Summary
نقدم هنا، البروتوكولات التي استخدمت بنجاح لجمع المني الدلفين ونعد مغايرة أداء التلقيح الاصطناعي باستخدام بويضات الأبقار.
Abstract
استخدام المني دولفين cryopreserved يسهل تبادل المواد الجينية بين الحدائق المائية ويجعل المني الوصول إلى مختبرات للدراسات زيادة فهمنا لاستنساخ الثدييات البحرية. مغايرة التلقيح الاصطناعي، بديلاً للتلقيح الاصطناعي مثلى، يمكن أن توفر وسيلة لاختبار خصوبة الحيوانات المنوية المحتملة؛ لدراسة علم وظائف الأعضاء مشيج والتنمية الجنين في وقت مبكر؛ وتجنب استخدام بويضات دولفين القيمة، التي يصعب الحصول عليها. نقدم هنا، البروتوكولات التي استخدمت بنجاح لجمع وكريوبريسيرفي المني الدلفين. يتم جمع السائل المنوي بالتحفيز اليدوي على الدلافين المدربة. يتم إنجاز تجميد استخدام تريس صفار بيض على أساس موسع مع الجلسرين. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم من بروتوكول التي تصف مغايرة التلقيح الاصطناعي باستخدام المني الدلفين وبويضات الأبقار وأن يتحقق من طبيعة هجينة من الأجنة الناتجة باستخدام PCR. يثير تساؤلات حول التسميد التسميد مغايرة ويمكن استخدامها كأداة لدراسة فسيولوجيا مشيج والتنمية الجنين في وقت مبكر. وبالإضافة إلى ذلك، يوضح نجاح التلقيح الاصطناعي مغايرة إمكانات هذا الأسلوب لاختبار دولفين الحيوانات المنوية إخصاب القدرة، التي تستحق مزيدا من الدراسة.
Introduction
تقنيات مساعدة الإنجاب هي متطورة في الحيوانات البرية، بما في ذلك الثدييات البحرية. عدم وجود أساليب حساسة لتقييم نجاح صنع الأسمدة الحيوانات المنوية يساهم في بطء تطور تقنيات الإنجاب في الأنواع مثل الدلفين. لم يكن حتى وقت قريب أن البارامترات الأساسية المنوي من قاروري (Tursiops truncatus) تم الإبلاغ عن1،2. ومع ذلك، متغيرات مثل حركية ومورفولوجيا، على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع، تعطي معلومات محدودة عن الكفاءة التناسلية. أفضل مؤشر لنوعية الحيوانات المنوية هو تقييم إمكانية صنع الأسمدة.
في الآونة الأخيرة، استخدمت مجموعتنا طريقة لتقييم دولفين الحيوانات المنوية إخصاب المحتملة بتقييم تكوين pronuclear الذكور و/أو تشكيل الجنين المختلطة بعد التلقيح الاصطناعي مغايرة استخدام زونا بويضات الأبقار سليمة3. مزايا هامة أكثر من التلقيح الاصطناعي مثلى، كما أنها تتغلب على صعوبة الحصول على بويضات دولفين استخدام البقر دولفين مغايرة التلقيح الاصطناعي ويسهل استخدام المجربة في المختبر البويضيه البقري نضوج نظم. تفاديا لخصوصية الأنواع، يتم التسميد مغايرة عموما في غياب ZP. على الرغم من أنه يسمح لتقييم قدرة المني acrosome-ورد أن تلتحم مع الغشاء فيتيلين، أنه يعوق تقييم الميزات الأخرى المتصلة بالتخصيب. الإجراء المذكور يستخدم زونا بويضات سليمة ويسمح بتقييم المعلمات التالية: الحيوانات المنوية زونا والملزمة ومرفق، الاختراق، بوليسبيرمي، وتشكيل برونوكليار، الانقسام هجين والجنين.
هنا، نحن نقدم عدة بروتوكولات لجمع الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية الأساسية، وتجميد المني، فضلا عن تقييم وظائف الحيوانات المنوية دولفين بتقييم الذكور برونوكلير و/أو الهجين تكوين الجنين بعد التلقيح الاصطناعي مغايرة استخدام زونا سليمة بويضات الأبقار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: جميع الإجراءات التجريبية التي تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة ذ المعهد الوطني لبحوث التكنولوجيا الزراعي y اليمنتيريا (المعهد). جميع التجارب التي أجريت وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، كما اعتمدها المجتمع "دراسة الاستنساخ"، وقانون رعاية الحيوان للعناية بالثدييات البحرية-
1. جمع الحيوانات المنوية الدلفين ونعد
- "فير تجعل" من إعداد متوسطة (الهيبارين وهيبوتوريني خالية). تعد المتوسطة فير-طالب تستكمل مع بيكربونات 25 مم، لاكتات الصوديوم 22 ملم، بيروفات صوديوم 1 مم، 6-مغ/مل خال من الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة، والهيبارين 10 ملغ/مل (درجة الحموضة 7.4).
