母細胞の細胞質 decondensing イルカ精子頭部の periviteline スペースでイルカの精子。画像は共焦点顕微鏡下で捕獲された、推定の受精卵 (ヘキスト染色; 40 倍の倍率) の赤道面に対応します。イルカ精子ゾナそのまま卵子 (ヘキスト染色; 40 X 倍率との共培養で構成される異種の体外受精の 24 h 後位相差顕微鏡下で観察された 2 つの前核 (F)スケール バー = 25 μ m)。図は、許可を得て参考3から再現しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表的な電気泳動 (2% の agarose のゲル エチジウム ブロマイド染色) 18 S イルカ遺伝子の PCR 増幅の結果を表示します。30 レーン 1 表示推定イルカ/ウシ雑種胚;S1 と S2 のレーン機能 4 ng/mL と 0.4 ng/mL イルカ精子 DNA、それぞれ;C5 に車線 C1 2 細胞胚と H2O (水) (空白のコントロール)。矢印の 190-bp のバンドが増幅 18 S に対応する rDNA。図は、許可を得て参考3から再現しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ハイブリッド胚の代表的なイメージです。48 時間 (ヘキスト染色; 40 倍) で 2 細胞ハイブリッド胚 (A) の代表的なイメージ。無染色ハイブリッド胚部 (B) 実体顕微鏡下で可視化のさまざまな段階で、48 時間で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: 添付ファイル、多精子侵入、前核形成および胸の谷間同種および異種の共同培養ウシまたはイルカの精子と卵子をそれぞれ次の率。変数は、ANOVA (クラスカル-ウォリス ・ マン-ホイットニー テスト) で分析しました。値は、12 複製; の平均 ± SEM (範囲) として表されます。n = 卵子や受精卵検査の合計数。表は、権限を持つ参照3から再現しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
多くの異なった哺乳類種類の凍結・融解後の精子を使用するさまざまな利点があります。貴重な遺伝物質、世界的な流通の可能性、汚染、低リスク、雄性配偶子を何十年も維持するために機能を転送する機能が含まれます。この種は CITES Appendix 2、トランスポートおよび別の水生公園の間の動物の交換を制限の下で保護されているために、バンドウイルカが、凍結保存精子の使用が欠かせません。イルカ輸送の物流の問題と危険なリスクを作成する活動であります。しかし、それらを運ぶを控える結果、動物の捕獲下人口に血族を導入するリスクなどがあります。1 つのソリューションは、精子の凍結保存は。何人かの著者が, 凍結保存イルカ精子5,7,8,9, と非常に有望な結果。また、2005 年に最初の凍結保存精子を用いた人工授精によって考案イルカ子牛誕生報告10。これはいくつかの年後、セックス ソート精子11を使用しています。
イルカの精子がされて凍結保存する一般的な方法は、プログラム可能な冷凍庫5などの高度な方法から、さまざまなテクニックを使用してドライアイス12または液体窒素の蒸気2,9など 13。ドライアイスまたは液体窒素の蒸気を使用しての主な利点は、非常に特殊な機器を使用せずの精子を抽出する同じ場所で凍結保存する可能性です。液体窒素の蒸気でポリスチレンにストローで凍結精子はシンプル、迅速、かつ安価な方法13です。イルカのこの方法論が使用されている場合実際には、精子の運動性 65% であった。しかし、それは標準化された方法を確立することがどれほど難しいかを考慮することが重要だ: 技術は可能性があります温度、湿度、ポリスチレン サイズなどの外部要因の影響を受けます。そのため、更なる研究が最適化し、液体窒素の蒸気による凍結精子を使用しての成功を改善するためにプロシージャを標準化する必要。
凍結プロトコルを最適化するためには、精子の機能評価のための信頼性の高い方法を開発することが重要です。体外受精は、精子の受精の可能性をテストする良い手段です。理想的には、イルカの卵子体外受精に使用するが、女性から卵子を取得するために必要な困難で手間のかかる手順を表す重要な制約。したがって、異種体外受精を使用する可能性は、イルカの施肥効率をテストする新しい手段を開きます。他の種から卵母細胞は、異種イルカ体外受精に使用できます。異種体外受精卵子とイルカの精子の間に行えることを示した.冷凍と解凍のイルカの精子は、ゾナそのまま牛卵母細胞に浸透し、ハイブリッド胚を生成できます。
収集するためのプロトコルの組み合わせは提示、凍結融解し卵子と異種の IVF を実行する正常に実証されているし、凍結の最適化との評価のための最初のステップを表しますイルカの精子。これらの手順がまだ多くの未知数があることに注意してくださいすることが重要です。しかし、イルカの精液を凍結保存する能力はアクセス可能になります、研究所に保管することができます。これは科学的研究を促進、生理学, 組成および精子の動作の理解につながることができます。
異種体外受精で精子の評価が簡単に凍結プロトコルの最適化が、テストし、男性不妊治療の効率化のためにも、将来に使用される可能性があります。1 つの重要な考慮事項は、実際受精数と異種の体外受精値の関係です。さらと目新しさはこれらの 2 系統遠い種、ウシ、イルカと異種の体外受精のため新しい生物学的仮説を構築できます。完全に、これらのプロトコルは、イルカや他の海棲哺乳類の再生の研究のための新しいスペースを開きます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
経済競争力 (AGL2015-70140-R + Rizos に)、a. グティエレス アダンと j. f. ペレス Gutiérrez に AGL2015 66145R とセネカ ムルシア財団 (グラント 20040/生殖/16 f. ガルシア ・ バスケスに) スペイン語省によって資金が供給された彼の作品
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FERT-TALP medium | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 | |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H | |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| Taq polymerase | Promega | ||
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | ||
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | ||
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | ||
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | ||
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | ||
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | ||
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software | |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | ||
| Microcentrifuge tubes | VWR | ||
| UV iluminator | Bio-Rad | ||
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
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