ملاحظة: تعد هذه الوسيلة في يوم الاستخدام وإبقائه في 38.5 درجة مئوية، وتحت جو من أول أكسيد الكربون 5% 2، وفي الهواء مع الرطوبة القصوى على الأقل 2 ح قبل الاستخدام. - "تريس إعداد" المخزن القائم على صفار البيض. حل ستربتوميسين 0.5 غرام/لتر في الماء عالي النقاوة وسكر 12.5 غ/لتر، 30.28 غرام/لتر تريس وحمض الستريك 16.75 غرام/لتر (7.3 درجة الحموضة، osmolality = موسم 310/كغ). إضافة صفار البيض 20% (v/v)-
- "فير تجعل" من إعداد متوسطة (الهيبارين وهيبوتوريني خالية). تعد المتوسطة فير-طالب تستكمل مع بيكربونات 25 مم، لاكتات الصوديوم 22 ملم، بيروفات صوديوم 1 مم، 6-مغ/مل خال من الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة، والهيبارين 10 ملغ/مل (درجة الحموضة 7.4).
- تدريب ثبت تربية ذكور قاروري تكمن في ريكومبينسي الظهرية قرب حافة حمام السباحة لجمع التبرعات من السائل المنوي.
ملاحظة: شركة دولفين للطاقة الذكور ينبغي تدريب ما يزيد على 6 أشهر بالتعزيز الإيجابي، كما هو موضح سابقا 4- - أداء مختلف التحفيز عن طريق اللمس بالضغط بلطف على منطقة الجمجمة من groove الأعضاء التناسلية من شركة دولفين للطاقة للحصول على التبرعات قذف القضيب من groove الأعضاء التناسلية للإناث-
- بعد التوصل انتصاب كامل، المباشر تلميح القضيب في حاوية معقمة الحصول السائل المنوي.
- الحفاظ على عينة الحيوانات المنوية في 37 درجة مئوية حتى التحليل. كرر الخطوات من 1.3 و 1.4 لمجموعات متتالية من السائل المنوي، استخدام زجاج البروبيلين جديدة كل مرة.
- فورا بعد جمع وتحديد وحدة التخزين باستخدام زجاج تخرج اسطوانة استعد مسبقاً إلى 37 درجة تقييم جيم اللون ودرجة الحموضة والاسموليه (باستخدام الصغرى-أوسموميتير) السائل المنوي. إضافة
- لتقييم تركيز المني في السائل المنوي، 10 ميليلتر لتعليق الحيوانات المنوية إلى أنبوب ايبندورف تحتوي على 90 ميليلتر من الماء المقطر. تحديد تركيز الحيوانات المنوية باستخدام الحيوانات المنوية عد الدائرة.
ملاحظة: أثناء التقييم، الحفاظ على ما تبقى من السائل المنوي في 37 درجة مئوية. - تقييم المعلمات حركية.
- 10 ميكروليتر من عينة الحيوانات المنوية ووضعه في غرفة دافئة قبل الحيوانات المنوية.
- تقييم حركية استخدام نظام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب، سبق التصديق عليه من قاروري، لتقييم موضوعي في حركية الحيوانات المنوية 2-
ملاحظة: إذا لزم الأمر، تمييع عينة الحيوانات المنوية مع المتوسطة فير (الهيبارين وهيبوتاوريني--الحرة) للتصور الكافي من عدد الحيوانات المنوية الحركة. أثناء التقييم، الحفاظ على العينة في 37 درجة مئوية في مرحلة ساخنة مجهر.
- اتخاذ 20 ميكروليتر من عينة الحيوانات المنوية وتقييم مورفولوجية الحيوانات المنوية على البقاء وكما هو موضح سابقا 5-
- نقل عينة الحيوانات المنوية في أنبوب الطرد مركزي. الطرد المركزي عينة الحيوانات المنوية في 250 g x لمدة 5 دقائق. بعد تحديد تركيز الحيوانات المنوية باستخدام دائرة عد الأصوات، وضبط تركيز الحيوانات المنوية إلى 400 × 10 6 المني مليلتر.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، تمييع بيليه من الدفقات مركزة مع البلازما المنوية معزولة من وحدة تخزين فائض من السائل المنوي نفسه بالطرد المركزي (250 x ز، 10 دقيقة).- خلال 5 دقائق، ببطء تمييع الحيوانات المنوية عينة 1:1 (v/v) مع عازلة على أساس صفار بيض تريس المحتوية على الجلسرين 1.5%. ضع الأنبوبة التي تحتوي على تعليق الحيوانات المنوية في 5 درجة مئوية ل 1 ح 30 دقيقة
- إجراء إضعاف ثاني لتعليق الحيوانات المنوية مع تريس البيض المخزن المؤقت المستند إلى صفار البيض الذي يحتوي على الجلسرين للحصول على تركيز والغليسيرول نهائي 3% وتركيز نهائي 200 × 10 6 الحيوانات المنوية/مل. الإبقاء على تعليق الحيوانات المنوية في 5 درجة مئوية للحد الأدنى 10
- تحميل تعليق الحيوانات المنوية إلى 0.25 مل القش. هيتسيل القش. مكان القش في رف 4.5 سم فوق النتروجين السائل للحد الأدنى 10 يغرق القش في النيتروجين السائل وتخزين حتى التقييم.
2. مغايرة "في المختبر التسميد باستخدام زونا سليمة البقري بويضات"
حل- إعداد
- تحضير تلطيخ والمتوسطة المتصاعدة.
- الحل "هويشت إعداد" المخزون بإذابة 1 مغ هويشت في 1 مل ماء المقطر. جعل 30 ميليلتر مختبرين والاحتفاظ بها في الظلام في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. إعداد الحل المصبوغة بإضافة 25 ميليلتر من هويشت الأسهم الحل إلى 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتستكمل مع 1 غرام/لتر بولي. يخلط جيدا وتبقى في الظلام في 4 درجات مئوية حتى استخدام.
- تحضير المتوسطة المتصاعدة بخلط مل 6.25 من برنامج تلفزيوني مع مل 6.25 من الجلسرين وميليلتر 6.25 هويشت الأسهم الحل. يخلط جيدا وتبقى في الظلام في 4 درجات مئوية حتى استخدام.
- تعد الوسيلة لاخصاب البويضات جمع و في المختبر.
- إعداد المحلول الملحي بإضافة 0.5 مل من الجنتامايسين إلى الماء المقطر كلوريد الصوديوم 0.9%.
- إعداد متوسطة النضج الأسهم بإضافة 10 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة (مماثلة) و 10% مصل العجل الجنين (FCS) إلى 10 مل من الطب الصيني التقليدي-199. الحفاظ على كل وسائل الإعلام في 38.5 درجة مئوية، تحت جو من أول أكسيد الكربون 5% 2، وفي الهواء مع الرطوبة القصوى على الأقل 2 ح قبل الاستخدام.
- تحضير تلطيخ والمتوسطة المتصاعدة.
- جمع المبايض في المسلخ في المحلول الملحي في 33-35 درجة مئوية ونقلها إلى مختبر داخل ح 4 من مجموعة-
- مرة واحدة في المختبر، يغسل المبايض ثلاث مرات إزالة الأنقاض والدم باستخدام المحلول الملحي استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية. الاحتفاظ المبايض في المحلول الملحي في 37 درجة مئوية خلال العملية- إبرة
- أسبيراتي 2 إلى 8 مم المسام مع 18 جرام وحقنه 10 مل. جمع سائل جرابي يستنشق في أنابيب 50 مل.
- السماح جرابي السوائل المحتوية على بويضات الوقوف لمدة 15 دقيقة تقريبا في 37 درجة مئوية، حتى الرواسب الخلايا. إعادة وقف بيليه في برنامج تلفزيوني وإزالة المادة طافية الأنبوب مع ماصة باستور.
- استرداد مجمعات البويضيه cumulus (COCs) في الأطباق 90 ملم تحت ستيريوميكروسكوبي.
- يغسل COCs ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ومرة في المتوسط النضج.
- نقل COCs شكلياً العادي للاطباق 4-جيدا، وكذلك يتضمن 500 مل متوسطة النضج، في مجموعات من 50 COCs الواحدة وكذلك كل.
ملاحظة: هنا، ثلاثة آبار – بئر واحدة مغايرة التلقيح الاصطناعي وعنصر تحكم واحد جيد للتلقيح الاصطناعي مثلى جيدا يتضمن فقط نضجت COCs كعنصر تحكم بارثينوجينيتيك – واستخدمت- - احتضان COCs عن 24 ساعة عند 38.5 درجة مئوية، تحت جو من 5% CO 2 وفي الهواء مع الرطوبة القصوى.
- إعداد المتوسطة والتدرج الكثافة.
- لإعداد التسميد المتوسطة (فير)، الملحق فير-طالب المتوسطة مع بيكربونات 25 مم، لاكتات الصوديوم 22 ملم، بيروفات صوديوم 1 مم، 6 ملغ/مل خال من الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة، والهيبارين 10 ملغ/مل. الحفاظ على 38.5 درجة مئوية، وتحت جو من أول أكسيد الكربون 5% 2، وفي الهواء مع الرطوبة القصوى على الأقل 2 ح قبل الاستخدام.
- إعداد التدرج كثافة بإضافة 1 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار إلى أنبوب 15 مل و 3 مل من الغسيل الحل إلى أنبوب 15 مل. المحافظة عليها عند 38.5 درجة مئوية على الأقل 1 h.
- المياه والصرف الصحي في المختبر نضجت بويضات مرتين في المتوسط فير-
- نقل بويضات للاطباق 4-جيدا، ويتضمن كذلك COCs 50 في 250 مل من فير كل. المحافظة على الأطباق 4-جيدا في 38.5 درجة مئوية، وتحت جو من أول أكسيد الكربون 5% 2، وفي الهواء مع الرطوبة القصوى أثناء إعداد الحيوانات المنوية للاخصاب.
- ذوبان الجليد القش مجمدة التي تحتوي على المني الدلفين في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 50 س.
ملاحظة: يجب معالجة الأبقار السائل المنوي للتلقيح الاصطناعي مثلى في موازاة ذلك، يتبع البروتوكول القياسي للتلقيح الاصطناعي البقري مثلى.
عينة - تأخذ 10 ميليلتر للحيوانات المنوية ووضعه في الحيوانات المنوية تحسنت قبل عد الدائرة. تقييم حركية استخدام نظام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب، قبل التحقق من صحة للأنواع، إلى تقييم موضوعي عدد الحيوانات المنوية على الحركة. وخلال هذا الوقت، المحافظة على عينة الحيوانات المنوية في 38.5 درجة مئوية. إضافة
- عينة الحيوانات المنوية إلى أنبوب الكثافة المتدرجة (الخطوة 2.10.2). أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 250 غ. س
- بعناية إزالة المادة طافية باستخدام ماصة باستور. إضافة مل 3 من محلول الغسيل إلى الأنبوب الذي يحتوي على بيليه. إعادة تعليق بيليه بالاختلاط بلطف.
- الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 x زاي إزالة المادة طافية مع ماصة باستور إلى وحدة تخزين الحيوانات المنوية من 300 ميليلتر.
- ميليلتر 5 إضافة تعليق الحيوانات المنوية ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على 95 ميليلتر من الماء المقطر. الإبقاء على تعليق الحيوانات المنوية في 38.5 ° التعبئة جيم عد الخلايا الدائرة مع 10 ميليلتر من 01:20 إضعاف الحيوانات المنوية وقياس التركيز. حساب كمية متوسطة فير التي يجب أن تضاف إلى 100 ميليلتر من الحيوانات المنوية للحصول على 2 × 10 6 المني مليلتر.
- إضافة وحدة التخزين فير والحيوانات المنوية المحسوبة لأنبوب 15 مل ومزيج بلطف باستخدام ماصة باستور.
- ميليلتر 250 إضافة تعليق الحيوانات المنوية-فير لكل بئر من الطبق 4-كذلك يتضمن المتوسطة فير مع بويضات نضجت للحصول على تركيز 1 × 10 6 المني/mL نهائي.
- اشتركت احتضان الأمشاج ح 18 في 38.5 درجة مئوية، تحت جو من أول أكسيد الكربون 5% 2، وفي الهواء مع الرطوبة القصوى. إعداد
- المتوسطة ثقافة تستند إلى السائل أوفيدوكتال الاصطناعية وتستكمل مع 5 ٪ السفح. إعداد 25 ميليلتر من قطرات الثقافة السوائل أوفيدوكتال الاصطناعية في الأطباق 35 ملم مغطاة 3 مل الزيوت المعدنية. الحفاظ على 38.5 درجة مئوية، وتحت جو من أول أكسيد الكربون 5% 2، وفي الهواء مع الرطوبة القصوى على الأقل 2 ح قبل الاستخدام.
- في ح 2.5 وظيفة الحضانة المشتركة، إزالة بويضات 20 من الطبق؛ والحفاظ على بويضات المتبقية في الحاضنة تحت نفس الظروف-
- إزالة المني المرفقة فضفاضة بقوة بيبيتينج من بويضات من خلال ماصة باستور ضيقة-تتحمل نصف 10 مرات.
- إصلاح بويضات 20 في 50 ميليلتر من glutaraldehyde 0.5% عن 30 دقيقة أغسل نقل بويضات في برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 5 بويضات إلى 50-ميليلتر حل هويشت المصبوغة لمدة 15 دقيقة ويغسل بويضات في برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 5
- نقل بويضات حدة إلى 2 قطرات ميليلتر من تصاعد في المتوسط بمعدل 10 بويضات كل شريحة. تغطية مع ساترة بلطف وختم مع طلاء الأظافر.
- إحصاء عدد المني يعلق على بويضات الأبقار باستخدام مجهر تباين مرحلة مزودة ببصريات ابيفلوريسسينت وعامل تصفية إثارة نانومتر 361 في التكبير 40 x-
- بعد 12 ساعة حضانة المشتركة، إزالة zygotes الظني 10 من الأطباق 4-جيدا؛ والحفاظ على زيجوتيس الظني المتبقية في الحاضنة تحت نفس الظروف-
- نقل 10 zygotes مفترض للطرد مركزي 15 مل أنبوب يحتوي على 2 مل من برنامج تلفزيوني ودوامه برفق لمدة 2 دقيقة لإزالة الخلايا الركام. تغسل مرتين في برنامج تلفزيوني، والإصلاح، ووصمة عار، كما تم وصفه سابقا (الخطوة 2.23.2.)
- بعد 18، 20 و 22، و 24 ساعة من الحضانة المشتركة، بإزالة 10 zygotes الظني من الأطباق 4-جيدا ودوامه، إصلاح، ووصمة عار لهم كما تم وصفه سابقا (الخطوة 2.23.2). الإبقاء على بقية zygotes مفترض في الحاضنة تحت نفس الظروف-
- تقييم تكوين برونوكلير وبوليسبيرمي تحت مجهر المرحلة-التباين/ابيفلوريسسينت في مجموعات التلقيح الاصطناعي مثلى ومغايرة تلطيخ مع هويشت.
- تقييم تكوين برونوكلير في 10 zygotes الهجين الظني الذي تم اختياره عشوائياً كل عينة. تأكيد تشكيل pronuclear تحت [كنفوكل] ليزر المسح مجهر في الإثارة ليزر الأرجون 488 نانومتر وكشف 515 إلى 530 نانومتر.
- بصريا الفرع zygotes الظني تسلسلياً (2 مم) وجمع الصور باستخدام برامج تصوير. تصور استخدام حزمة برامج تحليل ثلاثي الأبعاد-
- بعد 24 ساعة حضانة المشتركة، تغسل zygotes الظني 50 أربع مرات في برنامج تلفزيوني ومرتين في المتوسط الثقافة-
- نقلها في مجموعات من 25 إلى ميكرودروبليتس للثقافة المتوسطة سبق إعدادها واكويليبراتيد-
- المحافظة على عند 38.5 درجة مئوية تحت جو من 5% O 2/5% CO 2 وفي الهواء مع الرطوبة القصوى.
- بعد 26 و 28 ح الحضانة المشتركة، إزالة zygotes الظني 10 من الأطباق ودوامه، والإصلاح، ووصمة عار لهم (الخطوة 2.23.2)، كما تم وصفه سابقا-
- بعد 48 ساعة ثقافة، التقيد الانقسام وتحت ستيريوميكروسكوبي.
- إزالة zona pellucida (ZP) عن طريق نقل الأجنة إلى التوصل إلى حل في حوزتي 5 ملغ/مل. أغسل
- منفردة كل الجنين ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. الأداة الإضافية-تجميد لهم في نيتروجين سائل في أنابيب ميكروسينتريفوجي 0.2 مل. تخزينها في-80 درجة مئوية حتى التحليل.
3. بكر
- المواد والكواشف
ملاحظة: الكواشف والمواد، والمعدات المستخدمة لتنفيذ البروتوكول PCR مفصلة في "الجدول للمواد" وتشمل رف أنبوب بكر ومجموعة من ميكروبيبيتيس (P2، P20، P200، P1000)، 1.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي وأنابيب PCR وقبعات، cycler حرارية، وإضاءة الأشعة فوق البنفسجية، [اغروس] هلام والمخزن المؤقت (بورات تريس يدتا (TBE)).- بلطف ذوبان جميع الكواشف على الجليد. المحافظة عليها في الجليد في جميع أنحاء هذه التجربة. استخدام deoxynucleotides (دنتبس؛ داتب، دكتب، دتتب ودجتب)، تستهدف الإشعال في ترميز الجينات مرجع الدلفين 18 S ريبوسومال البروتين (DQ404537.1)؛ R1: تجاكاكاكككاكجتجكج و F2: كاجاجاكجتجاجاتجا)، دنا بوليميريز، 5 X العازلة بوليميريز الحمض النووي الحمض النووي القالب والمياه المعقمة، وكلوريد المغنيسيوم (MgCl 2 بتركيز نهائي من 5.0 ملم)- إعداد
- [اغروس] هلام وعينه.
عينات
- تحضير الدلفين والبقر الحيوانات المنوية الحمض النووي.
س.
- ذوبان القش مجمدة من كل الأنواع في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 50 أضف 3 مل من الغسيل الحل. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز للحد الأدنى 10 إزالة المادة طافية. إضافة 30 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل المؤسسات التجارية الحكومية (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 8؛ 20 مم كلوريد الصوديوم؛ والحزب الديمقراطي الصربي 0.1% 1 ملم)، 2 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل)، و 5 ميليلتر من ديثيوثريتول (DTT)؛ التركيز النهائي: 150 مم. الحفاظ على بين عشية وضحاها في 55 ° جيم إضافة 200 ميليلتر من الماء عالي النقاوة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز 5 كحد أدنى لإبقاء المادة طافية. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
- إجراء تخفيف المسلسل من الحمض النووي من الدلفين المني (أي 40, 4 و 0.4 نانوغرام/مل) مع الماء عالي النقاوة للتأكد من أن شروط PCR قادرة على الكشف عن كمية صغيرة من الدلفين الحمض النووي-
- القيام بتخفيف المسلسل البقر الحيوانات المنوية الحمض النووي (أي 4,000 و 400، 40 و 4 نانوغرام/مليلتر) مع الماء عالي النقاوة للتأكد من أن شروط PCR قادرة على اكتشاف كمية صغيرة من الحمض النووي البقري.
- إعداد أجنة الدولفين والأبقار. ذوبان الجليد الأجنة على الجليد. إضافة 8 ميليلتر من 100 ميكروغرام/مل بروتيناز ك والاحتفاظ بها بين عشية وضحاها في 55 درجة مئوية. للتوقف عن رد فعل، وضع العينات في 96 درجة مئوية للحد الأدنى 5
- إعداد 2% [اغروس] هلام TBE العازلة وإضافة 20 ميليلتر من وصمة الحمض النووي باستخدام التقنيات القياسية.
- تحضير الدلفين والبقر الحيوانات المنوية الحمض النووي.
س.
- إعداد PCR.
- Tube(s) "بكر التسمية": تخفيف المسلسل الدلفين (0.4 40 و 4 نانوغرام/مليلتر)، تخفيف المسلسل البقري (4,000 و 400، 40 و 4 نانوغرام/مليلتر)، مثلى الجنين اثنان خلايا الأبقار واثنان خلايا الأجنة مغايرة الظني السلبية والتحكم.
- إعداد مزيج رئيسي في أنبوب عقيم 1.5 مل ميكروسينتريفوجي إلى وحدة تخزين نهائي من 25 ميليلتر في رد الفعل.
ميليلتر
- ميليلتر إضافة 5 5 "س دنا" بوليميريز المرنة المخزن المؤقت، 0.5 ميليلتر من دنتبس (10 ملم) 1.5 مجكل 2 (25 مم)، 0.5 ميليلتر للأمام وعكس التمهيدي (10 ميكرومتر)، ميليلتر 1.5 قالب الحمض النووي (الحيوانات المنوية) أو 8 ميليلتر من قالب الحمض النووي (اثنان خلايا الأجنة) ، المقطر 0.07 ميليلتر من [تق] [بولمرس]، وتعقيم المياه تصل إلى وحدة تخزين نهائي 25 ميليلتر. مزيج جيد.
- بروتوكول التضخيم
- وضع الأنابيب في cycler الحرارية. حدد البرنامج التالي: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ دورات 40 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 59 درجة مئوية ل 25 s، 72 درجة مئوية 20 s؛ و 72 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تشغيل البرنامج-
- تخزين الأنابيب في 4 ° جيم إضافة 2.5 ميليلتر لتحميل المخزن المؤقت لكل منتج PCR في ميليلتر 15 4 درجات مئوية وتحميل المخلوط في آبار 2% [اغروس] هلام. استخدم علامة سلم الحمض النووي لتقدير حجم دقيقة من شظايا PCR.
- إجراء التفريد لمدة 15 دقيقة للسماح للهجرة الحمض النووي. تصور العصابات باستخدام إضاءة الأشعة فوق البنفسجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
جميع النتائج والجداول والأرقام (1 و 2) المقدمة هنا قد تم نسخها مع إذن3.
وقد المني دولفين حركية عالية بعد التجميد والذوبان
وأظهرت الدفقات دولفين إذابة تجميد النسب المئوية (% ± SD) من مجموع 84.5 ± 5.3 متحركة والمنى متحركة التدريجي 69.1 ± 5، 1. حيث حركية، تمثل هذه الأرقام المني cryopreserved عالية الجودة.
المني دولفين قادرون على اختراق زونا سليمة بويضات الأبقار وإنتاج الأجنة الهجينة
إظهار الشكل 1A و الجدول 1 دولفين المني يعلق على ZP البقر بعد ح 2.5 الحضانة المشتركة. كانت تعلق المني دولفين بنسبة أعلى مما المني البقري (1B الشكل و الجدول 1). في الواقع، يبين مجهرية الأسفار أن المني دولفين قادرة على اختراق المني زونا الأبقار سليمة (الشكل 1)، مما يؤدي إلى تكوين برونوكلير والانقسام (الشكل 1E و الجدول 1). وهذا ما أكده مجهرية [كنفوكل] (الشكل 1 و الشكل 1-واو). لم يلاحظ أي بوليسبيرمي في بويضات من مجموعة التلقيح الصناعي مغايرة بعد 12 ساعة حضانة المشتركة (الجدول 1). تشكيل برونوكليار في التلقيح الاصطناعي مغايرة بلغت أعلى نسبة مئوية في ح 24، وقتاً أطول من المجموعة المتجانسة، التي وقعت في 18 ساعة حضانة المشتركة (الجدول 1). وكان معدل الانقسام في 48 ساعة بعد الاحتضان أقل مغايرة من التلقيح الاصطناعي المتجانسة (الجدول 1). ولوحظ معدل تنشيط تلقائي بارثينوجينيتيك 8.0% في البقري بويضات المخصبة نضجت في 48 ساعة (الجدول 1).
وأخيراً، أكدت نتائج PCR وجود دولفين المواد الوراثية في الأجنة الهجينة (الشكل 3) بتقييم وجود مورثة مرجع دولفين بترميز ل 18 ريبوسومال S البروتين (الشكل 2).
رقم 1: المني دولفين يعلق على بيلوسيدا زونا البقري (ZP). دلفين المرفقة (A) والبقر (ب) المني بعد ح 2.5 الحضانة المشتركة مع بويضات الأبقار سليمة زونا. كانت ملطخة هويشت الأمشاج وتصور تحت مجهر تباين المرحلة (40 X التكبير). المني دلفين في الفضاء بيريفيتيليني البويضيه بقرى (C و D) ورأس الحيوانات المنوية دولفين ديكوندينسينج في السيتوبلازم البويضيه البقري (E). الصور تم التقاطها تحت مجهر [كنفوكل] وتتوافق مع الطائرة الاستوائية من اقحه مفترض (تلطيخ هويشت؛ التكبير X 40). برونوكلي هما (و) لاحظ تحت مجهر تباين المرحلة بعد 24 ساعة من التلقيح الاصطناعي مغايرة تتألف من الحضانة المشتركة للمني دولفين مع بويضات الأبقار سليمة زونا (تلطيخ هويشت؛ 40 X التكبير؛ شريط المقياس = 25 ميكرومتر). الشكل المستنسخ من مرجع3 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: التفريد الممثل (2% [اغروس] هلام اثيديوم بروميد الملون) عرض نتائج PCR التضخيم للجينات دولفين دا 18- 1 الممرات لإظهار 30 الظني دولفين/الأبقار الهجين الأجنة؛ تتميز ممرات S1 و S2 4 نانوغرام/مليلتر و 0.4 نانوغرام/مليلتر دولفين الحيوانات المنوية الحمض النووي، على التوالي؛ وتتميز بالممرات C1 إلى C5 أجنة البقر اثنين-الخلية وح2س (المياه) (عنصر التحكم فارغاً). يشير السهم إلى 190-بي بي الفرقة الموافق 18 تضخيم S المتاشب. الشكل المستنسخ من مرجع3 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: صور الممثل الأجنة الهجينة. صورة الممثل جنين هجين اثنين--الخلية (A) في 48 ساعة حضانة (تلطيخ هويشت؛ التكبير X 40). الهجين أونستينيد الأجنة في 48 ساعة حضانة، في مراحل مختلفة من شعبة، تصور تحت ستيريوميكروسكوبي (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: معدلات مرفق، بوليسبيرمي، وتشكيل برونوكلير والانقسام بعد الاحتضان المشارك مثلى ومغايرة مع بويضات الأبقار والمنى البقري أو الدلفين، على التوالي. وجرى تحليل المتغيرات مع ANOVA (اختبار كروسكال-واليس ومان-ويتني). القيم التي يتم التعبير عنها ك ± يعني وزارة شؤون المرأة (نطاق) من اثني عشر replicates؛ n = مجموع عدد بويضات أو الظني zygotes درست. واستنسخ الجدول من مرجع3 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للعديد من أنواع الثدييات المختلفة، هناك مزايا متنوعة لاستخدام الحيوانات المنوية المجمدة-مذاب. وتشمل هذه القدرة على نقل المواد الجينية قيمة وإمكانات لتوزيعها في جميع أنحاء العالم وانخفاض خطر التلوث والقدرة على الحفاظ على الأمشاج الذكور على مدى عقود. استخدام الحيوانات المنوية cryopreserved ضروري قاروري، نظراً لأن هذه الأنواع تكون محمية بموجب "التذييل الثاني من يستشهد"، مما يحد من نقل وتبادل الحيوانات بين المجمعات المائية المختلفة. النقل الدلافين هو نشاط الذي يخلق مشاكل لوجستية ومخاطر خطيرة. ومع ذلك، الامتناع عن نقلهم أيضا عواقب، مثل خطر إدخال القرابة إلى عدد سكان أسيرة للحيوانات. حل واحد هو تجميد للحيوانات المنوية. بعض المؤلفين قد cryopreserved دولفين الحيوانات المنوية5،7،،من89، مع الغاية نتائج مشجعة. وعلاوة على ذلك، في عام 2005، كان ولادة أول عجل دولفين تصوره التلقيح الاصطناعي باستخدام الحيوانات المنوية cryopreserved عن10. بعد بضع سنوات، وقد تم ذلك باستخدام فرز الجنس المني11.
دولفين الحيوانات المنوية قد تم cryopreserved باستخدام تقنيات مختلفة، من أساليب متطورة، مثل تجميد لبرمجة5، للأساليب الشائعة، مثل الثلج الجاف12 أو سائل النيتروجين الأبخرة92،، 13. والميزة الرئيسية لاستخدام الثلج الجاف أو الأبخرة النتروجين السائل هو إمكانية كريوبريسيرفي في نفس المكان حيث يتم استخراج الحيوانات المنوية، دون استخدام معدات متخصصة للغاية. الحيوانات المنوية المجمدة في القش في البوليسترين في الأبخرة النتروجين السائل يتم طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة13. في الواقع، عندما تم استخدام هذه المنهجية على الدلافين، وكان عدد الحيوانات المنوية الحركة 65%. ومع ذلك، من المهم أن تنظر في مدى صعوبة إنشاء أسلوب موحد: الأسلوب الذي قد يتأثر بالعوامل الخارجية، مثل درجة الحرارة والرطوبة، وحجم البوليستيرين، إلخ. ولذلك، كذلك الدراسات اللازمة لتحسين وتوحيد الإجراءات من أجل تحسين نجاح استخدام الحيوانات المنوية المجمدة مع أسلوب بخار النتروجين السائل.
من أجل تحسين وضع بروتوكول تجميد، من المهم وضع طريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم وظيفي المني. التلقيح الصناعي وسيلة جيدة لاختبار الحيوانات المنوية المحتملة للاخصاب. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تستخدم بويضات دولفين للتلقيح الاصطناعي، ولكن الإجراءات صعبة وشاقة تحتاج إلى الحصول على بويضات من الإناث تمثل عقبة هامة. ولذلك، يفتح إمكانية استخدام التلقيح الاصطناعي مغايرة وسيلة جديدة لاختبار كفاءة التسميد في شركة دولفين للطاقة. يمكن استخدام بويضات من الأنواع الأخرى دولفين مغايرة التلقيح الاصطناعي. وتظهر النتائج أنه يمكن إجراء التلقيح الاصطناعي مغايرة بين بويضات الأبقار والمنى الدلفين. يمكن اختراق البويضيه الأبقار سليمة زونا المني دولفين المجمدة والمذابة وتوليد جنينا هجين.
قدم مجموعة من بروتوكولات لجمع، ذوبان التجميد، وأداء التلقيح الاصطناعي مغايرة مع بويضات الأبقار أثبتت بنجاح ويمثل خطوة أولية لتحسين تجميد وتقييم دولفين الحيوانات المنوية. من المهم ملاحظة أنه لا تزال هناك مجهولات كثيرة في هذه الإجراءات. ومع ذلك، القدرة على كريوبريسيرفي دولفين السائل المنوي يجعله موجوداً ويسمح لها بأن تظل في المختبرات. وهذا سيسهل الدراسات العلمية، ويمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء، وتكوين، والسلوك من المني.
تقييم الحيوانات المنوية بالتلقيح الاصطناعي مغايرة يمكن أن تخفف من الاستفادة المثلى البروتوكولات التجميد، ولكن يمكن أيضا استخدامه في المستقبل لاختبار واختيار الذكور لكفاءة الخصوبة. أحد الاعتبارات المهمة هو العلاقة بين أرقام التسميد حقيقية ومغايرة التلقيح الاصطناعي القيم. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا لحداثة مغايرة التلقيح الصناعي بين هذه النوعين فيلوجينيتيكالي البعيدة والأبقار والدلفين، يمكن أن يبني الفرضيات البيولوجية الجديدة. وإجمالا، فتح هذه البروتوكولات مساحة جديدة للبحوث المتعلقة بالاستنساخ من شركة دولفين للطاقة وغيرها من الثدييات البحرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وقد مولت عمله الإسبانية وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية (AGL2015-70140-R إلى ريزوس د)، AGL2015-66145R أن جوتيريز-عدن أ وج. ف. بيريز-غوتييريز ومؤسسة مورسيا سينيكا (20040 المنح/الجرثومية/16 إلى ف. غارسيا-فاسكيز)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FERT-TALP medium | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 | |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H | |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| Taq polymerase | Promega | ||
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | ||
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | ||
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | ||
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | ||
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | ||
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | ||
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software | |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | ||
| Microcentrifuge tubes | VWR | ||
| UV iluminator | Bio-Rad | ||
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O'brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
